譚雄斯，龐武耀

(肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，廣東 肇慶 526020)

·中藥工業(yè)·

HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定金嗓散結(jié)膠囊中的(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A△

譚雄斯*，龐武耀

(肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，廣東 肇慶 526020)

目的建立金嗓散結(jié)膠囊中(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的同時(shí)測(cè)定方法。方法采用HPLC法，應(yīng)用Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-乙腈(3∶1)與0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；供試品采用50%甲醇超聲提取。結(jié)果(R，S)告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的線(xiàn)性范圍分別為4.150～83.00、5.120～102.4、11.07～221.4、4.590～91.80、8.140～162.8 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2、0.999 9、0.999 4、0.999 7、0.999 5；5種成分分離良好，陰性對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，平均加樣回收率及相應(yīng)的RSD分別為99.06%(1.27%)、99.54%(1.15%)、98.19%(0.89%)、97.88%(1.71%)、97.22%(0.99%)。結(jié)論所建立的方法可用于金嗓散結(jié)膠囊的質(zhì)量控制。

金嗓散結(jié)膠囊；(R，S)-告依春；羥基紅花黃色素A；丹酚酸B；木蝴蝶苷B；木蝴蝶苷A；波長(zhǎng)切換法；中成藥多組分測(cè)定

金嗓散結(jié)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)，臨床上主要用于熱毒蓄結(jié)、氣滯血瘀而形成的慢喉喑及由此而引起的聲音嘶啞等癥狀的治療，該制劑是由板藍(lán)根、紅花、丹參、木蝴蝶等十余味中藥材加工而成的膠囊劑，其標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)任何成分進(jìn)行定量測(cè)定[1]，文獻(xiàn)報(bào)道也未檢索到對(duì)該制劑中多組分進(jìn)行含量的同時(shí)測(cè)定，為更好地確保臨床用藥安全及該制劑的質(zhì)量，本文建立了一種較為簡(jiǎn)便的HPLC波長(zhǎng)切換法，對(duì)金嗓散結(jié)膠囊中的4味中藥材中的5個(gè)成分[板藍(lán)根[2]中的(R，S)-告依春、紅花[2]中的羥基紅花黃色素A、丹參[2]中的丹酚酸B及木蝴蝶中的木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A]同時(shí)進(jìn)行了含量測(cè)定，為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色譜儀；METTLER十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士)；KQ-250B超聲波發(fā)生器(昆山市超聲波儀器有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純；磷酸為分析純；對(duì)照品(R，S)-告依春(111753-201505)、羥基紅花黃色素A(111637-201609)、丹酚酸B(111562-201615)和木蝴蝶苷B(111915-201202)(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；對(duì)照品木蝴蝶苷A(31567-75-6)(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)。

金嗓散結(jié)膠囊來(lái)源于西安碑林藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每粒裝0.4 g，批號(hào)見(jiàn)表7。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A各適量，精密稱(chēng)定，分別用50%甲醇溶解并稀釋制成一定濃度的單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液[(R，S)-告依春0.415 mg·mL-1、羥基紅花黃色素A 0.512 mg·mL-1、丹酚酸B 1.107 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.459 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.814 mg·mL-1]，再分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量置同一量瓶中，用50%甲醇制成含(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A分別為8.3、25.6、110.7、45.9、40.7 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取金嗓散結(jié)膠囊適量，傾出內(nèi)容物，研成細(xì)粉，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，采用KQ-250B超聲波發(fā)生器超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，振搖均勻，過(guò)濾，作為金嗓散結(jié)膠囊供試品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備

按金嗓散結(jié)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方工藝，制備缺板藍(lán)根、紅花、丹參和木蝴蝶的陰性樣品，再按照上述方法制備陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件

使用Agilent HC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：甲醇-乙腈(3∶1)，流動(dòng)相B：0.4%磷酸溶液，梯度洗脫[3-7](0～14 min，20.0%A；14～25 min，20.0%A→42.0%A；25～30 min，42.0%A→60.0%A；30～35 min，60.0%A→20.0%A)；0～14 min時(shí)在245 nm[8]波長(zhǎng)下檢測(cè)(R，S)-告依春，14～20 min在403 nm[9]波長(zhǎng)下檢測(cè)羥基紅花黃色素A，20～35 min在280 nm[10-12]波長(zhǎng)下檢測(cè)丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取上述制備的3種溶液各適量，按照2.4項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性樣品溶液的色譜圖中，在混合對(duì)照品溶液和供試品溶液所顯示的(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾，且分離度符合要求，理論塔板數(shù)均大于2500。見(jiàn)圖1。

注：A.樣品；B.對(duì)照品；C.陰性；1.(R，S)-告依春；2.羥基紅花黃色素A；3.丹酚酸B；4.木蝴蝶苷B；5.木蝴蝶苷A。圖1 樣品、對(duì)照品、陰性樣品HPLC圖

2.6 線(xiàn)性范圍考察

取(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A 5個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋?zhuān)瞥?個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，得線(xiàn)性回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A峰面積的RSD分別為1.17%、1.05%、0.61%、0.73%和0.85%(n=6)。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金嗓散結(jié)膠囊(批號(hào)：201510023)同一份供試品溶液，于室溫下分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的峰面積，結(jié)果所測(cè)5個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.08%、0.76%、0.57%、0.69%和0.92%，供試品溶液中5個(gè)成分在室溫條件下12 h內(nèi)很穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取金嗓散結(jié)膠囊樣品(批號(hào)：201510023)6份，按2.2的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，分別計(jì)算(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量，結(jié)果所測(cè)5個(gè)組分含量的RSD依次為1.42%、0.97%、1.03%、0.56%和1.24%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的金嗓散結(jié)膠囊(批號(hào)：201510023)適量，傾出內(nèi)容物，研成細(xì)粉，取6份，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定，精密加入質(zhì)量濃度分別為(R，S)-告依春0.228 mg·mL-1、羥基紅花黃色素A 0.702 mg·mL-1、丹酚酸B 0.459 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.671 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.882 mg·mL-1的單一成分對(duì)照品溶液1.0、1.0、5.0、2.0、1.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備加樣回收樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算所測(cè)5個(gè)組分的回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2～6。

表2 (R，S)-告依春加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

表4 丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

表5 木蝴蝶苷B加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

表6 木蝴蝶苷A加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.11 樣品測(cè)定

取3批金嗓散結(jié)膠囊，按2.2的方法制備金嗓散結(jié)膠囊供試品溶液，在2.4色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 待測(cè)成分的選擇

金嗓散結(jié)膠囊為中藥復(fù)方制劑，板藍(lán)根、紅花、丹參、木蝴蝶為方中的主要藥物，板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功能，其主要有效成分為(R，S)-告依春；紅花具有散瘀止痛、活血通經(jīng)的功能，其主要藥效成分為羥基紅花黃色素A；丹參具有活血祛瘀、涼血消癰的功能，丹酚酸B為丹參的主要成分之一；木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟種子，具有清肺利咽的功能，主要用于肺熱咳嗽、喉痹、音啞等病癥的治療，其主要成分為木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。本文采用高效液相波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法，同時(shí)對(duì)金嗓散結(jié)膠囊中的主要成分(R，S)-告依春、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和療效一致性提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 流動(dòng)相的確定

本文作者在流動(dòng)相的選擇上，首先參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》板藍(lán)根藥材項(xiàng)下(R，S)-告依春的流動(dòng)相(甲醇-0.02%磷酸溶液)和木蝴蝶藥材項(xiàng)下木蝴蝶苷B的流動(dòng)相(甲醇-0.2%磷酸溶液)，選取甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，不同比例梯度洗脫，結(jié)果所測(cè)成分(R，S)-告依春、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A能達(dá)到有效分離，但羥基紅花黃色素A達(dá)不到有效分離，丹酚酸B拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；同時(shí)又參考丹參藥材項(xiàng)下丹酚酸B的檢測(cè)流動(dòng)相(乙腈-0.1%磷酸溶液)和參考文獻(xiàn)[9]中羥基紅花黃色素A的檢測(cè)流動(dòng)相(乙腈-0.4%磷酸溶液)，選取乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相不同比例梯度洗脫，結(jié)果所測(cè)成分(R，S)-告依春峰形較差；在此基礎(chǔ)上作者經(jīng)過(guò)不斷對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以基線(xiàn)平穩(wěn)情況、分離度、拖尾因子、噪聲干擾等各種因素為指標(biāo)，最終選取甲醇-乙腈(3∶1)與0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，按照文中的梯度洗脫程序?qū)λ鶞y(cè)5個(gè)成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

高效液相波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定金嗓散結(jié)膠囊中5種主要成分，操作簡(jiǎn)便，通過(guò)系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn)、線(xiàn)性關(guān)系考察等一系列的方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可以作為金嗓散結(jié)膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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SimultaneousDeterminationof(R，S)-goitrin，HydroxysafflorYellowA，SalvianolicacidB，Baicalein-7-O-diglucosideandBaicalin-7-glucosideinJinsangSanjieJiaonangbyHPLCWavelengthSwitchingMethod

TANXiongsi*，PANGWuyao

(ZhaoqingMedicalCollege，GuangdongZhaoqing526020，China)

Objective：To develop a method for simultaneous determination of the content of (R，S)-goitrin，hydroxysafflor yellow A，salvianolic acid B，baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside in Jinsang Sanjie Jiaonang.MethodsAn HPLC method was adopted for the analysis，which was performed on a Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)chromatographic column with the mobile phase of methanol-acetonitrile(3∶1)(A)-0.4%phosphoric acid solution(B)in a gradient elution，the flow rate of 1.0 mL·min-1，and the samples were preprocessed with ultrasonic extraction in 50% methanol solution.ResultsThe linearity ranges of(R，S)-goitrin，hydroxysafflor yellow A，salvianolic acid B，baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside were 4.150-83.00 μg·mL-1(r=0.999 2)，5.120-102.4 μg·mL-1(r=0.999 9)，11.07-221.4 μg·mL-1(r=0.999 4)，4.590-91.80 μg·mL-1(r=0.999 7)，8.140-162.8 μg·mL-1(r=0.999 5)，respectively.The five components were separated perfectly without disturbing peaks from negative samples.The average recoveries and the corresponding RSD were 99.06%(1.27%)，99.54%(1.15%)，98.19%(0.89%)，97.88%(1.71%)，97.22%(0.99%)，respectively.ConclusionThe method can be applied to the quality control of Jinsang Sanjie Jiaonang.

Jinsang Sanjie Jiaonang；(R，S)-goitrin；hydroxysafflor yellow A；salvianolic acid B；baicalein-7-O-diglucoside；baicalin-7-glucoside；wavelength switching method；multicomponent determination of Chinese patent drug

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.021

肇慶市科技創(chuàng)新指導(dǎo)類(lèi)項(xiàng)目[肇科(2017)33號(hào)文]

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譚雄斯，藥師，研究方向：藥物分析、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究等；E-mail：tanxiongsizhaoqing@163.com

2016-12-13)