王 哲 王文波

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

工藝·試驗(yàn)

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法快速測(cè)定護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量

王 哲 王文波

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，ESI離子源正離子模式選擇離子掃描模式對(duì)護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙進(jìn)行定量分析。五味子醇甲和五味子醇乙在一定范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，加樣回收率為98.41%和96.91%(n=6)。該方法快速、靈敏度高、選擇性好，適合測(cè)定護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的定量分析。

護(hù)肝片 五味子醇甲 五味子醇乙 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

護(hù)肝片是由柴胡、五味子、茵陳、板藍(lán)根、綠豆和豬膽粉六味中藥制成的中藥制劑，具有疏肝理氣，健胃消食的功能。具有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，可用于慢性肝炎及早期肝硬化。方中的五味子有補(bǔ)腎寧心，收斂固澀的功能。對(duì)藥品中五味子醇甲和五味子醇乙的測(cè)定，方法多以HPLC為主[1～3]，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定了護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量，采用選擇離子采集的模式，可以大大縮短測(cè)定時(shí)間，補(bǔ)充了護(hù)肝片含量測(cè)定方法，此方法簡(jiǎn)便，快捷，選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了方法。

1儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)沃特世公司ACQUITY超高效液相，Xevo G2 Q-TOF-MS質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理軟件)；超聲清洗儀KQ-500E(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore-Q型超純水制備儀；Mettler AE240電子天平。

1.2 試藥

五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)：161031)；五味子醇乙對(duì)照品(批號(hào)：160920)均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，實(shí)驗(yàn)用護(hù)肝片(鼎鶴牌)(批號(hào)：20160306、20160416、20160430)；乙腈為進(jìn)口Fisher試劑，水為超純機(jī)制水，其它試劑為分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱(chēng)取五味子醇甲和五味子醇乙對(duì)照品適量，加甲醇配制成每毫升含五味子醇甲0.300 0 mg、五味子醇乙0.100 0 mg的儲(chǔ)備液。

2.2 供試品溶液的配制

取護(hù)肝片20片，除去包衣，研細(xì)，取0.2 g，精密稱(chēng)定，加乙酸乙酯8 mL，加熱回流30 min，放冷過(guò)濾，用8 mL乙酸乙酯分次洗滌濾渣及容器，洗液與濾液合并，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

根據(jù)藥典護(hù)肝片的處方和制法，制出只含柴胡、茵陳、板藍(lán)根、綠豆和豬膽粉，不含有五味子的陰性樣品，再按上述方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱選用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm)，流動(dòng)相為梯度洗脫(A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液)：1-5 min，A-B(40∶60)；5-7 min，100%A；7-8 min，A-B (40∶60),流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL，柱溫為30 ℃。

2.5 質(zhì)譜條件

ESI源正離子模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑氣溫度350 ℃，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣容量600 L·h-1，采樣頻率0.1 s，間隔0.014 s，選擇離子采集模式，選擇分子離子峰的質(zhì)荷比分別為：五味子醇甲C24H32O7： [M+H-H2O]+(m/z415.212)，五味子醇乙C23H28O7：[M+H-H2O]+(m/z399.181)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1線性關(guān)系

分別吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液50、100、150、200、250、300 μL定容至1.0 mL，按所設(shè)UPLC-MS條件進(jìn)樣2 μL，以相應(yīng)的對(duì)照品的選擇離子色譜圖(見(jiàn)圖1，圖1用標(biāo)準(zhǔn)系列3的數(shù)據(jù)做的圖，即五味子甲素為45 μg·mL-1五味子乙素為15 μg·mL-1)中的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，測(cè)定進(jìn)樣質(zhì)量濃度與相應(yīng)質(zhì)譜峰面積的關(guān)系,求得它們的線性方程及相關(guān)系數(shù)。以最低檢出限和定量限信噪比S/N=3和S/N=10為原則，分別計(jì)算五味子醇甲和五味子醇乙的LOD和LOQ的值。五味子醇甲和五味子醇乙的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和范圍檢出限與定量限見(jiàn)表1。結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子醇乙的線性范圍好，靈敏度高。

圖1 五味子醇甲和五味子醇乙的選擇離子流色譜圖Fig 1 The SIR pictures of Schisandrin and Schisandrol B

2.6.2陰性實(shí)驗(yàn)

按前述的UPLC-MS條件進(jìn)樣陰性對(duì)照品溶液2 μL，在相同保留時(shí)間下的選擇離子色譜圖中未見(jiàn)相應(yīng)五味子醇甲和五味子醇乙的峰。

2.6.3精密度與準(zhǔn)確性

按前述的UPLC-MS條件對(duì)同一混合對(duì)照品重復(fù)測(cè)定6次，五味子醇甲和五味子醇乙的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別為1.27%和2.13%，說(shuō)明本方法較為準(zhǔn)確、可靠。

2.6.4重復(fù)性

取同一批護(hù)肝片樣品6份，各約0.200 0 g，精密稱(chēng)定，制備供試品溶液，依UPLC-MS條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙含量平均值分別為0.807 2和0.561 0 mg·g-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別為3.42%和2.07%，表明重復(fù)性良好，樣品的選擇離子色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 五味子醇甲和五味子醇乙標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定、LOD和LOQ檢測(cè)結(jié)果 .n=6Table 1 The results of linear regression，LOD and LOQ of Schisandrin and Schisandrol B.n=6

圖2 護(hù)肝片樣品的選擇離子流色譜圖(A、B分別為m/z415.212 和m/z399.181的選擇離子流圖)Fig 2 The SIR picture of Hugan Pian(A and B are the SIR of m/z415.212 and m/z399.181)

2.6.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h按UPLC-MS條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得五味子醇甲和五味子醇乙的峰面積的RSD(n=8)分別為3.15%和3.73%，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.6加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)定已知含量的護(hù)肝片粉末0.200 0 g共6份,按所稱(chēng)量的五味子粉末中的五味子醇甲和五味子醇乙含量的80，100，120%添加對(duì)照品溶液，每種比例各配制2份，配制供試品溶液，按UPLC-MS條件進(jìn)行測(cè)定?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子醇乙回收率良好。

表2 加樣回收率檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 2 The result of recovery test of the investigated compounds(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)量不同批次的護(hù)肝片粉末三份配制供試品溶液，依UPLC-MS條件測(cè)定，不同批次的護(hù)肝片五味子醇甲和五味子醇乙的含量見(jiàn)表3。

表3 不同批次護(hù)肝片中五味子醇甲和五味子醇乙的含量 mg·g-1(n=3)Table 3 Contents of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian of three batches .mg·g-1(n=3)

3結(jié) 論

對(duì)色譜條件進(jìn)行考察，包括乙腈-水和甲醇-水的不同配比和梯度洗脫，最終確定本實(shí)驗(yàn)色譜條件。該條件下的五味子醇甲和五味子醇乙色譜峰峰形好，相互之間無(wú)干擾，每針色譜條件僅需5 min即可完成，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。

分別對(duì)不同批次的護(hù)肝片進(jìn)行了五味子醇甲和五味子醇乙的含量比較，首次建立了以超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用選擇離子模式法測(cè)定這兩種木脂素的含量，為有效控制護(hù)肝片產(chǎn)品質(zhì)量提供了方法。

[1] 倪琳，楊錫.HPLC法同時(shí)測(cè)定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素[J].中成藥，2012,34(5):872～875.

[2] 馮華，張超云等.HPLC法測(cè)定棗仁安神片中五味子醇甲的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009,15(1)：82～83.

[3] 古海峰，張小茜等.HPLC法測(cè)定復(fù)方益肝靈片中五味子醇甲的含量[J].藥物分析雜志，2009,29(2):295～297.

DeterminationofContentsofSchisandrinandSchisandrolBinHuganPianbyUPLC-ESI-Q-TOF-MS

Wang Zhe Wang Wenbo

(Institute of Chemistry and Chemistry Engineering, Qiqihar University, Heilongjiang Qiqihar 161006)

Schisandrin and Schisandrol B were determined by UPLC-ESI-Q-TOF-MS. The linear relationship between the concentration and peak areas of the Schisandrin and Schisandrol B were all linear(r>0.999).The average recoveries(n=6) were 98.41% and 96.91%.The method was rapid，sensitive，selective and suitable for the quantitative analysis of Schisandrin and Schisandrol B in Hugan Pian.

Hugan Pian Schisandrin Schisandrol B UPLC-ESI-Q-TOF-MS

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.05.003

2017-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(81403067)；省自然科學(xué)基金(C2016059)。

王哲(1989～)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事天然藥物的研究，Email:zhew0316@163.com。