徐 超， 張紅巖， 楊鶴同， 席剛俊

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省句容市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇句容 212400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物[1]，具有很好的滋陰潤肺、抗衰老、抗腫瘤等功效。成年蘭科植物與真菌共生形成內(nèi)生菌根是自然界的一種普遍現(xiàn)象。菌根具有促進(jìn)植株生長、提高植株對(duì)干旱等逆境脅迫耐受能力的作用[2]，但是菌根的這種有益作用是否能夠得到充分發(fā)揮，決定于菌根真菌能否對(duì)宿主植物進(jìn)行有效侵染以及菌根真菌的作用效果[2-3]。本試驗(yàn)對(duì)不同接種處理鐵皮石斛的菌根形成狀況及其對(duì)改善鐵皮石斛促生、抗旱能力的作用效果進(jìn)行比較，進(jìn)而確定優(yōu)良的菌根真菌，以期為進(jìn)一步開展用菌根提高鐵皮石斛抗旱能力的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種的培養(yǎng)

供試真菌菌株為JSNL001、JSNL002、JSNL003、JSNL004、JSNL005、JSNL006、JSNL007、JSNL008，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)中心于2012年6月在野生鐵皮石斛植株根部組織內(nèi)分離得到，并保存在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。將保存的菌根真菌接種到PDA斜面上進(jìn)行活化；待長滿斜面后，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，在三角瓶?jī)?nèi)進(jìn)行搖床培養(yǎng)，制成液體菌劑；同時(shí)將該真菌轉(zhuǎn)接至棉籽殼培養(yǎng)基質(zhì)中，制成固體菌劑。

1.2 鐵皮石斛菌根化植株的培育

2012年8月，選用粉碎的松樹皮為育苗基質(zhì)，進(jìn)行高溫高壓滅菌2 h后，裝盆待用。將長勢(shì)基本一致的鐵皮石斛植株馴化苗進(jìn)行盆栽，每盆栽種1叢，每叢5株。菌劑的施用方式分為固體、液體2種處理。將制備好的液體菌劑、固體菌劑分別施用在基質(zhì)表面。其中固體菌劑的用量為5 g/盆，液體菌劑的用量為10 mL/盆。施用菌劑后，基質(zhì)相對(duì)含水量在60%以上維持10 d，以確保菌絲在基質(zhì)內(nèi)成活。對(duì)照處理植株(CK)的接種方式如下：以同樣的接種方式，將等量滅活菌劑接種于鐵皮石斛植株的基質(zhì)表面。

1.3 鐵皮石斛菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察與侵染程度的測(cè)定

接種12個(gè)月后，用酸性品紅染色法檢查鐵皮石斛菌根的形成狀況，并進(jìn)行顯微拍照。在每個(gè)處理中隨機(jī)抽取20株苗，采用顯微觀察法統(tǒng)計(jì)菌根感染率和感染指數(shù)。其中，菌根感染率以株為單位進(jìn)行計(jì)算。感染指數(shù)的計(jì)算方法為每株苗隨機(jī)選取5條1 cm長根段，共計(jì)100條根段，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)：0級(jí)，無根段感染或感染率在1%以下；Ⅰ級(jí)，感染根段比例為1%～20%；Ⅱ級(jí)，感染根段比例為21%～40%；Ⅲ級(jí)，感染根段比例為41%～60%；Ⅳ級(jí)，感染根段比例為60%以上[4]。

1.4 菌根對(duì)鐵皮石斛促生效果的比較

在接種后18個(gè)月時(shí)，測(cè)定不同處理鐵皮石斛的苗高、鮮質(zhì)量，觀察接種菌根真菌后各處理植株的生長狀況。每個(gè)處理測(cè)定50株。

1.5 不同處理菌根化鐵皮石斛抗旱能力的比較

選取不同處理的菌根化鐵皮石斛，統(tǒng)一進(jìn)行澆水，使每盆植株的基質(zhì)含水量達(dá)到飽和，然后在簡(jiǎn)易溫室內(nèi)模擬自然脅迫，使水分不斷消耗，在脅迫后10、20、30 d測(cè)定萎蔫度、萎蔫率。溫室內(nèi)溫度為30～35 ℃，空氣相對(duì)濕度為50%～60%。每個(gè)處理50株，設(shè)3個(gè)重復(fù)[4]。

按照以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鐵皮石斛的受旱程度進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，健康；Ⅰ級(jí)，少數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；Ⅱ級(jí)，半數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；Ⅲ級(jí)，半數(shù)以上葉片萎蔫；Ⅳ級(jí)，整株萎蔫。按以下公式統(tǒng)計(jì)各處理植株的萎蔫度和萎蔫率[5]：

萎蔫率=(萎蔫株數(shù)/處理株數(shù))×100%；

萎蔫度=[∑(萎蔫等級(jí)×株數(shù))×100]/(萎蔫最高等級(jí)×總株數(shù))。

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS(V13.0)進(jìn)行分析，不同小寫字母表示差異達(dá)0.05顯著水平。

1.6 鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌的鑒定

根據(jù)“1.4”“1.5”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳的鐵皮石斛菌根真菌。通過形態(tài)觀察、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，簡(jiǎn)稱ITS)序列分析等方法，對(duì)確定的鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌根真菌處理鐵皮石斛的菌根化程度比較

表1結(jié)果顯示，接種不同菌根真菌后，鐵皮石斛的菌根感染率均為100%。而菌根感染指數(shù)存在較大差異。其中接種JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株菌根感染指數(shù)較高，分別為91.25、97.50、95.00、96.25；接種JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006鐵皮石斛菌根感染指數(shù)稍低，分別為85.00、81.25、90.00、86.25；CK植株未見菌根化現(xiàn)象。

2.2 鐵皮石斛根部組織的菌根化狀況檢測(cè)

接種菌根真菌后，真菌菌絲能夠侵入鐵皮石斛的根部組織。菌根化與非菌根化植株的根部組織的外部形態(tài)沒有明顯區(qū)別，兩者之間的主要差異在于根組織內(nèi)是否有入侵的菌根真菌。鐵皮石斛菌根化以后，在根部細(xì)胞間隙中能見到菌絲，同時(shí)有分布不勻、形狀不一、著色較深的菌絲結(jié)(圖1)，并且經(jīng)再次分離后，得到了接種菌株。結(jié)果表明，接種菌根真菌后，鐵皮石斛的根部組織內(nèi)確實(shí)形成了菌根。

表1 各菌根真菌處理鐵皮石斛的菌根化程度

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.3 不同處理菌根化鐵皮石斛生長量的比較

本試驗(yàn)結(jié)果表明：接種不同菌根真菌對(duì)鐵皮石斛植株苗高和鮮質(zhì)量的作用效果存在較大差異。其中，接種JSNL004、JSNL003后，對(duì)鐵皮石斛的作用效果較為顯著，苗高增幅分別為10.94%、10.16%，鮮質(zhì)量增幅分別為8.78%、6.87%；其次是接種JSNL007、JSNL008的植株，苗高增幅分別為8.59%、10.16%，鮮質(zhì)量增幅分別為5.34%、3.82%；接種JSNL006的植株效果稍差；而接種JSNL001、JSNL002、JSNL005的植株效果明顯較差，接種后均對(duì)苗高或鮮質(zhì)量有不同程度的抑制作用(表2)。綜合以上結(jié)果可以看出，菌根真菌的作用效果排序依次為JSNL004>JSNL003>JSNL007、JSNL008>JSNL006>JSNL005>JSNL001>JSNL002。

表2 各菌根真菌處理鐵皮石斛的生長量比較

2.4 不同處理菌根化鐵皮石斛抗旱能力的比較

在干旱脅迫后10、20、30 d分別對(duì)不同菌根化鐵皮石斛的抗旱能力進(jìn)行比較，結(jié)果(表3)表明，不同菌根化鐵皮石斛間抗旱能力存在較大差異。在干旱脅迫過程中，接種JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006的植株和CK植株的萎蔫率、萎蔫度均較高，抗旱能力較差；接種JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株抗旱能力較強(qiáng)，在干旱脅迫30 d時(shí)，雖然萎蔫率也達(dá)到100%，但萎蔫度相對(duì)較低，分別為 42.4、40.1、43.4、42.3，顯著低于其他處理的植株。因此認(rèn)為，不同菌根化鐵皮石斛的抗旱能力排序?yàn)镴SNL004>JSNL008>JSNL003>JSNL007>JSNL002>JSNL005>JSNL001>JSNL006>CK。

2.5 優(yōu)良菌根真菌的鑒定

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)確認(rèn)的鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌JSNL004進(jìn)行鑒定。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察，JSNL004的菌落特征如下：在PDA平板上培養(yǎng)，菌絲致密，附于基物表面；正面為白色菌落邊緣全緣；反面白色至淡黃色，略有色素沉積(圖2)。PCR擴(kuò)增得到的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)全序列如下：

5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAG AGAAATCTTTCAACACTGAAAGATCTTTTCCTTTGTGCTGGCT TTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTTAAAATGGTTCGCAAGGG CCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAATTTTTTCTG AACAATTAAACAAAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA

TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGA

GGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACACCTAAC

CTTTGGGTTTATGGCGTGGAATTGGAATGCGCCGACTGTCATG

GTTGGCCCTTCTAAAATGTAGTTCTTGGCTGTCACCTAATACA

GCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGGCATTCATTGTCAAATCTTTGG

CTAACATTTGCTCCAGGAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACT

CATTCAAATTTTGATCTGAAATCAGGTAGGGCTACCCGCTGAA

CTTAAGCATATCAATAAGCG-3′。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定結(jié)果，確定優(yōu)良菌根真菌JSNL004為接合菌亞門毛霉目傘形霉屬矮小傘霉(Umbelopsisnana)。

表3 各菌根真菌處理鐵皮石斛抗旱能力的比較

3 結(jié)論與討論

不同菌根真菌對(duì)植物的感染率和感染指數(shù)影響較大，只有各種菌根真菌與宿主在可親和的條件下才能侵染成功，親和力愈強(qiáng)，形成菌根的狀況愈好，反之就愈差[6]。本研究表明，接種菌根真菌以后，鐵皮石斛能夠形成菌根，但不同菌根真菌的感染指數(shù)存在較大差異，其中，接種菌根真菌JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的感染指數(shù)都較高，均超過90%，這可能與各菌根真菌與鐵皮石斛間的親和力、不同菌根真菌的菌絲活力存在差異有關(guān)。宋微等研究發(fā)現(xiàn)，促生效果越好的菌根真菌，形成的菌根化植株對(duì)干旱脅迫的耐受性越強(qiáng)[7]。在本研究中，隨著脅迫程度的加劇，接種JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的鐵皮石斛依次表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，這4種菌根真菌對(duì)鐵皮石斛植株苗高的促生作用均較為明顯，但彼此之間對(duì)植株鮮質(zhì)量的影響存在較大差異，其中JSNL004對(duì)植株鮮質(zhì)量的影響最明顯。綜合不同菌根真菌對(duì)鐵皮石斛植株的感染指數(shù)、促生、抗旱等指標(biāo)的影響，認(rèn)為菌根真菌矮小傘霉(JSNL004)為適用于鐵皮石斛的優(yōu)良菌根真菌，可以為今后制備鐵皮石斛專用生物菌肥提供參考。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志(第19卷)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1999：117.

[2]金 輝，許忠祥，陳金花，等. 鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，33(3)：433-441.

[3]崔 虹，宋希強(qiáng). 菌根真菌對(duì)春石斛幼苗生長發(fā)育的影響[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(2)：20-23，32.

[4]徐 超. 外生菌根提高鐵皮石斛抗旱機(jī)理研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2010.

[5]徐 超，吳小芹. 菌根化馬尾松對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及其內(nèi)源多胺的變化[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29(2)：296-301.

[6]孫民琴. 松樹外生菌根的合成及其對(duì)松樹生長與抗性的影響[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2005.

[7]宋 微，吳小芹. 13種菌根真菌對(duì)松苗生長及耐旱性的影響[J]. 林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2009(4)：6-8.