王妮++閆唯++李佳++趙二勞

摘 要：為了研究溫度對(duì)旱柳葉中黃酮提取率及抗氧化活性的影響，試驗(yàn)采用超聲輔助提取旱柳葉中黃酮，測(cè)定了不同溫度下旱柳葉黃酮的提取率及對(duì)DPPH·和·OH的清除率。結(jié)果表明：提取溫度對(duì)旱柳葉中黃酮提取率有較大影響，不同溫度下，旱柳葉黃酮提取率的大小順序?yàn)椋?0℃>50℃>70℃>40℃>30℃。旱柳葉中黃酮的最佳提取溫度為60℃，提取率為2.51%。提取溫度對(duì)旱柳葉黃酮抗氧化活性基本無(wú)影響。

關(guān)鍵詞：旱柳葉；溫度；黃酮；提取率；抗氧化性

中圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171232002

旱柳（Salix matsudana Koidz）為楊柳科柳屬落葉喬木，在我國(guó)各地特別是北方地區(qū)充當(dāng)園林綠化和植樹(shù)造林的先鋒樹(shù)種，栽種頗多，分布廣泛，資源很是豐富。旱柳葉為旱柳樹(shù)的葉子是我國(guó)常用中藥，藥用歷史悠久?！侗静菥V目》中記載，柳為本經(jīng)下品，其性苦寒，無(wú)毒，可治風(fēng)水黃疸、瘡癰腫毒、炎熱淋疾等癥[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明[2]，旱柳葉中含有黃酮類成分，具有諸多藥理功能活性，如延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂等，在大健康時(shí)代對(duì)促進(jìn)人體健康能發(fā)揮積極作用。因此，旱柳葉中黃酮的研究應(yīng)用，日益引起人們的興趣。張晶等[3]對(duì)旱柳葉化學(xué)成分進(jìn)行了分離鑒定和藥理活性測(cè)定，從中分離出3種黃酮單體化合物，認(rèn)為這些化合物對(duì)血栓的形成和動(dòng)脈硬化有防治作用；劉暢等[4]研究認(rèn)為旱柳葉黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性；王立娟等[5]研究了旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取工藝，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定了最佳提取工藝條件。但這些研究均未涉及提取溫度對(duì)黃酮提取率和抗氧化性的影響。因此，為進(jìn)一步深入研究開(kāi)發(fā)應(yīng)用旱柳葉黃酮，提高旱柳葉的綜合應(yīng)用價(jià)值，本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取旱柳葉黃酮，研究不同溫度對(duì)黃酮提取率及抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

旱柳葉2016年10月采集于忻州師范學(xué)院主校區(qū)，自來(lái)水沖洗干凈，在恒溫干燥箱中50℃下烘干，藥材粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)40目篩，裝瓶保存待用。

1，1-二苯肼-2-苦肼基（DPPH·），（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，（北京化學(xué)試劑公司）；其余試劑都為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)帆化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為二次去離子水，由化學(xué)系實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)主要儀器

高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-400KD型）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（SP-723型）；水浴恒溫振蕩器（THZ-82型）；電子分析天平（AL204型）；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D（Ш）型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGF20022型）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 旱柳葉預(yù)處理

將粉碎過(guò)40目篩的旱柳葉粉中按1：10的比例加入石油醚脫脂24h后，抽濾，濾渣置50℃恒溫干燥箱中烘干，即為旱柳葉樣品，存放待用。

2.2 旱柳葉黃酮提取工藝流程

以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液為提取劑，在料液比、超聲功率和時(shí)間（料液比1：55、超聲功率400W、時(shí)間60min）相同的條件下，選取30℃、40℃、50℃、60℃和70℃5個(gè)不同的溫度，進(jìn)行旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取[4]。

黃酮提取工藝流程：經(jīng)預(yù)處理旱柳葉粉→超聲輔助提取→抽濾→定容→黃酮提取液。

2.3 旱柳葉黃酮提取率的測(cè)定

本試驗(yàn)以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，參考文獻(xiàn)[4]采用硝酸鋁比色法測(cè)定旱柳葉中黃酮含量，并計(jì)算黃酮提取率。

2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

參考文獻(xiàn)[4，6]方法稍作改動(dòng)制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取濃度為0.5mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分別置于6支25mL比色管中，然后都加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，充分搖勻后，每支比色管中都加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液1.0mL，再充分搖勻，再于每支比色管中都加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氫氧化鈉溶液10.0mL，最后用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液定容至25mL，搖勻后靜置反應(yīng)15min，以2次去離子水為空白對(duì)照，在510nm最大波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)分別測(cè)定其吸光度。然后，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光度值為縱坐標(biāo)，制備蘆丁吸光度（A） ～質(zhì)量濃度（c）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得回歸方程為：

A = 11.723c-0.0055，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9999。

2.3.2 旱柳葉黃酮提取率的測(cè)定

吸取不同溫度下黃酮提取液2.0mL，按2.3.1中方法測(cè)定其黃酮含量，根據(jù)公式：黃酮提取率 （%） =（提取液中黃酮質(zhì)量（mg） / 旱柳葉質(zhì)量（mg））×100，計(jì)算旱柳葉黃酮提取率。

2.4 旱柳葉中黃酮抗氧化性測(cè)定

一般采用自由基清除法評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化性，本試驗(yàn)采用DPPH·和·OH清除法來(lái)評(píng)價(jià)旱柳葉黃酮的抗氧化性。

2.4.1 旱柳葉黃酮對(duì)DPPH·的清除率

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7，8]的方法稍作改動(dòng)，進(jìn)行對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定。準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度0.20mg/mL的 DPPH·溶液3.0mL，置于10mL比色管中，再加入定量的旱柳葉黃酮提取液，然后用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液定容至10mL，搖勻，靜置于室內(nèi)避光處，待反應(yīng)30min后，在517nm最大波長(zhǎng)下，測(cè)定該溶液體系的吸光度。測(cè)得：不加旱柳葉黃酮提取液僅DPPH·溶液體系的吸光度為A0；不加DPPH·溶液僅旱柳葉黃酮提取液體系的吸光度為Aj；旱柳葉黃酮提取液+DPPH·溶液體系的吸光度為Ai。不同溫度提取的旱柳葉黃酮溶液都做3次平行試驗(yàn)，然后根據(jù)公式：清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0]×100，計(jì)算旱柳葉黃酮對(duì)DPPH·的清除率。endprint

2.4.2 旱柳葉黃酮對(duì)·OH的清除率

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8，9]方法并作一定改動(dòng)后，進(jìn)行對(duì)·OH清除率測(cè)定。準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度0.03mol/L硫酸亞鐵銨溶液1.0mL，置于10mL比色管中，再加入質(zhì)量濃度0.03mol/L水楊酸溶液1.0mL，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%過(guò)氧化氫溶液1.0mL，用2次去離子水定容至10mL，搖勻，置于40℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，取出冷卻至室溫后，用分光光度計(jì)在510nm最大波長(zhǎng)下，測(cè)得該溶液體系的吸光度為A0；測(cè)得加入一定量旱柳葉黃酮提取液后上述溶液體系的吸光度為Ai。。不同溫度提取的旱柳葉黃酮溶液都做3次平行試驗(yàn)，然后根據(jù)公式：清除率（%）= [（A0-Ai）/A0]×100，計(jì)算旱柳葉黃酮對(duì)·OH的清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 溫度對(duì)旱柳葉黃酮提取率的影響

不同溫度下旱柳葉黃酮提取率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，不同溫度下，旱柳葉中黃酮的超聲波輔助提取率不同。在不同溫度下，旱柳葉黃酮提取率的大小順序?yàn)椋?0℃>50℃>70℃>40℃>30℃，溫度60℃時(shí)旱柳葉中黃酮提取率最高，可達(dá)2.51%，為旱柳葉黃酮超聲輔助提取的最佳溫度。計(jì)算比較不同溫度時(shí)黃酮提取率的差異性，可知，60℃與70℃相比差異不顯著（P>0.05）；與50℃相比差異顯著（P<0.05）；與40℃或30℃相比差異極顯著（P<0.01）。這與陳建福等[10]研究白蘭葉中黃酮提取和羅磊等[11]研究金銀花葉黃酮提取所得結(jié)論一致。在30～70℃的試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，旱柳葉黃酮提取率呈先升高后下降，這是因?yàn)闇囟壬撸涌炝朔肿舆\(yùn)動(dòng)速率，提高了黃酮的溶解度，提取率增加。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，溫度過(guò)高影響黃酮的熱穩(wěn)定性，黃酮容易在過(guò)高的溫度下發(fā)生氧化或降解，導(dǎo)致提取率下降[10-12]。得出各種天然產(chǎn)物中黃酮類活性成分均有一最適溶出溫度，在進(jìn)行提取研究時(shí)，應(yīng)充分考慮提取溫度的選擇。

3.2 旱柳葉黃酮抗氧化活性測(cè)定

3.2.1 對(duì)DPPH·清除率

按試驗(yàn)方法，測(cè)定質(zhì)量濃度30μg/mL黃酮提取液對(duì)DPPH·清除率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮在濃度相同時(shí)、對(duì)DPPH·清除率的大小順序?yàn)椋?0℃>50℃>40℃>30℃>70℃。60℃提取的旱柳葉黃酮對(duì)DPPH·清除率最高可達(dá)83.64%。相同濃度時(shí)，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對(duì)DPPH·清除率的差異性不大，基本在同一水平。表明提取溫度對(duì)旱柳葉中提取的黃酮種類及其抗氧化活性基本無(wú)影響。

3.2.2 對(duì)·OH清除率

按試驗(yàn)方法，測(cè)定質(zhì)量濃度為100μg/mL的黃酮提取液對(duì)·OH清除率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮在濃度相同時(shí)對(duì)·OH清除率的大小順序?yàn)椋?0℃>60℃>40℃>30℃>70℃。50℃提取的旱柳葉黃酮對(duì)·OH的清除率最高可達(dá)57.23%。在相同濃度時(shí)，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對(duì)·OH清除率的差異性不大。也表明提取溫度對(duì)旱柳葉中提取的黃酮種類及其抗氧化活性基本無(wú)影響。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，提取溫度對(duì)旱柳葉中黃酮提取率有較大影響，旱柳葉中黃酮超聲輔助提取最佳溫度為60℃，該溫度下，旱柳葉黃酮提取率為2.51%。試驗(yàn)也表明，不同溫度下提取的旱柳葉黃酮對(duì)DPPH·清除率的差異性不大，對(duì)·OH清除率的差異性也不大，說(shuō)明提取溫度對(duì)旱柳葉中黃酮提取的種類及其抗氧化活性基本無(wú)影響。

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作者簡(jiǎn)介：王妮（1996-），女，本科，實(shí)驗(yàn)師，從事天然產(chǎn)物活性成分研究；趙二勞（1952-），男，本科，教授，從事天然產(chǎn)物活性成分研究。endprint