鄭嘉慧，陳鴻洋，李金全，聶 明，方長明

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物多樣性科學(xué)研究所，上海 200438)

不同土壤滅菌方法對土壤微生物活性的影響

鄭嘉慧，陳鴻洋，李金全，聶 明，方長明

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物多樣性科學(xué)研究所，上海 200438)

滅菌處理是土壤生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的一種重要研究手段，滅菌效果的好壞直接關(guān)系到后續(xù)研究的進行及其結(jié)果的準確性．常用土壤滅菌方法的滅菌效果及其評估仍然存在很大的不確定性．本文選取目前常用的3種滅菌方法，即高溫高壓蒸汽法、氯仿熏蒸法及輻射滅菌法，對不同背景的土壤樣品進行滅菌．通過改變滅菌次數(shù)及滅菌間隔時間，觀察滅菌后土壤微生物呼吸速率的變化．結(jié)果表明： (1) 常規(guī)氯仿熏蒸滅菌后土壤微生物呼吸速率并不完全隨著微生物量的減小而降低，說明單純從土壤微生物量的角度不能準確界定滅菌效果以及解析微生物在土壤生態(tài)過程中的作用；(2) 高溫高壓蒸汽比常規(guī)氯仿熏蒸和輻射滅菌方法有更好的土壤微生物滅活效果．實際應(yīng)用中采用高溫高壓蒸汽滅菌時，建議采用滅菌2次、時間間隔為3d的滅菌處理；在相關(guān)研究中，對使用該方法滅菌效果的分析研究最佳時間不宜超過2d．

土壤滅菌； 土壤微生物活性； 土壤微生物量； 滅菌次數(shù)； 滅菌間隔天數(shù)

在土壤生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)及其他相關(guān)研究中，為確定土壤微生物的生物量或微生物活性及其調(diào)控機制，常需要對土壤進行滅菌處理[1-4]．常規(guī)土壤滅菌方法包括物理方法如高溫高壓蒸汽滅菌、輻射滅菌、微波滅菌及化學(xué)方法如氯仿(三氯甲烷)熏蒸滅菌等[5]，其中氯仿熏蒸滅菌的相關(guān)技術(shù)不僅是目前測定土壤微生物生物量的通用方法，也是解析微生物呼吸對土壤總呼吸貢獻的基礎(chǔ)[6]．

常規(guī)土壤滅菌方法各有利弊，高溫高壓蒸汽滅菌操作簡單成本低，但是對土壤理化性質(zhì)的擾動很大，雖然適當添加化學(xué)輔助劑會提高滅菌效率，但是輔助劑的殘留也會帶來一定的后續(xù)影響[7-8]．輻射滅菌既能達到一定的滅菌效果同時對土壤理化性質(zhì)影響較小，但易使土壤有機物質(zhì)溶解出現(xiàn)不平衡的跡象[9]．氯仿熏蒸法操作簡便成本低，但是試劑本身的殘留會對后續(xù)土壤實驗帶來負作用，此外滅菌操作過程中揮發(fā)出的氯仿蒸汽會對環(huán)境帶來一定的污染[10]．由于土壤理化性狀的高異質(zhì)性及土壤微生物的多樣性，不同滅菌方法的效果存有較大的不確定性，滅菌處理后土壤仍會表現(xiàn)出高低不等的微生物活性．另外，在土壤滅菌過程中，處于休眠態(tài)的土壤微生物需要一定的時間轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)后才能在滅菌處理中被除去[11-12]，常規(guī)一次性滅菌可能不足以對微生物有效滅活．因此，對于同一種滅菌方法，重復(fù)滅菌的次數(shù)及改變滅菌時間的間隔也會影響到土壤滅菌的效果．曾有研究發(fā)現(xiàn)，滅菌2次以上時土壤微生物的滅活效果會更顯著[13-15]．為了達到較好的土壤微生物滅活效果，需要在常規(guī)滅菌方法基礎(chǔ)上對滅菌次數(shù)及滅菌時間間隔進行優(yōu)化．

一些土壤研究認為，測量滅菌前后的土壤微生物量的變化，計算被滅活的土壤微生物占整個土壤微生物群落的比例，也可以反映出土壤滅菌效果及整個微生物群落的狀態(tài)[16]．這種觀點的基礎(chǔ)是滅菌后土壤微生物量的變化與微生物活性的變化存在相關(guān)性，如Griffiths[17]通過氯仿熏蒸對土壤進行滅菌以降低其中的微生物量，發(fā)現(xiàn)在滅菌后微生物量顯著降低的土壤中，有機質(zhì)分解速率及土壤恢復(fù)能力均較低，進而推測滅菌后土壤微生物的活性也隨之降低．實際應(yīng)用中經(jīng)常會有不同的情形發(fā)生．Tuominen等[18]采用高溫高壓蒸汽、輻射、甲醛和氯化汞4種方法對土壤進行滅菌處理后，發(fā)現(xiàn)土壤微生物量確實會顯著降低，但是Ramsay等[19-20]在后續(xù)研究中卻發(fā)現(xiàn)其中輻射及氯仿熏蒸處理后，滅菌土壤的微生物活性卻顯著地高于未滅菌土壤．說明滅菌處理后微生物量的減少并不完全代表微生物活性程度的降低，土壤微生物活性在一定程度上才是反應(yīng)土壤中整個微生物群落存活狀態(tài)的關(guān)鍵[21]，單純從土壤微生物量變化的角度不能準確界定微生物的滅活效果．雖然土壤微生物量及微生物活性均可以作為觀測整個土壤微生物群落的重要指標，但是采用不同方法滅菌過程中土壤微生物量及微生物活性之間關(guān)系的變化仍不是很明確，給土壤生態(tài)學(xué)的相關(guān)研究帶來不確定性．

在以往研究和生產(chǎn)應(yīng)用中，經(jīng)過常規(guī)滅菌處理的土壤，通常被認為微生物活性已得到最大程度的降低[22]．氯仿熏蒸法作為測定土壤微生物量的常規(guī)技術(shù)，其基本假設(shè)就是絕大多數(shù)土壤微生物已經(jīng)被氯仿蒸汽殺死[23]．但在實際應(yīng)用滅菌處理后，土壤微生物是否已基本滅活并未能系統(tǒng)完善的評價．土壤中的大多數(shù)生物化學(xué)過程都是由微生物介導(dǎo)，如有機質(zhì)礦化、硝化/反硝化[24]以及有機物轉(zhuǎn)化[25]等．土壤微生物呼吸(通常稱為土壤異養(yǎng)呼吸，以與土壤中的植物根系呼吸相區(qū)別)速率是度量由微生物介導(dǎo)的土壤過程的一個有效指標，通過測定土壤微生物吸收的氧氣或釋放的二氧化碳總量，可以表征土壤微生物的總體表觀活性[26]．系統(tǒng)地測量滅菌處理前后土壤的呼吸強度，可較好地反映出微生物的滅活效果[22]．目前通過測定滅菌前后土壤呼吸的變化來定量評價土壤微生物滅活效果的研究較為少見，尤其是對氯仿熏蒸滅菌后土壤微生物量及微生物活性變化之間的關(guān)系尚未有系統(tǒng)研究．本文選取3種常見的土壤滅菌方法，即高溫高壓蒸汽滅菌法、氯仿熏蒸法及輻射滅菌法，對4種不同發(fā)育背景的土壤樣品進行滅菌處理，改變滅菌次數(shù)及滅菌時間間隔，測定滅菌后土壤呼吸的變化，比較各滅菌方法在不同處理情景下對土壤微生物的滅活效果及滅活持續(xù)性的差異，以尋求最佳的土壤滅菌條件組合．同時選取一種土樣(沈陽森林)進行氯仿熏蒸滅菌，測量滅菌前后土壤微生物量及土壤呼吸的變化，探究該滅菌方法不同滅菌次數(shù)及滅菌時間間隔處理后的土壤微生物量及微生物活性之間的變化關(guān)系．

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與預(yù)處理

本研究選取4種不同土壤，樣品采集于2015年9月至2016年4月間，采樣地背景和土壤基本理化性質(zhì)如表1所示．土樣采集時，隨機在每個取樣地設(shè)置3個采樣點，采樣點之間的距離不小于10m．先除去地表石子、植被等雜物，然后用土壤取樣器(直徑8cm)在每個采樣點處采取0～20cm的表層土，并將3個樣點的土壤均勻混合．采取的土樣在最短時間內(nèi)運回實驗室，挑揀出碎石子與植物根系等雜物后，置于25℃恒溫箱中儲存以供后續(xù)使用．

新鮮土樣的含水量用烘干法測定．將部分鮮土樣經(jīng)過自然風(fēng)干，研磨后過不銹鋼篩(孔徑2mm，10目)備用．取經(jīng)上述處理后的土樣用數(shù)字酸度計(PHS-3E，上海佑科儀器有限公司)于2h內(nèi)測定土壤pH值，樣品水土比例為2.5∶1．取鮮土樣研磨后過不銹鋼篩(孔徑0.15mm，100目)，使用碳氮分析儀(Flash EA 1112 Series NC Analyzer, Thermo Fisher Scientific, USA)測定土壤總碳、總氮含量，同時使用總有機碳分析儀(Multi N/C 3100 with solid module HT1300, Analytic Jena AG, Germany)測定土壤有機碳的含量．

表1 各樣地土壤背景值及相關(guān)理化性質(zhì)Tab.1 The background information and physio-chemical properties of soil samples

1.2 土壤預(yù)培養(yǎng)及滅菌處理

樣品分為空白對照和滅菌處理組．空白對照組不進行任何滅菌處理，每種土樣有4個重復(fù)．滅菌處理組采用3種滅菌方法，即高溫高壓蒸汽、氯仿熏蒸和射線滅菌．每種方法均重復(fù)滅菌3次，但有3種不同的時間間隔，即兩次滅菌之間的間隔分別為1d、3d、5d．滅菌處理樣品總計： 4種土壤×3種滅菌方法×3種時間間隔×4個重復(fù)．

預(yù)培養(yǎng)： 每個樣品稱取相當于20g干土的鮮土壤置于150mL玻璃培養(yǎng)瓶中，并將土樣含水量調(diào)至土壤飽和含水量的60%，放入25℃的恒溫箱中培養(yǎng)7d，并定時調(diào)水以保證含水量穩(wěn)定．

高溫高壓滅菌： 預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將土樣瓶口包扎好通氣封口膜，置于高溫高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃高溫高壓條件下滅菌1.5h．每次滅菌后需用無菌水調(diào)節(jié)含水量至土壤飽和含水量的60%．

氯仿熏蒸滅菌： 將待滅菌的土樣放入真空罐中氯仿熏蒸24h，然后取出裝氯仿的燒杯．密閉真空罐后抽氣5min，重復(fù)8次，以除去中土壤中殘留的氯仿[27-28]．滅菌后的土樣用無菌水調(diào)節(jié)含水量至土壤飽和含水量的60%．

輻射滅菌： 將待滅菌的土樣平鋪于自封袋中，接受鈷-60(60Co)放射源(上海市核銘輻射科技有限公司)的照射，每次照射劑量為30kGy，每次滅菌后在無菌臺上將土樣轉(zhuǎn)移回150mL培養(yǎng)瓶中，并用無菌水調(diào)節(jié)含水量至土壤飽和含水量的60%．

1.3 滅菌后土樣培養(yǎng)、土壤微生物量及土壤呼吸的測定

土壤培養(yǎng)： 將空白對照和滅菌處理組的土壤樣瓶用橡皮塞密封后放入恒溫水浴槽中(DC-0530，上海比朗儀器)，新鮮空氣經(jīng)帶濾菌裝置的分配系統(tǒng)均勻地流通至每一個樣瓶中，空氣流速約為700mL/min，所有樣品均于25℃下恒溫培養(yǎng)[29-30]．

土壤微生物生物量碳(Microbial Biomass Carbon, MBC)含量的測定： 采用氯仿熏蒸浸提法[31]，土樣經(jīng)過熏蒸浸提離心后，將上清液過濾置于試管內(nèi)，稀釋10倍后用TOC儀測定土樣溶液中的碳含量，并根據(jù)各土樣對應(yīng)的土壤含水量計算土壤微生物生物量碳含量．

土壤微生物量碳的計算公式：

wMBC=ΔEC/kC，

(1)

其中wMBC為土壤微生物量碳含量(mg·kg-1)，ΔEC為熏蒸與未熏蒸土壤有機碳含量的差值，kC為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.38．

土壤呼吸測定： 待培養(yǎng)溫度穩(wěn)定后，開始測定土壤呼吸．關(guān)閉通氣閥門，立即用注射器在每個待測樣瓶中抽取5mL樣氣．密閉培養(yǎng)瓶一定時間后再次抽取各樣瓶中的氣體5mL，針對不同的土樣和處理情境，通過預(yù)實驗來確定各自的密閉時間．取樣結(jié)束后打開通氣閥門恢復(fù)系統(tǒng)通氣狀態(tài)，直至下一次取樣．抽取的氣體樣品用氣相色譜儀(Agilent Technologies, Inc)測定其中的CO2濃度．根據(jù)密閉前后所抽取的樣氣中的CO2濃度差值計算土壤的呼吸速率．

土壤樣品呼吸速率的計算公式為：

(2)

其中：Rs為土壤呼吸速率(μmol·g-1·h-1)；22.4為標準狀態(tài)下(273.2K，1013kPa)氣體的摩爾體積(L/mol)；P為取氣樣時培養(yǎng)瓶內(nèi)的氣壓(kPa)；P0和T0分別為標準狀態(tài)下空氣的絕對氣壓(kPa)和絕對溫度(K)；T為取氣樣時培養(yǎng)瓶內(nèi)的絕對溫度(K)；ΔC為CO2濃度(mg/m3)在密閉時間內(nèi)的增加值： Δt為密閉時間(h)；V為培養(yǎng)瓶內(nèi)的空氣體積(L)；M為培養(yǎng)土樣的干重(g)．

土壤樣品呼吸變化率計算公式為：

Rc=R1/R0，

(3)

其中：Rc表示滅菌后土樣呼吸的變化率；R1為滅菌處理后的土壤呼吸速率(μmol·g-1·h-1)；R0為空白對照組的土壤呼吸速率(μmol·g-1·h-1)．

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究采用單因素方差分析氯仿熏蒸滅菌后土壤微生物量與微生物活性變化之間的關(guān)系、不同滅菌方式處理下土壤呼吸變化率及高溫高壓3次滅菌后土壤呼吸速率．所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS 13.0完成，所有數(shù)據(jù)作圖均采用Sigmaplot 12.0完成．

2 結(jié) 果

2.1 氯仿熏蒸滅菌后土壤微生物量碳及土壤微生物活性的變化

表2 土壤經(jīng)氯仿熏蒸滅菌后的土壤MBC含量Tab.2 Soil wMBC values after sterilization treatments by Chloroform fumigation method

對沈陽森林土樣進行氯仿熏蒸滅菌，改變滅菌次數(shù)及滅菌間隔天數(shù)，各種處理的wMBC值見表2．當滅菌間隔為1d時，隨著滅菌次數(shù)的增加滅菌后wMBC值逐漸依次減小，且在第3次滅菌后wMBC值達到了3次滅菌后的最小值98．

當滅菌間隔為3d時，前2次滅菌后wMBC顯著減小且2者間無顯著性差異(P>0.05)，平均約為359，第3次滅菌后土壤wMBC值略有增加，但仍小于對照組．

圖1 氯仿熏蒸滅菌處理下土壤呼吸變化率Fig.1 Changes of soil respiration rate after Chloroform fumigation sterilization

圖1為沈陽森林土樣經(jīng)氯仿熏蒸滅菌后微生物的呼吸變化率．當滅菌間隔為1d時，僅有第2次滅菌后土壤呼吸低于對照組，呼吸變化率介于0～1.0之間，與對照組的比值約為0.73．而第1次及第3次滅菌后土壤呼吸均高于對照組，平均約為對照組的2.57倍．當滅菌間隔為3d時，3次滅菌后土壤呼吸均高于對照組，平均約為對照組的3.85倍．其中第3次滅菌后土壤呼吸增加程度最小，第2次滅菌后土壤呼吸增加程度最大．結(jié)果顯示，氯仿熏蒸滅菌并未有效降低土壤微生物活性，反而在短時間內(nèi)使微生物的活性顯著增強．

2.2 不同滅菌處理后土壤呼吸的變化

在滅菌間隔為1d的處理下，高溫高壓滅菌處理后的土壤呼吸速率最低，與對照組比值平均約為0.12．氯仿熏蒸滅菌后，除沈陽森林土樣在第2次滅菌后的土壤呼吸低于對照外(圖2-A)，其余所有土樣每次滅菌后的土壤呼吸均高于對照，約為對照組的14.99倍．輻射滅菌處理下，除沈陽森林、撫順農(nóng)田土樣在第2次、第3次滅菌后(圖2-A、2-B)的土壤呼吸變化率介于0～1.0之間外，其余所有土樣每次滅菌結(jié)束后的土壤呼吸變化率均大于1.0，平均約為對照組的6.56倍．

圖3是在滅菌間隔為3d的處理下，采用不同滅菌方法滅菌后土壤呼吸的變化．高溫高壓滅菌后的所有土壤樣品的呼吸均顯著降低，且低于各自的未滅菌對照組，與對照組的比值平均為約0.12．氯仿熏蒸后所有土壤的呼吸均顯著高于對照，平均約為未滅菌對照組土壤的4.5倍．輻射滅菌處理下，除撫順農(nóng)田土樣(圖3-B)在第2次、第3次滅菌后的土壤呼吸低于對照組外，其他處理的土壤呼吸變化率均顯著高于對照組，平均約為對照組的5.11倍．

在滅菌間隔為5d的處理下(圖4，)，高溫高壓滅菌處理后各土壤樣品的呼吸均顯著降低，與對照組平均呼吸的比值約為0.21．氯仿熏蒸和輻射處理后的土壤呼吸均顯著高于對照組，呼吸速率分別為對照組平均值的4.8倍和3.8倍．

圖2～圖4的結(jié)果表明，當利用氯仿熏蒸滅菌和輻射滅菌時，以土壤呼吸表征的微生物活性并沒有降低，反而在短期內(nèi)顯著增加．高溫高壓蒸汽方法的滅活效果最好，土壤呼吸速率平均降低為對照組的18%．滅活的效果與土壤特性有關(guān)，但與滅菌處理沒有明顯的相關(guān)．堿性土壤對CO2有吸收作用，經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌后殘留的微生物呼吸強度低，使得滅菌后土壤呼吸的測量值很小甚至為負值．土壤的微生物呼吸不可能為負值，所有的測量負值均未呈現(xiàn)在圖2-D、圖3-D、圖4-D中．而崇明森林土樣的微生物呼吸本底值較高，經(jīng)過高溫高壓滅菌后測得的殘留物呼吸均為正值(圖2-C、圖3-C、圖4-C)．

圖2 不同滅菌方式下間隔為1d時土壤呼吸變化率Fig.2 Rc of sterilized soil over control by different techniques with one day interval of sterilizationA為沈陽森林土樣；B為撫順農(nóng)田土樣；C為崇明森林土樣；D為崇明農(nóng)田土樣.

圖3 不同滅菌方式下間隔為3d時土壤呼吸變化率Fig.3 Rc of sterilized soil over control by different techniques with three days interval of sterilizationA為沈陽森林土樣；B為撫順農(nóng)田土樣；C為崇明森林土樣；D為崇明農(nóng)田土樣.

圖4 不同滅菌方式下間隔為5d時土壤呼吸變化率Fig.4 Rc of sterilized soil over control by different techniques with five days interval of sterilizationA為沈陽森林土樣；B為撫順農(nóng)田土樣；C為崇明森林土樣；D為崇明農(nóng)田土樣.

2.3 高溫高壓蒸汽滅菌對土壤微生物的滅活效果

表3是不同土壤用高溫高壓滅菌處理時采用不同的滅菌次數(shù)與間隔下土壤呼吸的變化．在3次滅菌過程中，當滅菌間隔為1d時，森林土樣第3次滅菌后、農(nóng)田土樣第2次滅菌后的土壤呼吸變化率達到了最小值．當滅菌間隔為3d時，沈陽森林、崇明森林及撫順農(nóng)田土第2次滅菌后、崇明農(nóng)田土樣第3次滅菌后的土壤呼吸變化率達到了最小值．當滅菌間隔為5d時，沈陽森林土樣第3次、撫順農(nóng)田土樣第2次滅菌后的土壤呼吸變化率達到最小值，而崇明兩種土樣第1次滅菌后的土壤呼吸變化率就已達到最小值．滅菌間隔和滅菌次數(shù)對微生物滅活效果沒有顯示系統(tǒng)性的顯著影響．

表3 高溫高壓滅菌方法中不同間隔、次數(shù)處理下的土壤呼吸變化率Tab.3 Rc of High temperature and high pressure sterilization method in different intervals, numbers of treatment

圖5為高溫高壓滅菌3次處理后，土樣呼吸在5d內(nèi)的變化．沈陽森林土樣在滅菌間隔為1d、3d處理下，滅菌后的5d內(nèi)土壤呼吸值持續(xù)低于未滅菌的土壤；在滅菌間隔為5d處理下，滅菌后的土壤呼吸值則在第3d時就出現(xiàn)大幅度的增加且高于未滅菌土壤．撫順農(nóng)田土樣在滅菌間隔為1d處理下，滅菌后的5d內(nèi)土壤呼吸值持續(xù)低于未滅菌土壤．而在滅菌間隔為3d、5d的處理下，滅菌后的土壤呼吸值均在第4d出現(xiàn)大幅度增加．對于崇明兩種類型土樣，無論何種滅菌間隔處理，滅菌后的土壤呼吸值均在第3d時出現(xiàn)大幅度增加且高于未滅菌的土壤．

圖5 高溫高壓3次滅菌結(jié)束后土壤的變化Fig.5 The variations of soil respiration after 3 times of steam sterilizationA為沈陽森林土樣；B為撫順農(nóng)田土樣；C為崇明森林土樣；D為崇明農(nóng)田土樣.

3 討 論

3.1 氯仿熏蒸滅菌后土壤微生物量與微生物活性的變化關(guān)系

土壤微生物量碳是土壤微生物生物量的重要組成成分，是目前通用的微生物定量指標．本研究結(jié)果表明，當滅菌間隔為1d時，氯仿熏蒸滅菌后土壤wMBC隨著滅菌次數(shù)的增加而逐漸減少，但是仍有相當數(shù)量的微生物量存在，表明目前研究中常用的一次熏蒸滅菌法可能顯著低估了土壤微生物的生物量．雖然這種低估可能通過kC的取值得到部分抵消，但是在不同土壤和不同的情境下，測定結(jié)果的不確定性增大，且難以估算．滅菌處理后，土壤微生物活性隨著滅菌次數(shù)的增加呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢．當滅菌間隔為3d時，滅菌土壤微生物量隨著滅菌次數(shù)的變化呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，且均持續(xù)低于對照組，但土壤微生物活性的變化卻呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢．說明氯仿熏蒸滅菌處理下，土壤微生物量的降低并不代表土壤微生物活性的降低，單純從土壤微生物量的角度觀測分析滅菌效果是不具有說服力的．

3.2 不同滅菌方法對土壤微生物的滅活效果

本研究結(jié)果表示，改變滅菌次數(shù)及滅菌間隔天數(shù)，土壤在各滅菌方法處理下所達到的微生物滅活效果存在一定的差異．相比于其他的兩種滅菌方法，高溫高壓滅菌能使滅菌后的土壤呼吸處于較低水平，具有較好的土壤微生物滅活效果．但是，目前常用的幾種土壤滅菌方法，都難以使土壤微生物的活性降低到可忽略的程度．如果采用滅菌與未滅菌對照的途徑確定微生物活性與貢獻，會使結(jié)果產(chǎn)生偏差．

3.3 高溫高壓滅菌的滅菌間隔與滅菌次數(shù)對土壤微生物滅活效果的影響

本研究中，在滅菌間隔為1d的處理下，森林土樣與農(nóng)田土樣分別在3次、2次高溫高壓蒸汽滅菌后才達到較好的滅活效果．Wolf等[6]及Carter等[21]曾用高溫高壓滅菌法對3種土壤進行連續(xù)滅菌，實驗中設(shè)置了不同的滅菌次數(shù)，并對每次滅菌結(jié)束后土樣中真菌和細菌數(shù)量的進行測定，發(fā)現(xiàn)需要2次甚至3次滅菌處理才能使待滅菌土壤中的真菌和細菌有效地被除去，這與本實驗中的結(jié)果相一致．這是由于在高溫高壓滅菌的過程中，樣品在容器中很難達到完全分布均勻的狀態(tài)，所以當滅菌時間間隔較短時，需要進行多次滅菌才能較好的將土壤中絕大多數(shù)的微生物消除．

在滅菌間隔為3d的處理下，多數(shù)土樣在滅菌2次后就能達到較好的滅菌效果．表明雖然多次滅菌可以在一定程度上達到較好的滅菌效果，但是土壤中的大部分的微生物可能處于芽孢或休眠的狀態(tài)，此時微生物對高溫高壓處理有很強的抗性，短時間內(nèi)即使連續(xù)多次滅菌也不能完全將這些微生物殺死[32]．若2次滅菌之間存在一定的時間間隔時，土壤中這些休眠的微生物會在此時間內(nèi)轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)，在接下來的滅菌處理中才會被除去．不同來源的土壤所需最適滅菌間隔天數(shù)可能會有所不同，沈陽森林土樣及所有崇明土樣在滅菌間隔為3d的處理下，2次滅菌后能達到較好的滅菌效果，撫順農(nóng)田土樣則需要在滅菌間隔為5d的處理下，2次滅菌后能達到較好的滅菌效果．

當滅菌間隔為5d時，崇明土樣第1次滅菌后的土壤呼吸速率最低，而后續(xù)滅菌處理的效果反而不如第1次滅菌的效果好．Tuominen[9]通過平板計數(shù)法檢測到高溫高壓滅菌結(jié)束后土壤微生物數(shù)量確實有所減少，但被殺死的土壤微生物會使土壤中的DOC(可溶性有機碳)含量顯著增加[33]．此外高溫高壓滅菌方法對土壤的性狀有所改變，同時會使土壤中可利用的微量營養(yǎng)元素增加[6]，這些因素可能會增加土壤底物的可利用性[34]．實際上，所有方法的滅菌處理都會引起土壤底物有效性的增加，只是高溫高壓蒸汽法表現(xiàn)相對明顯．Wang[35]指出在特定的條件下，土壤呼吸受土壤底物可利用性的控制會比受土壤微生物數(shù)量的影響更加顯著．如果2次滅菌處理間隔過長，會導(dǎo)致微生物得到較大程度地恢復(fù)，第1次滅菌后未殺死的處于休眠態(tài)的土壤微生物不僅能在滅菌間隔期間恢復(fù)活性，且滅菌后土壤底物可利用性增加還會促使這部分微生物及其余殘留微生物快速增長，使土壤中微生物數(shù)量大幅上升，導(dǎo)致后續(xù)滅菌效果沒有第1次滅菌后的效果顯著．在這種情形下，2次滅菌的間隔為5d可能過長，易使土壤中殘留微生物得以較大程度的恢復(fù)．

3.4 高溫高壓滅菌后微生物滅活效果的持久性

一般而言，滅菌處理對土壤微生物的滅活效果只能持續(xù)有限的一段時間，其后土壤微生物的活性和種群便會逐漸恢復(fù)．滅活效果持續(xù)時間的長短與很多因素有關(guān)，土壤中未被殺滅微生物/休眠態(tài)孢子體數(shù)量、營養(yǎng)底物的有效性以及土壤性狀(如pH、有機質(zhì)含量及DOC含量等)都可能影響到滅活效果的持續(xù)時間．原則上，有機質(zhì)含量高的土壤，高溫高壓滅菌后活性有機質(zhì)增加對微生物的影響可能相對較小，而有機質(zhì)本底較低的土壤，滅菌處理引起的活性有機質(zhì)增加對微生物的恢復(fù)可能會有較顯著的作用．本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3次高溫高壓滅菌后，沈陽森林、撫順農(nóng)田兩種土樣在滅菌后的5d中能維持相對較低的呼吸水平(滅菌間隔為5d的沈陽森林土樣的有效滅活效果只能維持2d)．崇明兩種土樣在采用不同滅菌間隔的3次滅菌后，土壤呼吸值在第3d時均出現(xiàn)大幅增加且高于未滅菌土壤，滅菌效果維持的時間較短．有研究指出，土壤若酸堿性不同，土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成會有一定的差異．以K策略為主的微生物如土壤真菌、放線菌等多存在于酸性土壤中[36]，當高溫高壓蒸汽滅菌處理時，這些酸性土壤中的真菌、放線菌較易被除去，從而使滅菌后在一定時間內(nèi)能維持較低的呼吸水平．以R對策生長為主的細菌在堿性土壤中比例較高且生長效果更好，它們對于高溫高壓的抗性更加強烈．滅菌處理使土壤中營養(yǎng)底物的有效性在短時間內(nèi)顯著增加，R對策微生物會利用這些營養(yǎng)底物，在短時間內(nèi)大量繁殖，微生物的整體活性很快會恢復(fù)并超過原初狀態(tài)[37-39]．我們的研究表明，崇明兩種呈堿性的土樣在滅菌后的微生物活性雖然顯著降低(圖5-C,D)，但維持時間很短．雖然高溫高壓蒸汽滅菌相比較其他常用滅菌方法更有效，但無論對實驗中何種土壤，都只能在一個非常有限的時間內(nèi)維持低的土壤微生物活性．我們建議，在相關(guān)研究中，對滅菌土壤的所有測試分析應(yīng)在滅菌處理后2d內(nèi)完成，否則可能會對研究結(jié)果帶來較大偏差．

4 結(jié) 論

1) 經(jīng)常規(guī)滅菌處理后土壤微生物量的減少并不代表土壤微生物活性程度的降低，通過觀測滅菌后土壤微生物量及其變化來判斷土壤滅菌效果不夠準確．

2) 基于滅菌處理后土壤微生物活性的變化，高溫高壓蒸汽滅菌比常規(guī)氯仿熏蒸和輻射滅菌方法有更好的效果．氯仿熏蒸和60Co射線照射雖然有可能殺滅大多數(shù)土壤微生物活體，但處理后的土壤微生物整體表觀活性并未有效降低．

3) 采用高溫高壓蒸汽滅菌，滅菌次數(shù)與滅菌間隔對土壤微生物的滅活效果有顯著影響．在實際應(yīng)用中，建議采用2次滅菌處理，2次處理的時間間隔為3d．

4) 堿性土壤的微生物有效滅活效果的持續(xù)時間在2d左右，酸性土壤可能稍長．在相關(guān)研究中，對土壤滅菌效果的分析研究以不超過2d為佳．

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TheEffectsofDifferentSoilSterilizationTreatmentsonSoilMicrobialActivity

ZHENGJiahui,CHENHongyang,LIJinquan,NIEMing,FANGChangming

(InstituteofBiodiversityScience,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Soil sterilization is important in researches of soil ecology, microbiology and other relevant areas. The efficiency of soil sterilization affects greatly the reliability of subsequent research. However, there are still large uncertainties in how to assess soil sterilization efficiency of different techniques. In this study, we used three common methods of soil sterilization at present, i.e. high-temperature and high-pressure steaming, chloroform fumigation and radiation, to sterilize soils taken from forests and croplands. Variations of soil respiration before and after sterilization with different sterilization times and intervals were monitored. Our result indicated that (1) after sterilization by chloroform fumigation, soil microbial respiration did not decrease with the reduced soil microbial biomass, suggesting that changes of soil microbial biomass alone could not appropriately reflect sterilization efficiency, neither microbial contribution to soil ecological processes; (2) High-temperature and high-pressure steaming could achieve a better inactivation of soil microbes than chloroform fumigation and radiation techniques. For achieving a best result of soil sterilization with high-temperature and high-pressure steaming technique, we recommended to sterilize soil 2 times with high-temperature and high-pressure steam with a time interval of 3 days, and to complete follow-on studies within 2 days after soil sterilization.

soil sterilization; soil microbial activity; soil microbial biomass; times of sterilization; time interval of sterilization

0427-7104(2017)06-0681-11

2017-03-21

國家自然科學(xué)基金(31670491)；上海浦江學(xué)者計劃(16PJ1400900)

鄭嘉慧(1991—)，女，碩士研究生；方長明，男，教授，通信聯(lián)系人，E-mail： cmfang@fudan.edu.cn.

Q148

A