陸 清 薛曉紅

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院乳腺病科，上海200437）

乳腺癌發(fā)病率逐年上升，目前乳腺癌的治療主要包括手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及中醫(yī)中藥治療，其中內(nèi)分泌治療是激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者重要的全身治療手段之一。三苯氧胺（又名他莫昔芬，tamoxifen，TAM）是絕經(jīng)前激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療的首選藥物，但TAM耐藥現(xiàn)象限制了療效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳癌術(shù)后方能降低乳腺癌患者術(shù)后的5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[1]，提高5年的無病生存率以及總生存率[2]。為初步探討乳癌術(shù)后方在拮抗乳腺癌TAM耐藥中的作用，本研究構(gòu)建乳腺癌TAM耐藥細(xì)胞株（MCF-7/TAM），予不同含藥動(dòng)物血清干預(yù)后，以噻唑藍(lán)（MTT）法觀察各組含藥血清對(duì)MCF-7/TAM細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）由美國(guó)ATCC細(xì)胞保存中心提供；SD大鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證編號(hào)：2008001667161，體重（180±20）g，雌性，12只。

1.2 藥物與試劑 青霉素溶液、鏈霉素溶液、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自上海久億化學(xué)試劑有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；TAM由復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：161201；乳癌術(shù)后方（黃芪、黨參、炒白術(shù)、茯苓、南沙參、枸杞子、仙靈脾、肉蓯蓉、巴戟天、石見穿、莪術(shù)、蜂房），藥物飲片來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；生物倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；通風(fēng)櫥（蘇州億達(dá)公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；振蕩器（上海滬西分析儀器廠）；立式壓力鍋（上海博訊公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海圣欣公司）；分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；酶標(biāo)儀（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；紫外光度儀、分光光度計(jì)（日本島津公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立耐TAM細(xì)胞株（MCF-7/TAM） 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在常規(guī)加有10%進(jìn)口胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)。以終濃度為5×10-6mol/L的TAM培養(yǎng)基沖擊處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)24h后棄去含藥培養(yǎng)基，胰酶消化，以1×105/mL細(xì)胞濃度接種于新培養(yǎng)瓶中，次日換液，待其逐漸長(zhǎng)至70%～80%滿瓶時(shí)再次沖擊，如此反復(fù)沖擊，持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月以上，并同時(shí)進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，反復(fù)凍存、復(fù)蘇、觀察細(xì)胞株的穩(wěn)定性。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，配制成濃度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液（每孔3×103個(gè)細(xì)胞）。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用完全培養(yǎng)基稀釋TAM至所需濃度，每孔加入100μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，進(jìn)行MTT染色，λ=490nm，測(cè)定OD值，計(jì)算各組抑制率。通過各組抑制率應(yīng)用SPSS 17.0概率單位加權(quán)回歸法計(jì)算半抑制濃度（IC50）。

2.3 制備大鼠含藥血清 取雌性SD大鼠12只，進(jìn)行卵巢去勢(shì)手術(shù)。手術(shù)1周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、TAM組、中藥組和TAM+中藥組，每組3只。

取乳癌術(shù)后方藥物（黃芪30g，黨參12g，炒白術(shù)9g，茯苓12g，南沙參15g，枸杞子15g，仙靈脾15g，肉蓯蓉12g，巴戟天12g，石見穿30g，莪術(shù)30g，蜂房12g），按照人與大鼠等效劑量的換算系數(shù)為6（按照人體重60kg，大鼠0.2kg）計(jì)算，大鼠等效劑量=臨床常用量（g/kg）×6。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乳癌術(shù)后方2倍劑量對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞的抑制作用最佳，所以計(jì)算出的大鼠所需藥物總量要乘以2。將中藥按此藥量配備，一起置于煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材5倍量的冷水浸泡2h，煎煮30min后過濾，藥渣再加3倍量的水，繼續(xù)煎煮30min后過濾，合并2次中藥濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。配置TAM，0.1mg/mL。

對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水，TAM組大鼠灌胃TAM水溶液，中藥組大鼠灌胃中藥煎劑，TAM+中藥組大鼠灌胃TAM水溶液+中藥煎劑。各藥物用量均為2mL/次，2次/d，連續(xù)3d。于末次灌胃后1h，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，經(jīng)56℃、30min滅活后，過濾除菌，-80℃保存。

2.4 MTT法測(cè)定各組藥物對(duì)MCF-7/TAM細(xì)胞株的抑制作用 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液（每孔3×103個(gè)細(xì)胞）；將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，次日按照組別加入相應(yīng)的藥物血清，然后分別培養(yǎng)2、4、6、8、10d；將96孔板進(jìn)行MTT染色，λ=490nm，測(cè)定OD值；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MCF-7/TAM細(xì)胞系的建立及其耐藥性 MCF-7細(xì)胞呈多邊形，貼壁生長(zhǎng)，2～3d傳代1次；MCF-7/TAM細(xì)胞呈多邊不規(guī)則形，貼壁生長(zhǎng)，2～3d傳代1次。見圖1。通過MTT法測(cè)得不同濃度TAM作用下MCF-7、MCF-7/TAM的抑制率，見圖2。應(yīng)用SPSS 17.0通過概率單位加權(quán)回歸法（Bliss法）計(jì)算IC50，得MCF-7/TAM細(xì)胞的耐藥指數(shù)為8倍（見表1）。

圖1 MCF-7、MCF-7/TAM細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖2 TAM對(duì)MCF-7、MCF-7/TAM體外增殖的抑制作用

表1 TAM對(duì)MCF-7、MCF-7/TAM體外增殖的半抑制濃度（IC50）及耐藥指數(shù)

3.2 MTT法觀察各組含藥血清對(duì)MCF-7/TAM細(xì)胞株的抑制情況 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見圖3。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)比較見表2。培養(yǎng)2d時(shí)，各組細(xì)胞OD值比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；4d時(shí)TAM組、TAM+中藥組細(xì)胞OD值明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），TAM組和TAM+中藥組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.310），中藥組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.120）；培養(yǎng)6、8、10d時(shí)TAM+中藥組、TAM組、中藥組OD值均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），且TAM+中藥組、TAM組、中藥組OD值依次增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果說明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中藥逐漸發(fā)揮作用，其與TAM連用較單用藥組更能抑制MCF-7/TAM細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

表2 各組MCF-7/TAM細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后各時(shí)間點(diǎn)OD值比較

4 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[3]，每年全世界約有130萬(wàn)人被診斷為乳腺癌，約40萬(wàn)人死于該病。約50%的絕經(jīng)前激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者出現(xiàn)對(duì)TAM的原發(fā)性抵抗，30%至40%的患者在治療期間出現(xiàn)繼發(fā)性抵抗[4]，大大限制了TAM的應(yīng)用，不利疾病的治療。目前認(rèn)為與TAM耐藥有關(guān)的機(jī)制較多[5-7]，但西醫(yī)針對(duì)不同生物靶目標(biāo)的抑制劑目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，臨床上缺乏有效的逆轉(zhuǎn)TAM耐藥的藥物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方與TAM聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用[8-10]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，疏肝益腎方可抑制TAM耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）的增殖[11]，增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性[12]。樸瑩等[13]通過實(shí)驗(yàn)研究證明中藥人參皂苷Rg3具有延緩乳腺癌發(fā)生TAM耐藥的功效。

陸德銘教授認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)生與正氣不足、邪毒留滯有關(guān)[14]，又將乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移原因歸納為氣陰兩虛、沖任失調(diào)、余毒未盡，并以扶正祛邪為法則組成了乳癌術(shù)后方。方中黃芪、黨參益氣扶正，茯苓、白術(shù)健脾益氣，南沙參、枸杞子滋陰益腎，仙靈脾、肉蓯蓉、巴戟天溫腎助陽(yáng)，莪術(shù)、石見穿、蜂房活血解毒。全方具有益氣養(yǎng)陰、調(diào)攝沖任、活血解毒作用。實(shí)驗(yàn)研究提示此方有抑制乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用[15]。但乳癌術(shù)后方是否通過拮抗TAM耐藥提高臨床療效目前尚未有研究涉及。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中藥乳癌術(shù)后方逐漸發(fā)揮拮抗TAM耐藥的作用，其與TAM聯(lián)用較單用TAM更能抑制MCF-7/TAM細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示乳癌術(shù)后方與TAM聯(lián)用對(duì)乳腺癌TAM耐藥細(xì)胞株有協(xié)同作用。但本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了體外研究，下一步將建立裸鼠移植瘤模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證乳癌術(shù)后方拮抗乳腺癌TAM耐藥的作用，并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討，以為中醫(yī)藥防治乳腺癌提供有力的依據(jù)。

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