馬喆　鮑俊翠　王慧軍　肖愛民　李小蘭　李環(huán)

[摘 要] 目的：檢測(cè)miR-222基因、雌激素受體α（ERα）、膠原蛋白在陰道前壁膨出（AVP）患者陰道壁中的表達(dá)，分析其臨床價(jià)值。方法：2014年6月至2016年3月，選取40例AVP患者（AVP組）和同期40例接受其他婦科手術(shù)的良性病變患者（對(duì)照組）。按照月經(jīng)狀態(tài)，再分為絕經(jīng)前亞組、絕經(jīng)后亞組，檢測(cè)各組患者陰道壁miR-222基因、ERα及膠原蛋白表達(dá)情況，計(jì)算各指標(biāo)間相關(guān)性并分析其臨床意義。結(jié)果：AVP組絕經(jīng)前、絕經(jīng)后亞組陰道壁miR222高于對(duì)照組相應(yīng)亞組，其ERα及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組相應(yīng)亞組，兩組內(nèi)比較絕經(jīng)后亞組miR-222表達(dá)水平高于絕經(jīng)前亞組，其ERα表達(dá)水平低于絕經(jīng)前亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)性分析可見miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：miR-222表達(dá)增加所致ERα含量下降以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平的減少，是引發(fā)AVP的重要機(jī)制，注重絕經(jīng)前后上述指標(biāo)變化的監(jiān)測(cè)有望為AVP的診斷及靶向治療提供一定參考。

[關(guān)鍵詞] miR-222基因；雌激素受體α；膠原蛋白；陰道前壁膨出

中圖分類號(hào)：R711 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2017）05-078-03

DOI：10.11876/mimt201705032

陰道前壁膨出（AVP）是最常見的盆腔器官脫垂（POP）類型，盆底支持組織結(jié)構(gòu)與功能完整性的破壞對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]。目前，臨床對(duì)AVP的發(fā)病機(jī)制尚無明確闡釋，多數(shù)研究認(rèn)為，年齡、妊娠及分娩、肥胖、遺傳等與AVP相關(guān)[2]，絕經(jīng)后女性AVP呈上升趨勢(shì)，可能與雌激素水平變化有關(guān)[3]。此外，有學(xué)者認(rèn)為，POP的發(fā)生與結(jié)締組織變化亦具有密切關(guān)聯(lián)，如膠原蛋白代謝異常者有著更高的POP發(fā)生率，且治療后復(fù)發(fā)率較高[4]。此次研究檢測(cè)miR-222基因、雌激素受體α（ERα）及膠原蛋白在AVP患者陰道壁中的表達(dá)，旨在進(jìn)一步了解AVP發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象與分組

征得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，2014年6月至2016年3月期間40例于我院接受手術(shù)的AVP患者納入AVP組；同期40例因?yàn)槠渌夹詪D科疾病需行手術(shù)患者納入對(duì)照組。兩組均排除合并惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科急性炎癥者以及既往有盆底手術(shù)史或術(shù)前3個(gè)月內(nèi)有雌激素藥物使用史者?；颊呔橥獠⒑炇鹬橥鈺?，再按照患者月經(jīng)狀態(tài)分為絕經(jīng)前亞組、絕經(jīng)后亞組。

1.2 檢測(cè)方法

術(shù)中取患者陰道前壁組織，以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，檢測(cè)miR-222基因相對(duì)表達(dá)水平 [5]；使用免疫組化法，檢測(cè)ERα[6]，一抗為兔抗人多克隆ERα抗體（美國Santa Cruz公司），二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（英國Abcam公司）；采用免疫組化S-P法，通過平均陽性染色面積百分比對(duì)I 型、III型膠原蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)[7]，試劑盒購自杭州江萊ELISA檢測(cè)中心。

1.3 結(jié)果判讀

miR-222表達(dá)水平判讀[8]：在目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同的前提下，以U6為內(nèi)參，測(cè)定循環(huán)閾值（Ct值），計(jì)算△Ct（△Ct=miR-222 Ct值-U6 Ct值），以2-△△Ct表示miR-222表達(dá)水平；ERα表達(dá)水平判讀[9]：染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞核ERα表達(dá)情況，棕黃色染色為陽性細(xì)胞，于400×視野下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽性染色強(qiáng)弱、陽性細(xì)胞百分率，二者乘積為ERα表達(dá)水平，其中，染色強(qiáng)弱計(jì)分0～3分，依次為無棕黃色染色、淺黃色染色、深黃色染色、深棕色染色；陽性細(xì)胞百分率計(jì)分0～4分，依次為0、1%～25%、26%～50%、51%～75%/、76%～100%；膠原蛋白表達(dá)水平判讀[10]：在光鏡下觀察所有染色切片，I、III型型膠原蛋白以細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺棕色或者棕黃色為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不互相重復(fù)的×200視野，拍照后運(yùn)用Image-Pro Plus計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算I型 、III型膠原蛋白所占面積百分比，即相對(duì)陽性染色面積平均值（%），得出I型、III型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

指標(biāo)表達(dá)組間比較采用t檢驗(yàn)，使用Pearson相關(guān)性分析，計(jì)算各指標(biāo)間相關(guān)性，SPSS18.0處理數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者陰道壁各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況

AVP組絕經(jīng)前、絕經(jīng)后亞組陰道壁miR222高于對(duì)照組相應(yīng)亞組，其ERα及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組相應(yīng)亞組，兩組患者組內(nèi)比較，絕經(jīng)后亞組miR-222表達(dá)水平高于絕經(jīng)前亞組，其ERα表達(dá)水平低于絕經(jīng)前亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）。

3 討論

女性盆底由盆底肌、韌帶、筋膜等結(jié)構(gòu)組成，共同形成盆底支持結(jié)構(gòu)，在維持膀胱、尿道、陰道、子宮和直腸等盆腔器官正常位置中發(fā)揮著重要作用[11]。盆底結(jié)構(gòu)的松弛可引發(fā)POP，包括AVP、陰道頂端脫垂、陰道后壁脫垂等，其中AVP最為常見，且往往伴隨陰道分泌物增多、陰道脫出物、下尿路癥狀、腸道癥狀、性功能障礙等 [12]。

一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，老年女性POP發(fā)生率高達(dá)32.8%，且人群中約有11%～19%的POP患者需手術(shù)治

療[13]。隨著人口老齡化的加劇，POP發(fā)生率不斷上升，已成為影響全球婦女健康和生活質(zhì)量的疾患。endprint

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，可調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄過程，參與生物體的發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等活動(dòng)，其中，miR-222是一種高度保守的非編碼小分子RNA，與ERα存在靶向調(diào)控關(guān)系，且已有研究證實(shí)miR-222在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演的重要角色[14]。此次研究從絕經(jīng)前后不同狀態(tài)觀察AVP患者發(fā)病機(jī)制，結(jié)果表明，女性絕經(jīng)后miR-222表達(dá)水平大幅增加，AVP患者陰道壁miR-222表達(dá)水平高于非AVP患者，且miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說明miR-222、ERα可能參與了AVP的發(fā)展，其機(jī)制可能為：隨著女性年齡的增加，雌激素等內(nèi)分泌指標(biāo)的變化可能引發(fā)miR-222過表達(dá)，而miR-222過表達(dá)可下調(diào)ERα表達(dá)、降低雌激素敏感性，進(jìn)而影響陰道和盆底正常組織結(jié)構(gòu)，造成盆底結(jié)構(gòu)支撐力下降，以及陰道前壁松弛、膨出[15-16]。

在盆底支持組織中，子宮主韌帶、子宮骸韌帶以及肛提肌均發(fā)揮著重要作用，其中，韌帶的主要成分包括平滑肌、結(jié)締組織，而膠原蛋白是結(jié)締組織的重要組成部分，約占機(jī)體全部蛋白的25%以上[17]。盆底組織主要由Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原組成，Ⅰ型硬度大、直徑粗，主要分布于皮膚、肌肉、骨骼、韌帶等組織，發(fā)揮支持作用；Ⅲ型彈性大、直徑較細(xì)，主要調(diào)控組織彈性。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例平衡才能維持女性盆底結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[18]。本研究結(jié)果中AVP患者陰道壁Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平均較非AVP患者顯著下降，是導(dǎo)致盆底結(jié)締組織膠原變細(xì)、抗張能力不足的主要原因，而上述病理變化也是造成盆腔支持能力不足特別是AVP的主要原因。

綜上所述，AVP患者陰道壁miR-222基因高表達(dá)，ERα、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平顯著下降，且miR-222、ERα表達(dá)水平與患者月經(jīng)狀態(tài)具有一定關(guān)聯(lián)，尋求高選擇性雌激素受體以逆轉(zhuǎn)ERα下降、探索改善盆腔組織彈性及支持力的方法，有望為AVP的治療提供新的思路與方向。

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