方長英，朱傳衛(wèi)，余良河，何勇勇*

鞘氨醇激酶1在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

方長英1，朱傳衛(wèi)1，余良河2，何勇勇1*

（1.安徽省宣城中心醫(yī)院檢驗科，安徽 宣城 242000；2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院肝外六科）

目的：探討原發(fā)性肝癌組織中鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用Real-time PCR和免疫組化檢測252例原發(fā)性肝癌患者癌組織和癌旁組織中SPHK1的表達(dá)水平，分析其對肝癌患者生存和復(fù)發(fā)的影響。結(jié)果：SPHK1蛋白在肝癌組織中陽性表達(dá)率為71.8%，而在癌旁組織中為11.1%（P＜0.01），高表達(dá)SPHK1蛋白的肝癌患者生存期較短（P=0.000）而復(fù)發(fā)率較高（P=0.025）。結(jié)論：SPHK1是肝癌的一個潛在分子靶點，有助于判斷患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后。

鞘氨醇激酶1；原發(fā)性肝癌；免疫組化；復(fù)發(fā)

原發(fā)性肝癌是世界上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年約60萬患者死于肝癌，其死亡率居于腫瘤第三位，嚴(yán)重威脅人類健康［1-2］。隨著科技的發(fā)展，腫瘤診療水平有所提高，然而只有三分之一的肝癌患者能夠進(jìn)行腫瘤切除［3］，并且術(shù)后效果并不理想，患者5年生存率只有17%～53%，復(fù)發(fā)率則高達(dá)70%［4-5］。因此，應(yīng)從原發(fā)性肝癌的分子機制上進(jìn)行研究，了解其發(fā)生和發(fā)展的過程，尋找一個潛在的分子治療靶點，提高肝癌患者生存率，降低復(fù)發(fā)率。鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）是細(xì)胞中一種蛋白酶，催化鞘氨醇轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崆拾贝?，產(chǎn)生的磷酸鞘氨醇與G蛋白耦聯(lián)受體中的磷酸鞘氨醇受體結(jié)合后［6］，會產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等［7-9］。眾多研究表明SPHK1能夠促進(jìn)腫瘤生長、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等［10-12］，高表達(dá)SPHK1的惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病、宮頸癌和鼻咽癌等患者有著較低生存率和較高復(fù)發(fā)率［13-18］。本文通過研究SPHK1在肝癌和對應(yīng)癌旁組織中表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與肝癌患者生存期和復(fù)發(fā)率關(guān)系，為臨床治療原發(fā)性肝癌提供一個潛在分子靶點。

1 資料與方法

1.1 病例資料 隨機收集2008年1月至2011年12月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外六科3個治療組行肝癌手術(shù)的450例原發(fā)性肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。術(shù)中所有腫瘤全部被切除，手術(shù)邊界距離腫瘤大于3 cm，術(shù)后病理證實為原發(fā)性肝癌且邊緣組織沒有腫瘤細(xì)胞，標(biāo)本置于液氮中保存。其中，252例原發(fā)性肝癌患者標(biāo)本符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前檢查顯示患者WHO評分為0～1分；（2）肝功能分級為Child A級；（3）患者術(shù)前未進(jìn)行化療、射頻消融和分子靶向治療等。（4）患者基本資料和病例資料完整，且全部進(jìn)行了隨訪。

1.2 Real-time PCR檢測肝癌組織和癌旁組織中SPHK1的表達(dá)水平 根據(jù)GenBank提供的基因序列，應(yīng)用Primer Express 3.0設(shè)計SPHK1引物，各引物序列、擴增片段長度見表1，由上海吉瑪科技公司合成。將肝癌組織和癌旁組織用新鮮的PBS清洗，剪碎后加入適量Trizol，按照說明書提取肝癌組織和癌旁組織RNA，使用分光光度計測量肝癌組織和癌旁組織RNA的濃度和純度。采用美國Gibco公司RevertAid First strand Cdnasynthsis試劑盒對樣本RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)條件為42℃條件下30 min，95℃條件下2 min，-20℃保存。Real-time PCR在ABI公司7300Real-time PCR儀完成，反應(yīng)體系為20μl，條件為：95℃ 變性30 s，隨后95℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72℃ 10 s，循環(huán)40次。實驗結(jié)果重復(fù)3次。

表1 Real-time PCR引物基本信息

1.3 免疫組化檢測252例原發(fā)性肝癌患者癌組織和癌旁組織中SPHK1蛋白的表達(dá)水平 使用英國Abcam公司生產(chǎn)的EnVisionTM+kit免疫組化試劑盒，按照說明書對組織進(jìn)行包埋切片，置于60℃烤箱10 h，隨后用二甲苯浸泡脫蠟和乙醇水合，再放入檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，BSA封閉后棄去，加一抗過夜，PBS清洗后加羊抗兔二抗，DAB顯色后顯微鏡下觀察染色程度，雙蒸水終止染色，蘇木紫復(fù)染，脫水、透明和封片后鏡檢。SPHK1蛋白陽性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞染色程度和陽性染色細(xì)胞率，染色程度分為1、2、3和4四個等級（1和2為沒有染色或染色極少代表陰性，3和4為染色較強代表陽性）；陽性染色細(xì)胞率為染色陽性細(xì)胞數(shù)目與總細(xì)胞數(shù)目的比值，分為0～19%、20%～39%、40%～60%、＞60%。最后，陽性率＜40%為SPHK1低表達(dá)，≥40%為SPHK1高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。SPHK1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，計量資料比較采用t檢驗，術(shù)后患者的生存和復(fù)發(fā)曲線采用Kaplan-Meier方法，生存和復(fù)發(fā)資料使用Cox模型進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織中SPHK1表達(dá)水平差異 Real-time PCR結(jié)果顯示肝癌組織中SPHK1基因表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，其表達(dá)量約為癌旁組織4倍（P＜0.01）；免疫組化的結(jié)果也顯示肝癌組織SPHK1蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織，分別為71.8%和11.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 SPHK1基因及SPHK1蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 SPHK1蛋白表達(dá)與肝癌病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性 SPHK1在肝癌組織中表達(dá)與包膜有無（P=0.045）、肝硬化（P=0.002）、腫瘤數(shù)目（P=0.003）和腫瘤分期（P=0.019）有關(guān)，見表2。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明SPHK1蛋白表達(dá)較高患者有較低生存率（P=0.000），見圖2A，高表達(dá)患者1年生存率為24.7%，3年生存率為6.3%；而低表達(dá)組1年生存率為59.3%，3年生存率為27.6%。并且高表達(dá)SPHK1蛋白患者復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)的原發(fā)性肝癌患者（P=0.025），見圖2B，高表達(dá)組1年復(fù)發(fā)率為93.9%，3年復(fù)發(fā)率為98.4%；低表達(dá)組1年復(fù)發(fā)率為78.9%，3年復(fù)發(fā)率為94.8%。

表2 SPHK1蛋白表達(dá)與肝癌病理參數(shù)的相關(guān)性

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析SPHK1蛋白在252例原發(fā)性肝癌組織的表達(dá)水平與患者總體生存率及復(fù)發(fā)率的關(guān)系

3 討論

本研究結(jié)果顯示原發(fā)性肝癌組織中SPHK1基因和蛋白表達(dá)量明顯高于對應(yīng)的癌旁組織，且SPHK1蛋白表達(dá)水平與腫瘤包膜有無、肝硬化、腫瘤的數(shù)目和臨床分期密切相關(guān)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明高表達(dá)SPHK1蛋白的原發(fā)性肝癌患者比低表達(dá)患者生存率低，1年生存率下降34.6%，3年生存率下降21.3%；同時高表達(dá)患者有著較高的復(fù)發(fā)率，1年復(fù)發(fā)率增加15%，3年復(fù)發(fā)率增加3.6%。本研究結(jié)果說明SPHK1的高表達(dá)在原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)SPHK1是一種癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成并抑制其凋亡。正常的NIH3T3成纖維細(xì)胞在SPHK1過表達(dá)的情況下發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化［19］。動物實驗證實SPHK1表達(dá)水平增高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，SPHK1抑制劑的使用可以抑制腫瘤生長［20-21］。Li等［22］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的SPHK1表達(dá)水平高于正常的癌旁組織，其表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，高表達(dá)SPHK1的胃癌患者5年生存率較低且復(fù)發(fā)率較高。此外，過表達(dá)SPHK1的腫瘤患者在化療的過程中容易產(chǎn)生耐藥性，如SPHK1蛋白升高的白血病患者在進(jìn)行阿霉素和足葉乙甙化療時產(chǎn)生抵抗［23］；前列腺癌細(xì)胞在SPHK1過表達(dá)的情況下使用喜樹堿化療時效果減弱［24］。臨床研究表明SPHK1抑制劑的使用可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，增強5-FU的化療敏感性［25］。

本研究結(jié)果顯示肝癌組織中SPHK1基因和蛋白表達(dá)顯著升高。Lu等［26］近期基礎(chǔ)研究結(jié)果表明肝癌細(xì)胞中SPHK1過表達(dá)使肝癌細(xì)胞的活性增加，羊藿素可抑制SPHK1蛋白活性，使肝癌細(xì)胞的活性下降并出現(xiàn)凋亡；動物實驗結(jié)果表明使用羊藿素可明顯抑制裸鼠體內(nèi)肝癌腫瘤生長。Li等［27］研究發(fā)現(xiàn)使用siRNA或FTY720阻斷SPHK1能顯著降低鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷移，增加其生長周期使癌細(xì)胞凋亡速度加快；臨床研究結(jié)果顯示高表達(dá)SPHK1腫瘤患者預(yù)后較差。SPHK1在肝癌中扮演著重要的角色，高表達(dá)SPHK1肝癌細(xì)胞惡性度增加；高表達(dá)SPHK1的肝癌患者生存率低而復(fù)發(fā)率高。

綜上所述，原發(fā)性肝癌組織中SPHK1高表達(dá)與惡性病理學(xué)特征密切相關(guān)，SPHK1蛋白是肝癌患者預(yù)后的一個有效標(biāo)志物和潛在分子治療靶點，為肝癌的分子靶向治療提供了研究基礎(chǔ)。

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Expression of Sphingosine Kinase 1 in Primary Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

FANG Changying1，ZHU Chuanwei1，YU Lianghe2，HE Yongyong1*
（1.Department of Clinical Laboratory，Xuancheng Central Hospital， Xuancheng 242000， China；2.Department Ⅵ of Hepatic Surgery，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，The Second Military Medical University）

Objective：To investigate the expression of sphingosine kinase 1 （SPHK1） in primary hepatocellular carcinoma tissues and its clinical significance.Methods：Real-time PCR and immunohistochemistry methods were used to detect the expression levels of SPHK1 in 252 cases of hepatocellular carcinoma tissues and paired normal tumor-adjacent tissues.The tumor recurrence and survival of the primary hepatocellular carcinoma patients were analyzed.Results：The positive expression rate of SPHK1 was 71.8%in primary hepatocellular carcinoma tissues，while 11.1%in paired adjacent tissues（P＜0.01）.The patients with high expression levels of SPHK1 protein had higher recurrence rate and poorer prognosis（P＜0.01 or 0.05）.Conclusion：SPHK1 may be a potential molecular target and helps to determine the patient's recurrence and prognosis.

sphingosine kinase 1；primary hepatocellular carcinoma；immunohistochemistry；recurrence

R735.7

A

1008-2344（2017）06-0473-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.004

何勇勇（1984—），男（漢），主管檢驗師.研究方向：腫瘤標(biāo)志物.E-mail：heyongyong84@sina.com

2016-06-26

（文敏編輯）