陳夢丹 朱 凱 徐鑄婕 李長紅 苗 亮 陳 炯

(寧波大學海洋學院 生物化學與分子生物學實驗室 寧波 315211)

鐵蛋白(Ferritin, Fer)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種鐵儲存蛋白, 在維持機體鐵平衡中發(fā)揮著重要作用。Fer的結(jié)構(gòu)高度保守, 由24個亞基圍繞形成的巨大復合體, 中間含有一個中空球體, 內(nèi)部可儲存4500個鐵原子(Harrison et al, 1996; Orino et al, 2008)。鐵蛋白中的鐵以三價鐵離子氧化物的形式存在, 不僅能儲存機體內(nèi)過剩的鐵, 為含鐵元素蛋白質(zhì)的合成提供鐵原子, 還能防止鐵氧化過程中所產(chǎn)生的自由基帶來的傷害(Harrison et al, 1996; Orino et al, 2008)。哺乳動物Fer通常由輕鏈(light chain, L)和重鏈(heavy chain, H)兩種鐵蛋白亞基組成, 其中H亞基通過將二價鐵氧化為三價鐵實現(xiàn)快速解毒(Clegg et al, 1981),L亞基在鐵的礦化、鐵核晶體形成和長期儲存中發(fā)揮重要作用(Levi et al, 1994)。在魚類和兩棲類動物等低等脊椎動物中, 通常還具有中型鏈(middle chain, M)(Dickey et al, 1987; Andersen et al, 1995; Zhang et al,2010; Elvitigala et al, 2013; Oh et al, 2016)。由于具有FTH亞基的鐵氧化酶中心和FTL亞基鐵成核位點, M亞基兼具H和L亞基的功能(Torti et al, 2002)。除具有鐵離子儲存和抗氧化損傷功能, Fer在機體免疫反應中也起著重要作用。

香魚(Plecoglossus altivelis)是日本、中國和朝鮮等東亞地區(qū)國家特有的一種小型名貴經(jīng)濟魚類。近年來,由于長期集約化養(yǎng)殖、種質(zhì)退化和環(huán)境污染等諸多原因, 細菌性病害頻繁發(fā)生, 對香魚養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失(李長紅等, 2009)。人工養(yǎng)殖香魚要求無污染和綠色健康, 抗生素和農(nóng)藥的使用受到諸多限制。因此, 迫切需要深入研究香魚的免疫機制, 為指導病害防治和抗病遺傳育種奠定理論基礎。鑒于Ferritin在動物抗菌免疫反應中的重要作用, 我們擬對香魚Fer(PaFer)進行研究, 測定其基因cDNA序列, 分析其結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進化關(guān)系及其mRNA在組織中的表達特征, 并研究鰻弧菌感染后香魚重要組織中 PaFer mRNA的表達變化; 原核表達PaFer重組蛋白并純化復性, 分析其鐵結(jié)合和抑菌活性, 為進一步深入研究魚類Ferritin在魚類的鐵代謝及免疫機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

本實驗所用的健康香魚(20—25g)購自寧波水產(chǎn)大世界, 規(guī)格均一、健康無傷。創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)香魚分離株ayu-H080701、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 plys E和TG1菌株、載體pET-28a等由本實驗室保存。RNAiso試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector、Ex Taq DNA聚合酶、Ni-NTA SefinoseTM試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購于 TaKaRa公司(日本); 菲洛嗪試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司; Gel Extraction Kit購于Omega公司(美國); 引物合成及序列測定由英維捷基貿(mào)易有限公司(上海)完成。

1.2 組織樣品制備

香魚暫養(yǎng)7d后, 隨機選取5尾, 分別采集肝、心、腎、腦、脾、腸、鰓和肌肉等組織, 立即放入液氮中,隨后保存于實驗室–70℃超低溫冰箱, 用于分析PaFer基因mRNA的組織表達特征。剩余香魚隨機分成感染組和對照組, 各30尾。感染組以1.0×104CFU/尾的感染濃度腹腔注射鰻弧菌懸液(李長紅等, 2009),對照組注射等體積無菌生理鹽水。感染組和對照組香魚于注射后4、8、12和24h采集血液和組織樣品, 每組每次取4尾香魚。組織采集方法同上。

1.3 PaFer基因cDNA序列獲得及分析

采用Illumina HisSeq 2000測序平臺對香魚頭腎來源的單核/巨噬細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序, 從測序結(jié)果中獲得PaFer基因cDNA序列, 并通過特異引物PCR擴增和和序列測定的方法進行驗證。同源蛋白序列比對采用 BLASTP 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/); 多重序列比對采用 ClustalW 軟件(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/); 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建采用MEGA 5.0軟件(Tamura et al, 2011); 蛋白分子量大小及等電點預測采用Compute pI/Mw程序 (http://web.expasy.org/compute_pi/); 信號肽序列預測采用SignalP 4.1軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);N糖基化位點預測采用 NetCGlyc 1.0軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/); 保守結(jié)構(gòu)域預測采用 PROSITE軟件(http://kr.expasy.org/prosite/);二級結(jié)構(gòu)預測參考Rost(1996)的方法。

氨基酸序列多重比對及進化樹構(gòu)建所用序列詳見表1。

1.4 不同組織中PaFer mRNA的表達

采用 qPCR分析健康香魚不同組織中 PaFer mRNA的表達, 以及鰻弧菌感染后不同時間段 PaFermRNA在各組織中轉(zhuǎn)錄水平變化。參照 Li等(2015)的方法進行總RNA的抽提、DNase I處理、第一鏈cDNA合成及qPCR檢測。

表1 多重比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建采用序列Tab.1 The sequences used for multiple alignment and phylogenetic tree construction

根據(jù)獲得PaFer cDNA序列設計引物, 引物序列如下:

PaFer(+): 5′-GCTGGAGAAGAACGTCAACC-3′;

PaFer(-): 5′-GCGTCCATCTTGGTGAGATT-3′。

預期擴增片段為165bp。

以香魚β-actin基因(登錄號: AB020884)作為內(nèi)參,擴增引物序列如下:

pActin2(+): 5′-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3′;

pActin2(–): 5′-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3′。

預期擴增片段為231bp (Li et al, 2014)。

qPCR 擴增體系(25μL): SYBR Premix Ex Taq (2×)緩沖液 12.5μL、cDNA 模板 0.5μL、引物(10μmol/L)各 1μL, 超純水補足至 25μL。擴增反應在 ABI Step One熒光定量 PCR儀(美國)上進行, 反應條件為:94 ℃ 3min (預變性, 1個循環(huán)); 94℃ 30s, 58℃ 30s,72 ℃ 30s (擴增段, 40個循環(huán)); 94 ℃ 30s, 72℃ 60s,95 ℃ 3 0s (融解階段, 1個循環(huán))。qPCR監(jiān)測時每個樣品重復 3次, 包括目的基因(PaFer)和內(nèi)參基因(β-actin)。根據(jù)相對標準曲線法 2–ΔΔCt分析 PaFer mRNA的相對表達量(Livak et al, 2001)。

1.5 原核表達和蛋白純化

根據(jù)PaFer的ORF設計原核表達引物, 引物序列如下:

pET-28a-PaFer(+): 5′-GGAATTC ATGGAGTCTC AGATCCGCC-3′;

pET-28a-PaFer(–): 5′-CAAGCTT TTAGCTCTGG CTCCCCAAG-3′。

下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶 EcoR I和 Hind III的識別序列, 斜體字母為保護堿基。PCR擴增體系(25μL): 10×LA buffer 2.5μL, dNTP (2.5mmol/L) 3.5μL,cDNA 模板 1μL, 上下游引物(10μmol/L)各 1μL, LA Taq DNA聚合酶0.25μL, ddH2O 15.75μL。擴增反應在Mastercycler pro梯度PCR儀(德國eppendorf公司)上進行, 反應條件為: 94℃預變性2min; 94℃變性30s,56℃退火30s, 72℃延伸1.5min, 共30個循環(huán), 循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、切膠純化后, 用 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切后, 與同樣酶切的原核表達載體 pET-28a相連接, 獲得重組質(zhì)粒pET28a-PaFer。pET28a-PaFer轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 pLys E菌株, IPTG誘導表達, 細菌總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離, 考馬斯亮藍G-250染色檢測 PaFer重組蛋白(rPaFer)表達情況。

轉(zhuǎn)化菌經(jīng) IPTG大量誘導后, 收集大腸桿菌, 于4℃ 8000g離心10min, 棄上清, 加入PBS重懸浮細菌沉淀, 超聲波破碎3次, 4 ℃ 8 000g離心10min, 獲得包涵體沉淀, PBS洗滌 5次后, 將用結(jié)合緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, 8mol/L尿素, 500mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑, pH 8.0)洗滌, 然后4 ℃ 12000r/min離心 30min, 收集上清用于存化復性。按照 Ni-NTA SefinoseTM試劑盒說明書, 取洗滌后蛋白溶液, 上樣至預平衡的Ni2+柱中, 依次用洗滌緩沖液1和洗滌緩沖液2洗脫去除雜蛋白, 最后洗滌緩沖液洗脫目的蛋白。收集每一步的洗脫液, 經(jīng)SDS-PAGE檢測樣品的蛋白質(zhì)純度。

1.6 鐵離子螯合能力測定

采用 Bradford法(Bradford, 1976)測定純化復性的rPaFer濃度, 以牛血清蛋白為標準樣。冷凍干燥后保存, 用于后續(xù)結(jié)合鐵和抑菌實驗。rPaFer螯合鐵離子的能力測定參照 De Zoysa等(2007)提出的方法并略作改進。具體步驟如下: 分別將 1mL不同濃度rPaFer水溶液 (0, 2, 4, 6, 8和 10μg/mL)加至 20μL FeCl2(2mmol/L)中, 然后加入 40μL 菲洛嗪試劑(5mmol/L), 混勻, 室溫振蕩孵育10min。采用分光光度計(Ultrospec 1100 Pro UV/Visible spectrophotometer)于波長 562nm測定溶液的吸光值。每個樣品平行測定3次。根據(jù)下面公式計算rPaFer的鐵離子螯合能力:

鐵離子螯合能力(%) = [C－(S－B)]/C×100

其中, S表示rPaFer樣品水溶液反應后的吸光值, C表示水替代反應體系中樣品溶液后的吸光值, B表示水代替反應中的FeCl2溶液后的吸光值。

1.7 抗菌活性分析

參照Chang等(2006)的方法, 采用二倍稀釋法將rPaFer原液稀釋至 100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625μg/mL共7個濃度。將創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌和溶藻弧菌活化后, 30℃培養(yǎng)18h后用無菌生理鹽水稀釋至1.0×105CFU/mL菌懸液備用。將稀釋后的菌懸液接種至 96孔 U型微量滴定板內(nèi)(20μL/孔), 然后加入不同濃度的PaFer蛋白到各孔內(nèi)(80μL/孔), 混勻后置30℃恒溫培養(yǎng)24h。以不接菌的為空白對照組, 采用Varioskan Flash全波長多功能酶標儀(Thermo Fisher)測定OD600值。以細菌沒有生長的最小藥物濃度作為rPaFer抑制4種弧菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC), 重復3次。

1.8 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果表示為平均值±標準誤(mean±S.D.), 采用 SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計, P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PaFer cDNA序列分析

PaFer cDNA序列包含943bp核苷酸(GenBank登錄號: FR714867), 包含一個完整的、長度為531bp的ORF, 預測編碼一個由176個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量約為20.4kDa的多肽, 預測理論等電點為5.46, N末端不存在信號肽序列。

通過PROSITE工具對PaFer氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預測, 結(jié)果表明, PaFer在氨基酸7—156位存在保守的鐵蛋白樣雙鐵結(jié)構(gòu)域(ferritin-like di-iron domain), 并且僅存在 1個鐵離子結(jié)合區(qū)域信號(iron-binding region signature, IBRS2) (123–DPHLCD FLETHYLNEQVEAIK–143) (圖 1)。通過 NCBI的 CDD工具預測表明, 鐵氧化酶雙鐵中心鐵結(jié)合位點具有 7個高度保守的氨基酸殘基(24E, 31Y, 58E, 59E, 62H,104E和138Q) (圖1), 這7個殘基在H和M亞基中作為鐵離子配體發(fā)揮作用(Lawson et al, 1989; Arosio et al, 2009)。哺乳動物L亞基成核位置中3個帶負電荷氨基酸殘基(E54, E57和E61) (Santambrogio et al,1996)也存在于 PaFer, 但 E57被 D57取代(圖 1)。二級結(jié)構(gòu)預測表明, PaFer存在 4個 α螺旋, 分別為4—38、45—72、93—120 和 124—154(圖 1), 這個 4螺旋束與哺乳動物Fer的相似(Harrison et al, 1996)。

2.2 PaFer的系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列多重比對表明, PaFer與中國大鯢(Andrias davidianus)及其他魚類 Fer-M 同源性為68.5%—92.0%, 其中與胡瓜魚(Osmerus mordax)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鮭Fer-M的同源性分別為 91.9%、92.0%和 92.0%。系統(tǒng)進化樹分析表明, 各物種 Fer-M、Fer-H和 Fer-L分別成簇, PaFer與胡瓜魚、大西洋鮭和虹鱒的 Fer-M 聚為一個小簇,與虹鱒Fer-M進化相關(guān)性最高(圖2)。

2.3 PaFer mRNA的組織表達特征

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示, PaFer基因擴增產(chǎn)物 mRNA在所檢的香魚各組織中均有表達, 其中在脾臟中表達量最高, 腎臟、鰓、腦和心臟中的表達量次之, 肝臟和腸中表達量相對較少, 而在肌肉組織中表達量微弱(圖3)。

2.4 鰻弧菌侵染過程中香魚各組織PaFer mRNA表達變化

腹腔注射鰻弧菌后, 感染組香魚表現(xiàn)典型的弧菌病癥狀, 并能從肝、脾和腎等組織中分離出病原菌(結(jié)果未顯示), 對照組香魚無明顯癥狀。與對照組相比, 鰻弧菌感染4h后, 肝中PaFer mRNA的表達量顯著增加, 24h時達到峰值, 為對照組的 103.67倍(P<0.05); 脾和腎中PaFer mRNA表達量在感染8h后顯著增加, 均在24h時達到峰值, 分別為對照組5.75和 70.88倍(P<0.05)(圖 4)。

2.5 PaFer的原核表達及純化

重組質(zhì)粒 pET-28a-PaFer經(jīng)測序驗證無誤后, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Plys E中, 加入IPTG誘導表達,菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離及考馬斯亮藍G-250染色后, 出現(xiàn)一條高表達蛋白條帶, 相對分子質(zhì)量約為23kDa, 與預期大小相符(圖5)。利用重組質(zhì)粒攜帶的多組氨酸標簽, 表達的重組蛋白經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測, 顯示為單一條帶(圖 5),實現(xiàn)了重組蛋白 rPaFer的一步純化。純化的 rPaFer經(jīng)尿素梯度透析復性及透析去除尿素后, 用于檢測其活性。

2.6 PaFer結(jié)合鐵能力分析

菲洛嗪是一種高靈敏性的低鐵顯色劑, 能與Fe2+配位, 形成有色螯合物。實驗結(jié)果表明, 隨著 rPaFer濃度的增加, 各樣品的鐵離子螯合能力也隨之增加,當濃度為 4μg/mL時達到峰值(43.96%), 之后進入平臺期(圖 6)。

2.7 PaFer體外抑菌作用

利用酶標儀測定 rPaFer蛋白對 4種魚類常見弧菌的體外抑菌活性, 結(jié)果表明, PaFer對鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌均有抑制作用, 其 MIC值分別為:1.5625、25、100μg/mL, 對副溶血弧菌無明顯抑制作用。

3 討論

鐵蛋白調(diào)節(jié)鐵離子的儲存和釋放, 是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。本研究在香魚單核/巨噬細胞轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上得到了香魚鐵蛋白基因。序列分析揭示, PaFer具有與其它物種鐵蛋白相似的結(jié)構(gòu)特征: 包括保守的鐵蛋白樣雙鐵結(jié)構(gòu)域、鐵氧化酶雙鐵中心鐵結(jié)合位點的 7個高度保守的氨基酸殘基及4個α螺旋等, 且與大西洋鮭和虹鱒Fer-M同源性最高, 為 92.0%。系統(tǒng)進化樹分析表明, 各物種Fer-M、Fer-H和Fer-L分別成簇, PaFer與胡瓜魚、大西洋鮭和虹鱒的Fer-M聚為一個小簇, 與虹鱒Fer-M進化相關(guān)性最高。

圖1 香魚與其他物種Fer氨基酸序列的多重比對Fig.1 Multiple alignment of fish Fer isoforms and those of other species

圖2 基于NJ法構(gòu)建的香魚和其他物種全長鐵蛋白亞基氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic (Neighbor-joining) analysis of complete ferritin subunits from ayu and other species

圖3 健康香魚PaFer mRNA的組織表達特征Fig.3 The mRNA expression patterns of PaFer in various tissues of healthy ayu

表達特征分析表明, PaFer mRNA在健康香魚被檢組織中有不同程度的表達, 且在脾臟中表達量最高, 與已報道的大黃魚(Zhang et al, 2010)、半滑舌鰨(Wang et al, 2011)、條石鯛(Elvitigala et al, 2013)和牙鲆(Wang et al, 2015)等魚類Fer-M在肝臟中表達最高不同。脾臟是機體參與貯鐵的主要器官之一, PaFer在脾臟中大量表達, 揭示其可能在香魚鐵離子貯存中發(fā)揮重要的作用。目前, 已有較多文獻揭示魚類Fer的表達與病原體感染密切相關(guān), 主要體現(xiàn)為病原體感染后魚類 Fer基因表達顯著上調(diào)(Zhanget al,2010; Wanget al, 2011; Wanget al, 2015)。例如, 大黃魚感染弱化的活鰻弧菌后, 肝中Fer-M mRNA的表達在12h達到峰值, 上調(diào)4.4倍, 脾Fer-M mRNA的表達在12h達到峰值, 上調(diào)4.7倍, 腎臟Fer-M mRNA的表達量在5d時達到峰值, 上調(diào)4.4倍(Zhanget al,2010); 半滑舌鰨感染鰻弧菌后, 腎、脾和肝中Fer-M mRNA表達分別在48h、4h和1h時達到峰值, 分別約為對照組的62、48和11倍(Wanget al, 2011); 而半滑舌鰨感染海豚鏈球菌后, 腎、脾和肝中 Fer-M mRNA表達達到峰值的時間分別為24h、48h和24h,上調(diào)倍數(shù)也明顯低于鰻弧菌感染組(Wanget al, 2011);牙鲆感染遲緩愛德華菌后, FerM在頭腎、脾和肝中的表達量顯著上調(diào), 達到峰值的時間分別為 12h、24h和12h, 分別約為對照組的13、35和20倍(Wanget al,2015)。本研究中, 香魚感染鰻弧菌后, 肝、脾和腎中PaFer mRNA表達變化趨勢與上述研究結(jié)果相似, 但達到峰值的時間點和峰值不同, 肝、脾和腎中 PaFer mRNA均在感染 24h時達到最高, 分別為對照組的103.67、5.75和70.88倍, 揭示PaFer可能在香魚抗細菌侵染的免疫反應中發(fā)揮著重要作用。

圖4 鰻弧菌感染后香魚各組織中PaFer mRNA的表達變化Fig.4 Analysis on PaFer mRNA expression changes in various tissues of V. anguillarum infected ayu

圖5 PaFer的原核表達及純化Fig.5 Prokaryotic expression of PaFer in Escherichia coli and its purification

圖6 不同濃度rPaFer的鐵螯合能力Fig.6 Iron chelation activity of rPaFer in different concentrations

研究表明, 半滑舌鰨、條石鯛和牙鲆Fer-M重組蛋白表現(xiàn)出顯著的鐵螯合活性, 分別在濃度為 8、6和 8μg/mL時鐵螯合能力最強(Wanget al, 2011;Elvitigalaet al, 2013; Wanget al, 2015), 而且牙鲆Fer-M 重組蛋白能完全抑制遲緩愛德華氏菌的生長,半滑舌鰨Fer-M重組蛋白能完全抑制鰻弧菌的生長。在本實驗中, rPaFer具有明顯的鐵螯合能力, 并能體外抑制三種魚類重要的弧菌病原鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的生長, 與上述研究結(jié)果基本一致。結(jié)合病原菌感染誘導魚體各組織中Fer表達量大幅上調(diào)這一結(jié)果, 我們推測, 由于鐵是大部分微生物生長和維系其致病性的必需元素(Bullen, 1981), 當病原菌感染魚體后, 短時間內(nèi)鐵蛋白大量合成, 一方面通過螯合環(huán)境中對細菌代謝所必需的鐵離子來抑制細菌的繁殖(Ong et al, 2006), 另一方面, 由于魚體血漿內(nèi)鐵離子含量大大降低(Lauffer, 1992), 大量合成的鐵蛋白可維持體內(nèi)鐵含量的穩(wěn)定, 從而參與調(diào)控鐵代謝以及抵抗微生物的宿主自身免疫過程。

4 結(jié)論

本研究測定了香魚 Ferritin基因的 cDNA序列,序列分析揭示它與虹鱒和大西洋鮭Ferritin M亞基序列最為相似。健康香魚中, PaFer mRNA在脾中表達量最高, 鰻弧菌感染后, PaFer mRNA在各組織中表達量顯著上調(diào); 鐵結(jié)合能力和抑菌活性實驗表明,PaFer重組蛋白具有明顯的鐵結(jié)合能力, 且對鰻弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌生長均有明顯抑制作用, 揭示PaFer與香魚抗病原感染的免疫反應緊密相關(guān), 可能通過調(diào)控鐵代謝參與魚類抵抗微生物的宿主自身免疫過程。研究結(jié)果為進一步研究魚類鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能機制奠定了基礎。

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