徐革鋒 牟振波 陳懷發(fā) 黃天晴 王炳謙 谷 偉戶 國 韓 英①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 哈爾濱 150070; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所 拉薩 850032;3. 黑龍江省水生動物資源增殖保護站 哈爾濱 150018; 4. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)系 哈爾濱 150030)

雌雄異體魚類的性別決定是由基因(遺傳)、環(huán)境或是兩者共同作用驅(qū)動(Devlin et al, 2002; Volff et al,2007; Penman et al, 2008)。在絕大多數(shù)哺乳動物中,雄性都是通過Y染色體遺傳的。Sry是第一個在哺乳動物 Y染色體上發(fā)現(xiàn)的基因, 已被證明是精巢分化與發(fā)育的必要條件(Koopman et al, 1990; Sinclair et al,1990), 在該基因被確定為主要性別決定基因的同時,也發(fā)現(xiàn)其他基因參與了性別分化的級聯(lián)調(diào)節(jié)(Brennan et al, 2004), 但Sry基因在其他物種的性別決定機制中尚未被發(fā)現(xiàn)(Capel, 2000; Graves, 2002),這表明性別決定機制在不同種類脊椎動物間不具有明顯的進化保守性。與性別決定相反, 決定魚類性別分化的相關(guān)基因和基因網(wǎng)絡(luò)顯示出高度的保守性,即使是不同種類(Munger et al, 2009; Herpin et al,2011; Piferrer, 2011)。與其他脊椎動物一樣, 魚類性腺有兩大功能, 即配子發(fā)生和類固醇激素合成, 性腺主要的合成產(chǎn)物是性甾體, 雄性激素包括睪酮(T)、11B-羥雄烯二酮和 11-酮基睪酮, 雌性激素主要是雌二醇(E2)。雄性激素和雌性激素分別與雄性和雌性的性腺分化有關(guān)。但雌激素主要是性分化和保持雌性特征的必要條件, 而雄激素目前認為是雄性分化的結(jié)果(Piferrer et al, 2012)。值得注意的是, 很多基因在兩性性腺分化中都存在, 只是表達程度不同。另外, 統(tǒng)計近些年的研究成果可知, 魚類性腺分化期大部分調(diào)控因子主要可以歸為以下幾類: 類固醇生成酶、性類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄因子和生長因子, 但隨著研究的深入還發(fā)現(xiàn)其他因子存在(Penman et al, 2008)。這些基因中, 類固醇性腺芳香化酶(Cyp19a1a)和轉(zhuǎn)錄因子Foxl2占據(jù)顯著地位。芳香化酶可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素, 該生理過程不可逆, 由此確保兩種激素的平衡。目前研究認為, 大部分非哺乳脊椎動物的雌性分化依賴 Cyp19a1a定向誘導(dǎo), 該反應(yīng)通過一個正反饋回路實現(xiàn), 主要調(diào)控基因為轉(zhuǎn)錄因子 Foxl2; 而在雄性分化中 Cyp19a1a的表達會被抑制(Guiguen et al,2010)。Wang 等(2010)的研究認為, 抑制 Cyp19a1a是通過增加Dmrt1實現(xiàn)的; 而轉(zhuǎn)錄因子在魚類種群間相對保守, 是 Cyp19a1a的調(diào)節(jié)器。大多遺傳型性別決定種類脊椎動物具有單一性別決定機制, 而Dmrt1的增量調(diào)節(jié)主要通過以下這個途徑實現(xiàn): 包括一個雄性主要決定基因或一個聯(lián)合基因 Sox9, 或者在多因子機制中通過幾種雄性促進基因的疊加效應(yīng)來實現(xiàn)(Piferrer et al, 2012)。

雄性虹鱒的三倍體(Lincoln et al, 1984; 韓英等,2010a)與二倍體性腺有相同的功能和形態(tài), 然而, 雌性三倍體虹鱒是一個例外, 盡管它們能夠存活, 但它們卵巢滯育。與二倍體卵巢相比, 三倍體虹鱒卵巢呈線狀, 并且缺少相應(yīng)數(shù)量的初級卵母細胞(Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。這說明三倍體虹鱒卵巢與精巢的發(fā)育存在著本質(zhì)區(qū)別。早期研究認為, 由于第三套染色體在配子形成過程中擾亂了初始減數(shù)分裂, 阻滯了卵原細胞的發(fā)育, 因此導(dǎo)致了三倍體虹鱒卵巢發(fā)育停滯(Krisfalusi et al, 1999)。韓英等(2010b)的研究還發(fā)現(xiàn), 在 17月齡左右時三倍體雌性虹鱒呈現(xiàn)類雄性化發(fā)育趨勢(卵巢出現(xiàn)了去分化、再分化的異?，F(xiàn)象), 但該特殊現(xiàn)象與普遍認為的魚類在性腺分化后, 其生殖細胞已失去了性別可塑性的觀點相悖。因此, 認為是三倍體虹鱒的卵原細胞胞囊化擾亂了雌性生殖細胞與其體細胞之間的互作, 導(dǎo)致濾泡細胞發(fā)育及其性類固醇激素合成通路受阻, 進而中斷了睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫嫉姆枷慊緩? 最終由于雌激素的缺失開啟了卵巢轉(zhuǎn)向雄性化的調(diào)控通路。然而, 對于三倍體虹鱒卵巢滯育的這種生理學(xué)解釋仍無法令人滿意, 尤其在三倍體虹鱒卵巢分化及滯育過程中, 雌性化通路的性腺特異基因與性類固醇激素間的聯(lián)合調(diào)控機制, 以及相關(guān)基因的級聯(lián)調(diào)控模式是怎么樣的, 到目前為止仍不得而知。目前, 一些與性別決定和分化相關(guān)的基因已經(jīng)在虹鱒中被鑒定出來, 包括 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9等(Marchand et al, 2000; Vizziano et al, 2007, 2008a,b; Orrego et al, 2010)。盡管Xu等(2016)初步報道了不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒的上述基因的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系, 但對于其卵巢分化及早期滯育的調(diào)控機制尚未進行報道。我們檢測了卵巢分化及其滯育早期三倍體雌性虹鱒的 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Aox9的相對表達量, 并分析了各基因間的級聯(lián)調(diào)控模式以及在雌性化通路中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和采樣

遺傳上全雌性三倍體(XXX)虹鱒和正常雌性二倍體(XX)虹鱒從黑龍江水產(chǎn)研究所獲得。30dpf(Days post fertilization)發(fā)眼卵放置在 10℃水溫中,溶解氧為8mg/L, 然后轉(zhuǎn)入到實驗設(shè)備中即0.3m3的水族箱內(nèi), 具有再循環(huán)給水系統(tǒng), 水溫 10±0.2℃,恒定光周期(12L︰12D)。在65—68dpf時期, 仔魚開始集中上浮, 開口攝食后分組(每日飽和投喂商業(yè)餌料): 實驗組全為雌性三倍體(XXX), 對照組為雌性二倍體(XX), 各試驗組均設(shè)三個平行組。從上浮仔魚至4月齡, 每14d采集樣本一次, 用于確定性腺分化時間, 每次采集仔魚30尾, 放于液氮罐內(nèi)凍存后,–80℃超低溫冰箱保存, 用于 RNA提取和 real time RT-PCR分析; 幼魚期(5—10月齡)每次采集樣品 10尾, 分 5尾放于液氮罐內(nèi)凍存, 用于 RNA提取和real time RT-PCR分析, 5尾分別用Bouin’s固定(用于組織學(xué)切片觀察)和2.5%戊二醛固定(用于電鏡觀察),7—10月齡采集血液。

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄

用TRIzol試劑提取RNA。RNA數(shù)量和質(zhì)量是通過紫外吸光度在260和280nm的Evolution 260 BIO分光光度計(Thermo, 美國)測定。吸光度比值為260/280nm, 超出 1.7—2.1范圍的樣品將被排除。樣品RNA的完整性通過生物分析儀2100專家系統(tǒng)(安捷倫科技公司, 圣克拉拉, 美國)驗證, 所有的樣本RIN 值都在 8—10。根據(jù)制造商的說明, 500ng, 總RNA 30μL反應(yīng)體系, 使用反向轉(zhuǎn)錄核心工具酶(98℃, 10s; 52℃, 30s; 72℃, 1min), 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用10倍的核酸酶自由水將cDNA稀釋。

1.3 實時PCR

根據(jù)二倍體虹鱒的Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、sox9和Amh序列作為模板, 利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計特異引物(表 1), 檢測二倍體虹鱒和雌性三倍體虹鱒性腺組織中基因的表達量情況, 并根據(jù)GenBank中二倍體虹鱒的 β-actin基因序列設(shè)計內(nèi)參引物(表1)。實時熒光定量 PCR(ddCt法)結(jié)果測定, 用 ABI 7500 Realtime PCR 儀(Applied Biosystems, USA)進行相對定量分析。使用 SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa, Japan)試劑盒, 依照說明書反應(yīng)為 20μL體系, 包括: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 10μL; PCR Forward Primer (10μmol/L), 0.4μL; PCR Reverse Primer (10μmol/L), 0.4μL; ROX Reference Dye Ⅱ(50×)×3, 0.4μL; cDNA 模板, 2.0μL; dH2O, 6.8μL。反應(yīng)程序為95℃ 30s; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40個循環(huán); 95℃ 15s, 60℃ 1min, 95℃ 15s。每個引物的效率(Baronet al, 2005a, b, c), 由cDNA樣本(RNA反轉(zhuǎn)錄得到)連續(xù)稀釋測得, 重復(fù)3次。各基因轉(zhuǎn)錄水平通過β-actin(內(nèi)參)的表達量進行評定。將熒光定量PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出, 采用 2–ΔΔCt法計算得到基因定量表達結(jié)果(Bogerdet al, 2001)。

表1 實時定量PCR引物序列Tab.1 The nucleotide sequences of the real-time PCR primers

1.4 性激素測定

尾椎靜脈采血, 制備血清, –80℃保存待測。根據(jù)解剖和切片結(jié)果, 對照標記, 選取雌性血樣, 采用放射免疫法測定 Estradiol-17β (E2)和 Testosterone (T)含量, 放免試劑盒為北京華英生物技術(shù)研究所生產(chǎn)(125I-Na為英國Amersham公司生產(chǎn), 17β-E2和T抗原及抗體為美國SIGMA公司生產(chǎn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 三倍體虹鱒卵巢分化

在 98dpf時期, 三倍體虹鱒已分化出卵巢結(jié)構(gòu)(圖1a), 其中具有明顯的卵原細胞(圖1b, 細胞核: 三角符號)和鞘膜細胞(圖1a, 箭頭); 卵原細胞胞質(zhì)中具有大量圓形和帶形的線粒體, 偶見高爾基體(圖 1c),且細胞核較小, 具有2個核仁。在 84dpf時期, 二倍體虹鱒卵巢分化速度較快, 卵巢中具有大量典型的卵泡結(jié)構(gòu)(圖 1d), 卵原細胞大量增殖, 且具有多個核仁(圖 1e), 胞質(zhì)細胞器大量增殖, 高爾基體較為發(fā)達(箭頭), 線粒體多位長帶狀(圖1f, 三角形)。但隨后的發(fā)育對三倍體虹鱒卵泡形成和卵細胞增殖均非常不利, 在 154dpf(4月齡), 雌性三倍體虹鱒性腺整體表現(xiàn)為Ⅰ期卵巢結(jié)構(gòu)(圖 1g), 卵泡結(jié)構(gòu)明顯(圖 1h, 箭頭), 但卵巢組織間存在大量空隙, 絕大部分區(qū)域為無法區(qū)分的體細胞組織。在4月齡時期, 二倍體虹鱒卵巢已進入到卵母細胞發(fā)育時期(Ⅱ—Ⅲ時期卵巢),細胞核變小(圖 1i, 三角形), 核仁清晰(圖 1i, 箭頭),濾泡層內(nèi)層為扁平的濾泡細胞(圖 1j, 三角形), 外層為鞘膜細胞(圖1j, 箭頭)。

2.2 三倍體虹鱒滯育期卵巢

圖1 二倍體和三倍體虹鱒卵巢分化期結(jié)構(gòu)Fig.1 The gonadal morphology of diploid and triploid female rainbow trout in developmental period

在 5—7月齡時期, 三倍體雌性虹鱒卵巢組織發(fā)育停滯(圖 2a), 卵細胞始終停留在卵原細胞時期, 且核仁數(shù)量較少, 細胞形態(tài)不規(guī)則, 卵巢組織間隙充滿了大量鞘膜細胞。8—9月齡時期, 三倍體虹鱒卵巢結(jié)構(gòu)開始疏松化, 有大面積的空隙出現(xiàn)(圖 2b), 超微結(jié)構(gòu)顯示, 個別的空隙存有大量微絨毛, 而有些空隙間有膜狀物存在(圖2c)。10月齡時期, 三倍體虹鱒卵巢發(fā)生了退化, 卵巢結(jié)構(gòu)空泡化更加明顯, 間質(zhì)空隙較大(圖2d, 箭頭)、卵原細胞開始重吸收(圖2e, 箭頭),胞質(zhì)內(nèi)線粒體大量瓦解, 鞘膜細胞不斷萎縮(圖 2e,三角形), 甚至消失, 卵巢組織進入衰敗期, 結(jié)締組織發(fā)達, 出現(xiàn)了大量不能區(qū)分性質(zhì)的生殖細胞群。該時期后期, 絕大部分空隙均被微絨毛所占據(jù)(圖 2f), 卵巢組織內(nèi)存在龐大的膜系統(tǒng)(圖 2g, 三角形), 具有大量深染致密顆粒(圖 2g, 箭頭), 類似于蛋白物質(zhì)在性腺外周聚集。在5—10月齡時期, 二倍體虹鱒卵巢具有典型的產(chǎn)卵小板結(jié)構(gòu), 每個產(chǎn)卵板上分布有數(shù)量不等的卵原細胞, 其數(shù)量在短時期內(nèi)大量增殖(圖2h),并不斷發(fā)育成初級卵母細胞和次級卵母細胞(Ⅲ實相卵母細胞)(圖2i)。該時期的最主要特征——卵母細胞發(fā)育及其濾泡細胞層的形成。

圖2 三倍體虹鱒滯育期卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 The gonadal morphology of triploid female rainbow trout in development arrest period

2.3 三倍體(XXX)虹鱒卵巢 Cyp19a1a、Foxl2、Dmrt1、Amh和Sox9的表達分析

Foxl2和Cyp19a1a在二倍體虹鱒卵巢和精巢中均有表達, 它們在卵巢中表達量均呈逐漸升高趨勢,但精巢中的表達量非常低(圖3a, 圖3b); 這兩個基因在雌性三倍體虹鱒性腺中的表達呈先升高后降低趨勢, 其表達量均在 8月齡時期達到最大(圖 3a,圖 3b)。Dmrt1、Amh和Sox9在二倍體精巢和雌性三倍體性腺中的表達均呈不斷上調(diào)的趨勢, 但這些基因在二倍體精巢中的表達量顯著高于在雌性三倍體中的表達(圖 3c, 圖 3d, 圖 3e), 這三個基因在二倍體虹鱒卵巢中的表達呈下調(diào)趨勢(圖3c, 圖3d,圖 3e)。

2.4 三倍體(XXX)虹鱒性類固醇激素(E2和T)的變化趨勢

在 10月齡時期, 雌性二倍體與三倍體虹鱒的血液E2差異不顯著(P>0.05), 但雄性二倍體血液E2顯著低于前兩者(P<0.05); 雄性二倍體虹鱒顯著高于雌性三倍體虹鱒的血液T含量, 且雌性二倍體虹鱒的血液T含量顯著低于前兩者(P<0.05)(圖4a, 圖4b)。

圖3 雌性3n體(XXX)虹鱒和2n體(XX, XY)虹鱒不同月齡的基因表達結(jié)果Fig.3 The gene expression profiles in gonads of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout

圖4 10月齡雌性3n體(XXX)虹鱒和2n體(XX, XY)虹鱒血液E2和T含量對照結(jié)果Fig.4 Sex steroid levels of 3n (XXX) and 2n (XX, XY) rainbow trout at 334dpf

3 討論

眾所周知, 虹鱒的性別分化由性染色體所決定,其自仔魚首次接受外源性食物之時即開始進入性腺分化時期(Thorgaardet al, 1979; Van Den Hurket al,1981)。但魚類與哺乳動物的性別決定機制存在極大不同, 而且具有重塑機制, 因為早期大量研究表明,性類固醇激素對于鮭科魚類性別分化及性腺發(fā)育起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用, 外源性類固醇激素能將性分化期魚類的遺傳性別表型所逆轉(zhuǎn)(Johnstoneet al, 1978;Goetzet al, 1979; Donaldsonet al, 1982; Yamazaki,1983)。本研究發(fā)現(xiàn), 虹鱒的二倍體與三倍體卵巢分化時間前后相差不大, 但分化速度存在差異, 三倍體虹鱒卵巢分化速度較慢, 其卵細胞及其濾泡細胞的數(shù)量遠遠低于二倍體的, 且三倍體的卵細胞及其濾泡細胞形態(tài)不規(guī)則。盡管三倍體雌性虹鱒能夠分化出典型卵巢結(jié)構(gòu), 但卵原細胞及其濾泡細胞數(shù)量有限。早期研究認為, 雌性三倍體虹鱒卵巢分化失常與第三套染色體干擾了初級卵母細胞第一次減數(shù)分裂有關(guān)(Thorgaard et al, 1979; Chourrout et al, 1986)。顯然這個結(jié)果無法令人滿意, 盡管在三倍體卵巢敗育過程中確實發(fā)生了生殖細胞與性腺體細胞互作機制失常的情況, 但在該過程性腺特異基因的調(diào)控以及與性類固醇激素的協(xié)同作用并未被考慮到, 可能基因調(diào)控在發(fā)生性逆轉(zhuǎn)過程中起到了更為關(guān)鍵作用。

虹鱒即便多出一套染色體也能夠生存和繁殖,這一點是其他脊椎動物做不到的, 四倍體(Carrasco et al, 1998)和三倍體(Lincoln et al, 1984; Benfey et al,1986)虹鱒精巢與二倍體虹鱒的有相同功能和形態(tài),然而, 三倍體雌性虹鱒是一個例外, 盡管它們能夠存活, 且卵巢可以正常分化, 但幼魚發(fā)育至 5—7月齡時, 三倍體虹鱒卵巢仍停滯在Ⅰ期, 形態(tài)呈線狀, 顏色透明; 而同時期二倍體卵巢已經(jīng)發(fā)育至Ⅱ—Ⅲ期,卵巢中聚集這大量卵母細胞和濾泡細胞。該時期三倍虹鱒卵巢中缺乏卵母細胞, 鞘膜細胞不斷減少, 且形態(tài)不規(guī)則, 卵巢組織間隙出現(xiàn)大量微絨毛, 個別卵泡開始空泡化。本研究通過大量觀察中發(fā)現(xiàn), 從仔魚上浮開始至5月齡階段, 三倍體卵巢發(fā)育非常緩慢, 幾乎維持在分化末期形態(tài), 但卵原細胞及其附屬濾泡細胞結(jié)構(gòu)退化嚴重, 這與Krisfalusi等(1999)關(guān)于三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育的研究結(jié)果相一致。虹鱒三倍體與二倍體卵巢形態(tài)相比, 三倍體卵巢呈線狀, 并且缺少初級卵母細胞, 這與早期研究結(jié)果相一致(Thorgaard et al, 1979; Lincoln et al, 1984; Krisfalusi et al, 1996)。本研究發(fā)現(xiàn), 在4月齡之前, 三倍體雌性虹鱒卵巢就未見清晰可辨認的濾泡細胞層, 這說明卵巢組織只有鞘膜細胞在發(fā)揮功能, 由于缺少濾泡細胞, 導(dǎo)致卵細胞與腦垂體性腺軸的聯(lián)系被切斷,因而使得其卵巢始終停滯在早期發(fā)育階段。

有研究報道, 在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus) (Ijiri et al, 2008)、虹鱒(Baron et al, 2005a, b,c; Vizziano et al, 2007, 2008b)、鯽(Gobiocypris rarus)(Cao et al, 2012)和大西洋鱈(Gadus morhua) (Haugen et al, 2012)卵巢分化過程中, Cyp19a1a、Foxl2和Bmp4(Baron et al, 2005c; Vizziano et al, 2007)等基因表達量顯著上調(diào), 但在誘導(dǎo)雌性虹鱒雄性化過程中這些基因被強烈抑制(Baron et al, 2007, 2008;Vizziano et al, 2008a), 尤其是 Foxl2a, 在鳥類(Hudson et al, 2005)和魚類(Baron et al, 2004;Nakamoto et al, 2006; Wang et al, 2007)卵巢分化中該基因具有高度保守特征。本研究發(fā)現(xiàn), 在幼年期, 三倍體雌性虹鱒血清雌二醇含量與二倍體雌性的無顯著性差異(P>0.05), 但前者同時期Cyp19a1a和Foxl2的表達量顯著低于后者, 這可能與卵巢體細胞與卵細胞間的互作關(guān)系被切斷有關(guān)。已有大量研究表明,魚類的雌激素能夠強烈誘導(dǎo)Foxl2表達(Vizziano et al,2007), 而且 FOXL2/Foxl2能夠上調(diào) CYP19a/Cyp19a1a的表達(Baron et al, 2004; Wang et al, 2007),因此這兩個基因形成了一個正反饋回路。Baron等(2005c)的研究結(jié)果很好地證明了上述觀點, 即一些雌魚性腺特異候選基因(如 Foxl2a、Foxl2b和Cyp19a1a等)在雄激素處理時都快速、強烈的被抑制。魚類雌激素調(diào)節(jié)Foxl2的表達以及FOXL2/Foxl2正向調(diào)節(jié) CYP19/Cyp19a1a, 這強有力的支持了 Foxl2和雌激素之間具有一個短的正反饋回路的假說(Wang et al, 2007; Yamaguchi et al, 2007)。Dmrt1被認為是與硬骨魚類(Koopman et al, 2003; Raghuveer et al, 2009;Herpin et al, 2011)精巢分化密切相關(guān)的基因, 在魚類性別分化及發(fā)育過程中起著重要作用。Vizziano等(2007, 2008a)和 Baron等(2008)的研究表明, 雄性化處理除了早期下調(diào)雌性相關(guān)特異基因, 還包括誘導(dǎo)精巢支持細胞中Amh、Sox9和Dmrt1等雄性特異基因表達上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn), Dmrt1、Amh和Sox9在雌性三倍體虹鱒幼魚階段呈逐漸上調(diào)趨勢, 且隨著睪酮含量的增加, 這三個基因的表達顯著高于同期在雌性二倍體虹鱒中的表達。在雌性三倍體虹鱒幼魚早期Amh和Sox9表達量低, 可能與該時期的雌激素和Cyp19a1a對它們的抑制有關(guān)。Guan等(2000)和Baron等(2008)在利用雄激素處理雌性虹鱒逆轉(zhuǎn)為雄性的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果, 他們認為, 雄激素處理能有效誘導(dǎo)Amh和Sox9持續(xù)高表達。在使用外源性雄激素處理雌性虹鱒向雄性轉(zhuǎn)變過程中, 雄激素顯著抑制,并下調(diào)了 Cyp19a1a的表達, 從而導(dǎo)致了內(nèi)源性雌激素含量降低, 進而使得性腺向雄性化轉(zhuǎn)變。而在雌性三倍體中, Foxl2和Cyp19a1a表達量下調(diào)的誘因不是內(nèi)源性雌激素含量降低, 而是不斷升高的雄激素(睪酮), 并且睪酮顯著上調(diào)了雄性特異基因表達, 尤其與精巢發(fā)育密切相關(guān)的基因 Amh和 Sox9。因此, 說明性類固醇激素在雌性三倍體虹鱒性腺過程中可能都扮演著重要角色。

總之, 在所有脊椎動物研究中, CYP19a是一種典型體細胞酶, 且維持著性腺中 Cyp19a1a表達和內(nèi)源性血清雌二醇合成, 并與體細胞分化狀態(tài)直接相關(guān)。而影響體細胞分化狀態(tài)的因素可能也依次調(diào)控了雌激素合成和卵巢分化結(jié)果。在對老鼠卵巢分化的研究發(fā)現(xiàn), 雌激素是維持卵巢體細胞分化的必要條件(Britt et al, 2003)。因此, 維持卵巢分化需要持續(xù)高水平的雌激素, 這可能是脊椎動物進化過程中的一個保守特征?？梢酝茢啻菩匀扼w虹鱒卵巢滯育將導(dǎo)致其體細胞去分化, 這對于 Cyp19a1a表達及雌二醇的合成存在抑制作用。因為這些雌激素是用來維持它們分化和繼續(xù)發(fā)育的, 這可能產(chǎn)生一個負反饋圈, 之后去分化會增強。最近有研究表明, 通過芳香化酶抑制劑(ATD)處理雌魚, 可使已經(jīng)分化成雌性的魚發(fā)生雄性化逆轉(zhuǎn)(Nakamura et al, 2003; Bhandari et al, 2006;Ogawa et al, 2008), 這清楚的表明持續(xù)高水平雌激素對于維持卵巢分化所起到的決定性作用(或妨礙自生的精巢分化)。

韓 英, 劉 蔓, 張瀾瀾等, 2010a. 三倍體雄性虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生殖發(fā)育研究. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,41(7): 94—99

韓 英, 劉 蔓, 張瀾瀾等, 2010b. 三倍體雌性虹鱒卵巢發(fā)育的類雄性化趨勢. 中國水產(chǎn)科學(xué), 17(4): 739—744

Baron D, Cocquet J, Xia X H et al, 2004. An evolutionary and functional analysis of FoxL2 in rainbow trout gonad differentiation. Journal of Molecular Endocrinology, 33(3):705—715

Baron D, Batista F, Chaffaux S et al, 2005a. Foxl2 gene and the development of the ovary: a story about goat, mouse, fish and woman. Reproduction Nutrition Development, 45(3):377—382

Baron D, Fostier A, Breton B et al, 2005b. Androgen and estrogen treatments alter steady state messengers RNA(mRNA) levels of testicular steroidogenic enzymes in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Molecular Reproduction and Development, 71(4): 471—479

Baron D, Houlgatte R, Fostier A et al, 2005c. Large-scale temporal gene expression profiling during gonadal differentiation and early gametogenesis in rainbow trout.Biology of Reproduction, 73(5): 959—966

Baron D, Houlgatte R, Fostier A et al, 2008. Expression profiling of candidate genes during ovary-to-testis transdifferentiation in rainbow trout masculinized by androgens.General and Comparative Endocrinology, 156(2): 369—378

Baron D, Montfort J, Houlgatte R et al, 2007. Androgen-induced masculinization in rainbow trout results in a marked dysregulation of early gonadal gene expression profiles.BMC Genomics, 8: 357

Benfey T J, Solar I I, De Jong G et al, 1986. Flow-cytometric confirmation of aneuploidy in sperm from triploid rainbow trout. Transactions of the American Fisheries Society, 115(6):838—840

Bhandari R K, Nakamura M, Nagahama Y, 2006. Estrogen is essential for the maintenance of female sex in fish. Journal of Experimental Zoology A, 305A: 111

Bogerd J, Blomenr?hr M, Andersson E et al, 2001. Discrepancy between molecular structure and ligand selectivity of a testicular follicle-stimulating hormone receptor of the African catfish (Clarias gariepinus). Biology of Reproduction, 64(6): 1633—1643

Brennan J, Capel B, 2004. One tissue, two fates: molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.Nature Reviews Genetics, 5(7): 509—521

Britt K L, Findlay J K, 2003. Regulation of the phenotype of ovarian somatic cells by estrogen. Molecular and Cellular Endocrinology, 202(1—2): 11—17

Cao M X, Duan J D, Cheng N N et al, 2012. Sexually dimorphic and ontogenetic expression of dmrt1, cyp19a1a and cyp19a1b in Gobiocypris rarus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology,162(4): 303—309

Capel B, 2000. The battle of the sexes. Mechanisms of Development, 92(1): 89—103

Carrasco L A P, Doroshov S, Penman D J et al, 1998. Long-term,quantitative analysis of gametogenesis in autotriploid rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Reproduction & Fertility, 113(2): 197—210

Chourrout D, Chevassus B, Krieg F et al, 1986. Production of second generation triploid and tetraploid rainbow trout by mating tetraploid males and diploid females-potential of tetraploid fish. Theoretical and Applied Genetics, 72(2):193—206

Devlin R H, Nagahama Y, 2002. Sex determination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological,and environmental influences. Aquaculture, 208(3—4):191—364

Donaldson E M, Hunter G A, 1982. Sex control in fish with particular reference to salmonids. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 39(1): 99—110

Goetz F W, Donaldson E M, Hunter G A et al, 1979. Effects of estradiol-17β and 17α-methyltestosterone on gonadal differentiation in the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.Aquaculture, 17(4): 267—278

Graves J A M, 2002. The rise and fall of SRY. Trends in Genetics,18(5): 259—264

Guan G J, Kobayashi T, Nagahama Y, 2000. Sexually dimorphic expression of two types of DM (Doublesex/Mab-3)-domain genes in a teleost fish, the Tilapia (Oreochromis niloticus).Biochemical and Biophysical Research Communications,272(3): 662—666

Guiguen Y, Fostier A, Piferrer F et al, 2010. Ovarian aromatase and estrogens: a pivotal role for gonadal sex differentiation and sex change in fish. General and Comparative Endocrinology, 165(3): 352— 366

Haugen T, Almeida F F L, Andersson E et al, 2012. Sex differentiation in Atlantic cod (Gadus morhua L.):morphological and gene expression studies. Reproductive Biology and Endocrinology, 10: 47

Herpin A, Schartl M, 2011. Dmrt1 genes at the crossroads: a widespread and central class of sexual development factors in fish. FEBS Journal, 278(7): 1010—1019

Hudson Q J, Smith C A, Sinclair A H, 2005. Aromatase inhibition reduces expression of FOXL2 in the embryonic chicken ovary.Developmental Dynamics, 233(3): 1052—1055

Ijiri S, Kaneko H, Kobayashi T et al, 2008. Sexual dimorphic expression of genes in gonads during early differentiation of a teleost fish, the Nile tilapia Oreochromis niloticus. Biology of Reproduction, 78(2): 333—341

Johnstone R, Simpson T H, Youngston A F, 1978. Sex reversal in salmonid culture. Aquaculture, 13(2): 115—134

Koopman P, Loffler K A, 2003. Sex determination: the fishy tale of Dmrt1. Current Biology, 13(5): R177—R179

Koopman P, Münsterberg A, Capel B et al, 1990. Expression of a candidate sex-determining gene during mouse testis differentiation. Nature, 348(6300): 450—452

Krisfalusi M, Cloud J G, 1996. Effects of exogenous estradiol-17β on early growth and gonadal development of diploid and triploid female rainbow trout (Oncorhyncus mykiss). Developmental Genetics, 19(4): 302—303

Krisfalusi M, Cloud J G, 1999. Gonadal sex reversal in triploid rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Experimental Zoology Part A, 284(4): 466—472

Lincoln R F, Scott A P, 1984. Sexual maturation in triploid rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. Journal of Fish Biology, 25(4): 385—392

Marchand O, Govoroun M, D'Cotta H et al, 2000. DMRT1 expression during gonadal differentiation and spermatogenesis in the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 1493(1—2): 180—187

Munger S C, Aylor D L, Syed H A et al, 2009. Elucidation of the transcription network governing mammalian sex determination by exploiting strain-specific susceptibility to sex reversal. Genes & Development, 23(21): 2521—2536

Nakamoto M, Matsuda M, Wang D S et al, 2006. Molecular cloning and analysis of gonadal expression of Foxl2 in the medaka, Oryzias latipes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 344(1): 353—361

Nakamura M, Bhandari R K, Higa M, 2003. The role estrogens play in sex differentiation and sex changes of fish. Fish Physiology and Biochemistry, 28(1—4): 113—117

Ogawa S, Akiyoshi M, Higuchi M et al, 2008. ‘Post-sex differentiational’ sex reversal in the female common carp(Cyprinus carpio). Cybium, 32(S2): 102—103

Orrego R, McMaster M, Van Der Kraak G et al, 2010. Effects of pulp and paper mill effluent extractives on aromatase CYP19a gene expression and sex steroid levels in juvenile triploid rainbow trout. Aquatic Toxicology, 97(4): 353—360

Penman D J, Piferrer F, 2008. Fish gonadogenesis. Part I: genetic and environmental mechanisms of sex determination.Reviews in Fisheries Science, 16(S1): 16—34

Piferrer F, 2011. Endocrine control of sex differentiation in fish.In: Farrell A P ed. Encyclopedia of Fish Physiology, from Gene to Environment, Vol.2. San Diego: Academic Press,1490—1499

Piferrer F, Ribas L, Díaz N, 2012. Genomic approaches to study genetic and environmental influences on fish sex determination and differentiation. Marine Biotechnology,14(5): 591—604

Raghuveer K, Senthilkumaran B, 2009. Identification of multiple dmrt1s in catfish: localization, dimorphic expression pattern,changes during testicular cycle and after methyltestosterone treatment. Journal of Molecular Endocrinology, 42(5):437—448

Sinclair A H, Berta P, Palmer M S et al, 1990. A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif. Nature,346(6281): 240—244

Thorgaard G H, Gall G A E, 1979. Adult triploids in a rainbow trout family. Genetics, 93(4): 961—973

Van Den Hurk R, Slof G A, 1981. A morphological and experimental study of gonadal sex differentiation in the rainbow trout, Salmo gairdneri. Cell and Tissue Research,218(3): 487—497

Vizziano D, Randuineau G, Baron D et al, 2007. Characterization of early molecular sex differentiation in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss. Developmental Dynamics, 236(8):2198—2206

Vizziano D, Baron D, Randuineau G et al, 2008a. Rainbow trout gonadal masculinization induced by inhibition of estrogen synthesis is more physiological than masculinization induced by androgen supplementation. Biology of Reproduction, 78(5): 939—946

Vizziano D, Baron D, Mahè S et al, 2008b. Estrogen treatment up-regulates female genes but does not suppress all early testicular markers during rainbow trout male-to-female gonadal transdifferentiation. Journal of Molecular Endocrinology, 41(5): 277—288

Volff J N, Nanda I, Schmid M et al, 2007. Governing sex determination in fish: regulatory putsches and ephemeral dictators. Sexual Development, 1(2): 85—99

Wang D S, Kobayashi T, Zhou L Y et al, 2007. Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a femalespecific manner by binding to the promoter as well as interacting with Ad4 binding protein/steroidogenic factor 1.Molecular Endocrinology, 21(3): 712—725

Wang D S, Zhou L Y, Kobayashi T et al, 2010. Doublesex- and Mab-3-related transcription factor-1 repression of aromatase transcription, a possible mechanism favoring the male pathway in tilapia. Endocrinology, 151(3): 1331—1340

Xu G F, Huang T Q, Jin X et al, 2016. Morphology, sex steroid level and gene expression analysis in gonadal sex reversal of triploid female (XXX) rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).Fish Physiology and Biochemistry, 42(1): 193—202

Yamaguchi T, Yamaguchi S, Hirai T et al, 2007. Folliclestimulating hormone signaling and Foxl2 are involved in transcriptional regulation of aromatase gene during gonadal sex differentiation in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Biochemical and Biophysical Research Communications, 359(4): 935—940

Yamazaki F, 1983. Sex control and manipulation in fish.Aquaculture, 33(1—4): 329—354