陸林潔,蔡 潔,安結(jié)然,杜俊停,丁書茂 (華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430079)

甲醛(FA)是一種常見的裝修型化學(xué)性室內(nèi)空氣污染物,其毒性作用越來越受到人們的重視.包括免疫毒性,神經(jīng)毒性,生殖毒性和遺傳毒性[1-4].甲醛作為確定的人類致癌物[5-6],與其他揮發(fā)性有機(jī)化合物具有協(xié)同作用[7].鄰苯二甲酸酯(PAEs)是重要的聚氯乙烯塑料增塑劑,應(yīng)用廣泛于工業(yè).大氣,水體和土壤中均檢測(cè)到 PAEs,極易揮發(fā)到空氣中,已成為全球性污染物[8].其中鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是目前塑料工業(yè)中最主要的增塑劑之一,廣泛應(yīng)用于食品包裝材料,醫(yī)療器械和兒童玩具生產(chǎn)等方面.研究發(fā)現(xiàn),DEHP對(duì)人體的肝臟,生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)方面造成毒性作用[9-11].Pitten等[12]研究表明,甲醛暴露組在水迷宮中尋找食物時(shí)間延長,出錯(cuò)次數(shù)增加,甲醛對(duì)小鼠有神經(jīng)毒性作用.Malek等[13]發(fā)現(xiàn)暴露于甲醛蒸汽的鼠,其運(yùn)動(dòng),活動(dòng)度和探索能力均降低.低濃度的 DEHP能夠?qū)π∈蟮膶W(xué)習(xí)記憶能力造成影響[14].甲醛與其他揮發(fā)性有機(jī)物具有協(xié)同作用,如苯,二甲苯等,亦多為常見的室內(nèi)空氣污染物.然而諸多研究表明,與發(fā)達(dá)國家相比,在 PAEs暴露水平測(cè)試中,我國室內(nèi)空氣中DEHP濃度最高,是美國的3.5倍.因此DEHP作為新型的室內(nèi)空氣污染物的毒性作用不可忽視.根據(jù)DEHP與高分子聚合物之間是物理性結(jié)合,具有較強(qiáng)揮發(fā)性這一特性,并結(jié)合人類往往是暴露于綜合環(huán)境污染物中這一事實(shí),因此有必要進(jìn)行聯(lián)合毒性的毒理學(xué)檢測(cè).同時(shí)從甲醛和DEHP的暴露途徑來看,兩者進(jìn)入人體的方式基本一致.目前關(guān)于甲醛和DEHP單獨(dú)毒性作用的研究較多,而對(duì)兩者聯(lián)合染毒所致神經(jīng)毒性的研究報(bào)道較少.為了進(jìn)一步探究甲醛與DEHP毒性作用及其機(jī)制,本文開展甲醛和 DEHP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響研究,為綜合評(píng)估甲醛和DEHP的安全性提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

SPF級(jí)雄性純系昆明小鼠(8周齡左右,(22±2)g體重),購買于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.為了減少小鼠個(gè)體之間的行為差異,保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,先進(jìn)行行為功能篩選,水迷宮每天訓(xùn)練1次,訓(xùn)練3d,水溫保持在(24±2)℃,保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)者相對(duì)位置不變記錄第3d實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按照90%區(qū)間去除兩端極值,選出符合條件的昆明小鼠.飼養(yǎng)條件為12h光/暗周期的無病原體環(huán)境(溫度 20～25℃,濕度 50%～70%),小鼠飲食飲水自由.實(shí)驗(yàn)開始前,小鼠進(jìn)行至少 7d的環(huán)境適應(yīng).

表1 實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experiment groups

1.2 試劑與儀器

試劑包括甲醛(FA)原液(Sigma,4%),鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP,Sigma),硫代巴比妥酸(TBA,分析純,國藥集團(tuán)),微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成),小鼠 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(eBioscience, USA),小鼠 IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(eBioscience, USA),小鼠Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司,江蘇),小鼠 5-HT酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(eBioscience, USA).儀器包括熒光酶標(biāo)儀(FLx800).WH-2小型智能環(huán)境氣候倉(武漢宇信科技開發(fā)公司),4160-2型氣態(tài)甲醛濃度測(cè)定儀(美國Interscan公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制 將DEHP與吐溫80按照1：1助溶,并使用 0.9%的生理鹽水配成濃度為 5,50,500mg/kg的染毒液.將VE用生理鹽水配制成濃度100mg/mL,用作保護(hù)劑對(duì)照.

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組方案 分組方案見表1.研究表明,在從事化學(xué)、家具和木材生產(chǎn)的甲醛職業(yè)接觸人群中,甲醛平均濃度一般在 0.20mg/m3以上,眼和呼吸道刺激癥狀的發(fā)生率明顯增高.而動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明,0.5mg/m3甲醛對(duì)小鼠存在著直接的神經(jīng)毒性.同時(shí)根據(jù)人群調(diào)查,居住在裝修時(shí)間小于2a房屋的未成年人,成年人甲醛的日暴露量平均值分別為 2.67, 2.86mg/m3.此暴露量與大多數(shù)研究中有免疫毒性和致癌性等的劑量接近,因此本實(shí)驗(yàn)將甲醛的劑量定在0.5～3mg/m3范圍內(nèi),同時(shí)甲醛的劑量反應(yīng)關(guān)系是非線性,所以將甲醛的劑量設(shè)為0.5,1.0, 3mg/m3.DEHP主要表現(xiàn)為低劑量慢性毒性,很多國家對(duì)其最低毒副作用水平(LOAEL)進(jìn)行了研究.歐盟和美國基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定 DEHP不影響人體健康的極限值(NOAEL)為48mg/(kg·d).有報(bào)道指出每天需要通過醫(yī)療設(shè)施接觸DEHP的人群其DEHP的暴露水平是普通環(huán)境中成年人暴露量的3 個(gè)數(shù)量級(jí),通過輸血和透析,可能進(jìn)入人體的 DEHP最大攝入量為4mg/(kg·d).

因此,為了更好的評(píng)估DEHP的劑量毒性作用,將最低濃度設(shè)為 5mg/(kg·d).根據(jù)不影響人體健康的極限值 48mg/(kg·d),將中間濃度設(shè)為50mg/(kg·d).通常對(duì)鄰苯二甲酸酯的毒理學(xué)研究采用的是遠(yuǎn)高于真實(shí)環(huán)境濃度水平的暴露劑量,為遵循劑量—效應(yīng)線性關(guān)系,有效推導(dǎo)出正確的閾劑量,濃度設(shè)置成 10倍關(guān)系,最高劑量選取500mg/(kg·d).

對(duì)照組29例患者中達(dá)到顯效標(biāo)準(zhǔn)者15例，有效8例，余者6例無效，對(duì)照組臨床總有效率為79.31%；觀察組29例患者中達(dá)到顯效標(biāo)準(zhǔn)者16例，有效11例，無效2例，觀察組臨床總有效率為93.10%；觀察組臨床總有效率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

小鼠按照不同分組進(jìn)行不同方式染毒,暴露周期共計(jì) 14d. 2～4組甲醛職業(yè)暴露每天8h(5+2模式),5～7組每天經(jīng)口灌胃DEHP染毒液,聯(lián)合組同時(shí)進(jìn)行甲醛和DEHP染毒,12～14組選用高濃度染毒劑量,用于第2階段VE保護(hù)效應(yīng)的檢測(cè).染毒5d后,用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力.

1.3.3 組織勻漿制備 第 15d采用脫頸法處死小鼠,收集小鼠腦組織,置于冰上,用電子天平稱重,按 10mL/g添加 PBS(PH=7.5),采用玻璃勻漿器勻漿,制成腦組織勻漿液,然后在 4℃,10000r/min的條件下離心 10min,收集上清液置于-70℃環(huán)境中冷凍保存.

1.3.4 各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：此實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]：Morris水迷宮由水池(直徑 120cm,高 50cm,水深 30cm),平臺(tái)(直徑 9cm,高29cm),攝像頭,電腦及視頻分析系統(tǒng)構(gòu)成.實(shí)驗(yàn)過程中水溫始終保持26℃.

定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)：每次實(shí)驗(yàn)保持小鼠的先后順序,將小鼠面像池壁投入水中,并開始錄像.記錄小鼠在 60s內(nèi)從不同象限爬上平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期.連續(xù)訓(xùn)練7d,如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái),時(shí)間記錄為60s,測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)能力.

空間探索實(shí)驗(yàn)：第 9d撤去平臺(tái),將小鼠投入水迷宮,記錄其游泳路線,測(cè)定小鼠空間記憶能力.

ROS含量的測(cè)定：將勻漿液用 PBS稀釋 20倍,DCFH-DA 熒光染料稀釋 1000倍.取 100μL勻漿稀釋液于酶標(biāo)板,并加入 100μLDCFH-DA熒光染料染色,避光反應(yīng) 20min.利用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485nm和發(fā)射波長525nm下檢測(cè)吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ROS含量.

MDA含量的測(cè)定：采用硫代巴比妥酸(TBA)法,MDA 可與 TBA 縮合,形成紅色產(chǎn)物,且在532nm 處有最大吸收峰.取 100μL 勻漿液,加入400μL0.6%TBA 溶 液,沸 水 浴 15min,離 心(10000r/min,10min,4℃),取上清液 200μL于酶標(biāo)板,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)在 450,532,600nm 波長下的吸光值,按照公式 C=[6.45(OD532nm-OD600nm)-0.56OD450nm]/prot計(jì)算出MDA含量(μmol/mg prot).

GSH含量的測(cè)定：用還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒來檢測(cè)腦組織中含量,具體做法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.

腦組織 TNF-α,IL-β,Caspase-3,8-OHDG 和5-HT含量的測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)腦組織中 TNF-α,IL-β,Caspase-3,8-OHDG和5-HT含量.

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.Origin 8.1,SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)組間均值的差異,之后采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,顯著水平α定為P＜0.05.

2 結(jié)果

2.1 甲醛和DEHP染毒對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響

表2 甲醛、DEHP染毒對(duì)小鼠逃避潛伏期的影響(s)Table 2 The effect of formaldehyde and DEHP exposure on the escaping latency of mice (s)

表2結(jié)果顯示,與相應(yīng)對(duì)照組相比,甲醛1,3mg/m3和 DEHP500mg/kg及聯(lián)合組 1mg/m3+50mg/kg和3mg/m3+500mg/kg小鼠逃避潛伏期延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).與相同劑量聯(lián)合染毒組比較,中、高劑量甲醛、DEHP單獨(dú)染毒組小鼠逃避潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);添加 VE 后,FA3.0mg/m3+ VE,DEHP500mg/kg+VE,FA3.0mg/m3+DEHP500mg/kg+VE較同等濃度未添加保護(hù)劑組逃避潛伏期明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).表 3結(jié)果顯示,對(duì)照組在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間最長和游泳距離占總距離的百分比最高,0.5mg/m3FA其次,而 3.0mg/m3FA+500mg/kgDEHP所占百分比明顯減少.圖1結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠和低濃度甲醛組具有一定記憶性,游泳軌跡帶有很強(qiáng)目的性,游泳軌跡集中于 SE象限,隨著染毒劑量的升高,小鼠的游泳軌跡逐漸出現(xiàn)不規(guī)則性和無目的性,更多地表現(xiàn)為無效搜索,3.0mg/m3FA+500mg/kgDEHP組表現(xiàn)更明顯,無規(guī)則性較強(qiáng),軌跡混亂,不能有效的集中于 SE象限.而阻斷劑組較同等劑量染毒組比較游泳軌跡相對(duì)規(guī)則.

表3 甲醛、DEHP染毒小鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The space exploration results of formaldehyde and DEHP exposure in water maze

圖1 小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中的游泳軌跡Fig.1 The swimming trajectory of mice in water maze experiment

2.2 小鼠的體重變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量每組小鼠體重,見圖2.結(jié)果顯示,與A組相比,甲醛染毒組和DEHP染毒組體重均有不同程度下降.B和D組小鼠體重下降趨勢(shì)明顯(P＜0.05),而C與A組小鼠體重相比沒有顯著差異.DEHP組隨著染毒劑量的增高,體重逐漸下降,G組小鼠和對(duì)照組相比呈現(xiàn)出明顯的降低(P＜0.05).聯(lián)合染毒組中,H組小鼠體重與A組相比具有顯著性差異(P＜0.05),J組小鼠體重下降十分明顯,和 A組相比具有極顯著性(P＜0.01).而且較甲醛和DEHP同等劑量單獨(dú)染毒組,聯(lián)合組小鼠體重也相對(duì)偏低.

圖2 甲醛和DEHP單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)小鼠體重的影響Fig.2 Weight changes of mice in single and combined of formaldehyde and DEHP exposure

2.3 腦組織氧化損傷

甲醛和 DEHP暴露后小鼠腦組織中的氧化損傷如圖3所示.與 A組相比,1.0mg/m3和3.0mg/m3的甲醛,50mg/kg和500mg/kg的DEHP單獨(dú)染毒組中,ROS含量均有顯著性差異(P＜0.01);聯(lián)合染毒組中,I和J組與A組相比出現(xiàn)極顯著性升高,且較同等濃度的單獨(dú)染毒組也分別出現(xiàn)了顯著(P＜0.05)和極顯著性的升高(P＜0.01).與A組相比,中高濃度甲醛和DEHP單獨(dú)染毒組中MDA的含量有顯著性差異.C和D組濃度分別出現(xiàn)顯著性(P＜0.05)和極顯著性的升高(P＜0.01),F和G組呈極顯著性升高(P＜0.01).聯(lián)合染毒組中只有 J組較同等濃度的單獨(dú)染毒組具有極顯著性,而 I組較同等濃度染毒組則沒有顯著性.GSH含量在 C,D組分別出現(xiàn)顯著性(P＜0.05)和極顯著性的下降(P＜0.01),F和G組呈極顯著性下降(P＜0.01),聯(lián)合組中,I和J組呈極顯著性下降(P＜0.01),I組較C,F組出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),J組分別較 D,G 組出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05)和極顯著性下降(P＜0.01).

2.4 腦組織炎癥,細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

圖4顯示,甲醛和DEHP暴露后腦組織炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)的變化.由II可知,與A組相比,C和 D分別具有顯著性(P＜0.05)和極顯著性的升高(P＜0.01),DEHP組只有G組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).聯(lián)合組中 TNF-α含量上升更明顯,I組與F組相比具有極顯著性(P＜0.01),J組與D和G 組分別具有顯著性(P＜0.05)和極顯著性(P＜0.01).I,III,IV顯示,與A組相比,甲醛,DEHP和聯(lián)合組的中高濃度均出現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05).IV聯(lián)合組8-OHDG的含量在H,I,J組中較單獨(dú)染毒組均出現(xiàn)了顯著性提高(P＜0.05).由V可知,與A組相比,D組和G組具有極顯著性(P＜0.01),F組出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),聯(lián)合組均出現(xiàn)顯著下降,I和J組與同等濃度的甲醛C,D組相比分別具有顯著性(P＜0.05)和極顯著性(P＜0.01).

圖3 甲醛和DEHP單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)小鼠腦組織氧化損傷的影響Fig.3 The oxidative damage changes in single and combined of formaldehyde and DEHP exposure

圖4 甲醛和DEHP單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)小鼠腦組織炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)的影響Fig.4 The changes of inflammation, apoptosis and 5-HT in single and combined of formaldehyde and DEHP exposure

2.5 添加VE后甲醛和DEHP暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 添加VE后小鼠體重的變化Fig.5 Weight changes of mice by adding VE

2.5.1 添加VE后小鼠體重的變化 如圖5所示,添加 VE之后,小鼠體重出現(xiàn)了小幅度的增長,N組和J組相比具有顯著性(P＜0.05).

2.5.2 添加 VE后小鼠腦組織氧化損傷 添加VE之后,腦組織氧化損傷見圖6. L組小鼠腦組織中ROS水平較D組有顯著性下降(P＜0.05),N和J相比具有顯著性(P＜0.05). L和M組MDA含量出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05),N和J相比出現(xiàn)極顯著性降低(P＜0.01).L和 M 組 GSH含量出現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05),N和J相比出現(xiàn)極顯著性升高(P＜0.01).

2.5.3 添加VE后小鼠腦組織炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)的變化 添加 VE之后,腦組織炎癥,細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)的變化見圖7.其中,L和M組IL-1β含量出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),N和J相比出現(xiàn)極顯著性下降(P＜0.01).II中L組小鼠腦組織中TNF-α水平較D組有顯著性下降(P＜0.05),M組較G組和N組較J組均有顯著性(P＜0.05).另外,N和J相比caspase-3含量出現(xiàn)極顯著性降低(P＜0.01).L組小鼠腦組織中 8-OHDG水平較D組有顯著性下降(P＜0.05),N較J具有極顯著性(P＜0.01).L組小鼠腦組織中 5-HT含量較D組有顯著性升高(P＜0.05),N較J也具有顯著性(P＜0.05).

圖6 添加VE后小鼠腦組織氧化損傷的變化Fig.6 The oxidative damage changes in mice by adding VE

圖7 添加VE后小鼠腦組織炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)的變化Fig.7 The changes of inflammation, apoptosis and 5-HT in mice by adding VE

3 討論

雖然研究認(rèn)為甲醛是一種神經(jīng)紊亂因子[15],但是少有事實(shí)能夠令人信服地證實(shí)甲醛具有神經(jīng)毒性.現(xiàn)有的大多數(shù)證據(jù)都來自臨床調(diào)查和流行病學(xué)研究,但是在實(shí)際的生活環(huán)境中甲醛都是與其它的環(huán)境污染物共同作用,因此研究兩者的聯(lián)合神經(jīng)毒性效應(yīng)及其發(fā)生機(jī)制具有重要意義.本研究用 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)甲醛和 DEHP聯(lián)合染毒對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,結(jié)果顯示,在定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)中,各劑量組小鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中低濃度甲醛組逃避潛伏期的長短和空白對(duì)照組相似,甚至出現(xiàn)比空白組還短的情況,推測(cè)低濃度的甲醛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)可能有興奮作用.有研究報(bào)道,低濃度的甲醛(10μmol/L)對(duì)細(xì)胞的生長具有促進(jìn)作用,高濃度甲醛(62.5μmol/L濃度及以上)抑制細(xì)胞的生長[16].中高濃度的甲醛和DEHP染毒組小鼠逃避潛伏期相對(duì)較長,聯(lián)合組更加明顯.在空間探索實(shí)驗(yàn)中,空白對(duì)照組,在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間最長和游泳距離占總距離的百分比最高,低濃度甲醛組次之.而聯(lián)合染毒高劑量組所占百分比明顯減少,更多地表現(xiàn)為無效搜索,說明甲醛和DEHP聯(lián)合染毒對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響較單獨(dú)染毒時(shí)更為明顯.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中高濃度的甲醛和DEHP染毒可使小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,高濃度染毒組表現(xiàn)更明顯.與甲醛,DEHP單獨(dú)染毒相比,聯(lián)合染毒對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響比單獨(dú)染毒明顯.

好氧生物細(xì)胞新陳代謝會(huì)產(chǎn)生ROS,正常情況下,細(xì)胞內(nèi)的ROS會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶和一些非酶類還原性物質(zhì)清除.在非正常情況下,細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生過量的ROS,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成和清除的失衡,這種情況即氧化應(yīng)激[17].由于中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有高耗氧量,高脂含量,低抗氧化能力,所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)其他組織器官來說對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感[18].甲醛可以影響腦組織氧化/抗氧化系統(tǒng),并最終導(dǎo)致氧化損傷[19].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中高濃度的甲醛和DEHP單獨(dú)作用使腦組織中氧化損傷指標(biāo)GSH,MDA和ROS含量發(fā)生了明顯的變化,差異具有顯著性(P＜0.05),高濃度聯(lián)合染毒組具有極顯著性(P＜0.01).氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子受損,進(jìn)而引起細(xì)胞和組織受損[21-22].根據(jù)氧化應(yīng)激水平的強(qiáng)弱以及對(duì)生物體造成損傷的嚴(yán)重程度,氧化應(yīng)激可以分為多個(gè)層次[23].高水平的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng),炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)量升高,引起線粒體功能紊亂,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死,以及炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)量升高[24-25].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中高濃度的甲醛和DEHP染毒組小鼠TNF-α和IL-1β的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05),聯(lián)合組較同等劑量單獨(dú)染毒組表達(dá)量更高.實(shí)驗(yàn)中甲醛和DEHP暴露后小鼠腦組織中 Caspase-3活性出現(xiàn)了顯著上升,說明甲醛和DEHP可能激活了細(xì)胞的凋亡途徑.此外,甲醛可以間接對(duì) DNA造成損傷[26].實(shí)驗(yàn)中8-OHDG的含量在中高濃度的甲醛和DEHP染毒及聯(lián)合作用中顯著升高.大腦中氧化代謝活動(dòng)的利率高,抗氧化酶活動(dòng)低,因此,神經(jīng)元更容易受到毒性作用或中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性事件[20].而由于氧化應(yīng)激造成了神經(jīng)細(xì)胞的損傷,凋亡或壞死,可能會(huì)影響到神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的合成與釋放.本實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)遞質(zhì) 5-HT的含量隨著染毒劑量的增加及聯(lián)合作用呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),在高濃度聯(lián)合組小鼠腦組織中含量最低,這與水迷宮的行為學(xué)測(cè)試一致,進(jìn)一步說明甲醛和DEHP聯(lián)合染毒可能會(huì)對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響.同時(shí)有研究指出,DEHP可以干擾神經(jīng)系統(tǒng)兩大類細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的增殖分化過程,提示神經(jīng)遞質(zhì)含量的下降可能與此相關(guān).可以給進(jìn)一步研究神經(jīng)毒性的分子機(jī)制提供啟發(fā).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,甲醛和DEHP聯(lián)合作用對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)毒性作用更顯著,提示甲醛和DEHP具有協(xié)同作用.推測(cè)氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致形成 DNA損傷,進(jìn)而引起細(xì)胞毒性,造成細(xì)胞和組織受損,發(fā)生炎癥反應(yīng),引起細(xì)胞凋亡或壞死.因此氧化應(yīng)激可能是甲醛和 DEHP導(dǎo)致神經(jīng)毒性的機(jī)制之一.VE具有脂溶性,對(duì)氧敏感,是最主要的抗氧化劑之一,對(duì)由甲醛引起的腦組織氧化損傷有很好的修復(fù)作用[27].因此本實(shí)驗(yàn)選用 VE作為氧化應(yīng)激的阻斷劑,探究VE能否對(duì)甲醛和DEHP暴露中的小鼠腦組織進(jìn)行保護(hù)以及保護(hù)機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,添加阻斷劑之后,小鼠由于甲醛和DEHP暴露產(chǎn)生的損傷得到了有效的緩解.阻斷組小鼠與暴露組相比,表現(xiàn)出逃逸潛伏期縮短和 SE象限滯留時(shí)間延長,說明小鼠的認(rèn)知能力有了恢復(fù).同時(shí)小鼠氧化應(yīng)激水平(ROS,MDA水平下降,GSH升高),炎癥因子(TNF-α和IL-1β下降),細(xì)胞凋亡水平(Caspase-3活性下降),神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT含量升高),說明VE對(duì)腦組織損傷進(jìn)行了有效的保護(hù).

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中高濃度甲醛(1.0mg/m3和3.0mg/m3),DEHP(500mg/kg) 以及聯(lián)合組(1.0mg/m3+50mg/kg 和 3.0mg/m3+500mg/kg)可對(duì)小鼠腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性,造成小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降.高濃度甲醛(3.0mg/m3)和 DEHP(500mg/kg)可顯著性加重腦組織氧化損傷(P＜0.05),炎癥反應(yīng),細(xì)胞凋亡和神經(jīng)遞質(zhì)含量的下降下降,進(jìn)一步說明甲醛和DEHP暴露具有神經(jīng)毒性.而聯(lián)合染毒較單獨(dú)染毒作用更明顯,這說明兩者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)毒性具有協(xié)同作用.同時(shí) VE在一定程度上可以通過降低氧化應(yīng)激水平減少腦組織損傷.

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