趙云福+邱東曉+梁晨+王佳寧

摘要：為開發(fā)蘋果病原真菌生防菌劑，采用稀釋分離法、生長(zhǎng)速率法、平板對(duì)峙法等從土壤中篩選出對(duì)蘋果腐爛病（Cytospora mandshurica）、輪紋?。˙otryosphaeria dothidea）、斑點(diǎn)落葉病（Alternaria mali）具有明顯拮抗作用的菌株，并根據(jù)其形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列分析等進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株HMQAU140045抑菌效果顯著，對(duì)3種蘋果病原真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有顯著抑制作用，經(jīng)其無菌發(fā)酵濾液處理后，病原菌菌絲畸形，分支增多，局部膨大，分生孢子不萌發(fā)或萌發(fā)產(chǎn)生的芽管畸形腫大成球狀泡。鑒定結(jié)果表明該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關(guān)鍵詞：蘋果真菌病害；拮抗菌株；分離；鑒定；解淀粉芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S476.19文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）12-0054-05

Abstract An antagonistic bacterium strain HMQAU140045 with strong inhibitory activity against three fungal pathogens from apple trees （e.g. Cytospora mandshurica， Botryosphaeria dothidea， and Alternaria mali） was isolated from soil by using dilution plate method， plate growth rate and flat confrontation culture method.The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on the 16S rDNA sequence homology， the physiological and biochemical characteristics and morphological observation. The strain had significant inhibitory effect on mycelial growth and spore germination of the three apple pathogenic fungi. After treated by HMQAU140045 fermentation filtrate， the mycelia were malformed， spores did not germinate or generated germ tubes swollen to form spherical bubbles.

Keywords Apple fungal diseases； Antagonistic bacteria strain； Isolation； Identification； Bacillus amyloliquefaciens

中國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。近年來，隨著果樹種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，病害發(fā)生程度日趨嚴(yán)重。目前已知蘋果病害90余種，其中腐爛病、輪紋病、斑點(diǎn)落葉病、炭疽病等真菌性病害為各蘋果產(chǎn)區(qū)最常見和嚴(yán)重病害[2，3]。

目前蘋果真菌性病害的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥的頻繁施用不僅易造成環(huán)境污染，病原菌抗性增加，而且成為威脅蘋果質(zhì)量安全的最主要風(fēng)險(xiǎn)因素，因此尋找安全可行的病害控制手段成為當(dāng)前果業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題。生物防治以其綠色、無污染、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)受到人們普遍關(guān)注，利用生防細(xì)菌來防治植物病害是生物防治的一種主要手段。張淑穎等[4]從劍麻葉片分離獲得一株枯草芽孢桿菌，對(duì)離體枝條上蘋果腐爛病菌的擴(kuò)展有較好的抑制效果。馬榮等[5]通過組織分離、平板對(duì)峙法篩選得到對(duì)蘋果腐爛病菌拮抗效果達(dá)到87%的枯草芽孢桿菌。黃玲玲等[6]利用解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發(fā)酵液、菌懸液及其無菌胞外抗菌蛋白對(duì)蘋果輪紋病菌平板抑制和果體抑制效果分別進(jìn)行了試驗(yàn)，指出其發(fā)酵液、菌懸液的抑菌作用更好。目前針對(duì)蘋果拮抗微生物的研究已做了很多工作，但尚未見利用拮抗菌防治蘋果園常見真菌性病害的報(bào)道。本文以蘋果腐爛病、輪紋病、斑點(diǎn)落葉病等為靶標(biāo)病害，通過廣泛采樣，篩選出拮抗譜較廣的菌株，以期為生防菌劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

煙臺(tái)、青島、淄博等地蘋果園、桃園、藍(lán)莓園根際土壤。

1.2 供試菌株及培養(yǎng)基

蘋果腐爛病菌（Cytospora mandshurica）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、斑點(diǎn)落葉病菌（Alternaria mali）、炭疽病菌（Glomerella cingulata）等采自煙臺(tái)棲霞、蓬萊蘋果園，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌學(xué)研究室分離保存。

1.3 培養(yǎng)基

LB、PD、PDA培養(yǎng)基等[7]。

1.4 拮抗菌株的分離、篩選

采用稀釋分離法對(duì)不同來源的土壤樣品進(jìn)行菌株分離，選取不同菌落進(jìn)行劃線純化，編號(hào)、保存?zhèn)溆?。采用?duì)峙培養(yǎng)法[8]從細(xì)菌菌株中篩選對(duì)蘋果腐爛病菌、輪紋病菌、斑點(diǎn)落葉病菌、炭疽病菌有拮抗作用的菌株，測(cè)量抑菌帶寬度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)。

1.5 拮抗菌株發(fā)酵濾液對(duì)蘋果病原真菌的抑制作用試驗(yàn)

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定拮抗菌株發(fā)酵液稀釋50、100、150、200倍對(duì)蘋果病原菌的抑制作用。種子液及發(fā)酵條件：將拮抗菌用接種環(huán)刮取接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h得到種子液。培養(yǎng)好的種子液按1.5%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，配方為玉米粉2.0%、胰蛋白胨1.0%、酵母提取物1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、pH值6.5，培養(yǎng)溫度28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)80 h，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾除菌。將發(fā)酵濾液滴于溶化的PDA培養(yǎng)基中，使其稀釋不同倍數(shù)，凝固后，接種6 mm病原菌菌餅，4 d后顯微鏡下觀察病原菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)，并拍照，采用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組直徑和處理組直徑，計(jì)算抑菌率[9]。用無菌水制備成濃度為 106個(gè)/mL 的孢子懸浮液備用。將拮抗菌發(fā)酵濾液按 50、100、150、200倍的稀釋比例分別與不同病原菌孢子懸浮液混勻，各取25 μL 滴在載玻片中央，并置于裝有1%水瓊脂的培養(yǎng)皿中密封，25℃恒溫保濕36 h 后觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算對(duì)孢子萌發(fā)抑制率，并拍照[10，11]。endprint

1.6 拮抗菌株的鑒定

拮抗菌株形態(tài)觀察和生理生化特性分析參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]。

用改良CTAB法提取拮抗菌株基因組DNA[13]。

拮抗菌株16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增及序列分析：提取菌株基因組 DNA 后，利用細(xì)菌通用引物27-F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′）和 1492-R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)拮抗菌株基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Master Mix 5 μL，27F/1492R（10 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 5 μL，補(bǔ)水至 25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，53℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從不同土壤樣品中共分離得到細(xì)菌48株。通過對(duì)峙培養(yǎng)法從中篩選出對(duì)幾種蘋果病原真菌均具有明顯拮抗作用的拮抗細(xì)菌3株，見表1。3株拮抗菌均對(duì)蘋果腐爛病菌拮抗效果最好，抑菌帶寬度均達(dá)9.4 mm及以上，且均對(duì)炭疽病菌拮抗效果稍差。綜合比較，選取對(duì)各病原菌抑制效果相對(duì)較好的菌株HMQAU140045進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 拮抗菌株發(fā)酵濾液對(duì)蘋果病原真菌抑制作用

由表2可知，菌株HMQAU140045發(fā)酵濾液對(duì)蘋果腐爛病菌的抑菌效果最好，稀釋50～100倍對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率均可達(dá)100%，隨稀釋倍數(shù)的增大對(duì)菌絲的抑制率逐漸下降，稀釋200倍后抑制率仍達(dá)82.06%；對(duì)孢子萌發(fā)抑制率與對(duì)菌絲的表現(xiàn)相似，發(fā)酵液稀釋200倍孢子萌發(fā)抑制率仍達(dá)92.74%。菌株發(fā)酵液對(duì)輪紋病菌和斑點(diǎn)落葉病菌的抑制作用表現(xiàn)類似腐爛病菌。菌株HMQAU140045各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對(duì)3種病原菌的平板抑菌效果見圖1。

圖2鏡檢發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的分生孢子萌發(fā)后芽管粗壯均勻，生長(zhǎng)迅速；經(jīng)發(fā)酵濾液處理的病原菌分生孢子及芽管明顯畸形，孢子萌發(fā)芽管很短或分生孢子顯著膨大畸形，芽管不能繼續(xù)伸長(zhǎng)。對(duì)照病原菌菌絲粗細(xì)均勻、分枝較少，經(jīng)發(fā)酵液處理病原菌菌絲顏色明顯加深，菌絲中間或頂端顯著膨大，有的菌絲分支增多，甚至多條菌絲聚集融合在一起，部分菌絲細(xì)胞質(zhì)外滲。

結(jié)果表明菌株HMQAU140045產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)對(duì)蘋果病原真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用。

2.3 拮抗菌形態(tài)和生理生化鑒定

菌株HMQAU140045于LB固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2 d，菌落直徑0.5～2.5 mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圓形、邊緣不規(guī)則、表面有褶皺，在菌落邊緣有晶體狀物質(zhì)。菌體革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀（0.93±0.24）～ （2.01±0.52） μm，單個(gè)或成對(duì)排列，產(chǎn)芽孢。該菌株既不好氧，也不厭氧，其糖醇類發(fā)酵、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、V-P測(cè)定等為陽(yáng)性反應(yīng)，甲基紅和反硝化反應(yīng)為陰性，抗逆性表現(xiàn)較強(qiáng)，其它生理生化鑒定結(jié)果見表3。

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌通用引物27F/1492R對(duì)菌株HMQAU140045的16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序分析，確定該片段全長(zhǎng)1 492 bp。將擴(kuò)增得到的序列與GenBank中BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3。結(jié)果表明，菌株HMQAU140045與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（GenBank登錄號(hào)為KP686229）的同源性達(dá)到99%，菌株HMQAU140045與4株Bacillus amyloliquefaciens菌株的序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。

綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性和16S rDNA序列分析同源性比對(duì)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育樹位置，將菌株HMQAU140045鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 討論與結(jié)論

蘋果生產(chǎn)中對(duì)常見真菌性病害以化學(xué)防治為主，施藥頻次高，對(duì)環(huán)境壓力大，以斑點(diǎn)落葉病為例，周年防治次數(shù)7次以上，目前可用登記農(nóng)藥品種500個(gè)左右（截至2016年12月），而登記的活體微生物殺菌劑產(chǎn)品仍為空白。本研究篩選出的HMQAU140045對(duì)供試3種蘋果病原真菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA 序列分析，最終確定菌株HMQAU140045為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），是一種與枯草芽孢桿菌具有很高親緣性且具有廣泛抑菌譜的細(xì)菌。陳士云等[15]從土壤中分離出解淀粉芽孢桿菌CH-2，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨沉淀后能抑制油菜核盤菌菌絲的生長(zhǎng)，還可抑制菌核的形成；陳成等[16]分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，對(duì)黑曲霉、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌等均有良好的抑制作用；陳蕾蕾等[17]發(fā)現(xiàn)一株廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌，菌體及發(fā)酵液具有拮抗桃根霉腐爛病、黃瓜枯萎病、棗炭疽病、梨黑斑病、蘋果褐腐病等植物病原菌及拮抗金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、酵母等食源性致病菌和腐敗菌的作用，廣譜抗菌并且效果穩(wěn)定持久。

解淀粉芽孢桿菌在其生長(zhǎng)過程中能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有廣泛抑制真菌與細(xì)菌的功能，主要抑制分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，以及導(dǎo)致病原菌菌絲畸形，如頂端膨大、分支增多、細(xì)胞質(zhì)外滲等[18-20]，這在本研究中也得到部分證實(shí)。近幾年關(guān)于解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)制的研究報(bào)道越來越多，有的研究已經(jīng)深入到分子水平[21]。本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌對(duì)蘋果樹幾種真菌性病害拮抗活性較高，具有較好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。endprint

參 考 文 獻(xiàn)：

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