鐵寶霞 楊波 桑偉 孫曉月孫鵬進(jìn) 閆柯 高峰

作者單位：730050 蘭州 1甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2蘭州軍區(qū)總醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡第2大常見原因［1］，在我國位居惡性腫瘤病死率第 5 位［2］，發(fā)病率在發(fā)展中國家呈上升趨勢［1，3］。CRC發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟的過程，美國通過有效地篩查和切除癌前病變，CRC發(fā)生率每年下降2%，但早期CRC檢出率仍不足5%［1］，因此探索CRC篩查和早期診斷方法仍是該領(lǐng)域?qū)W者共同努力的方向。糞便DNA檢測作為一種新興的非侵入性篩查方法，在CRC篩查中具有較大應(yīng)用前景。本文就近年糞便DNA檢測在CRC篩查和早期診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 CRC糞便DNA檢測原理

結(jié)直腸黏膜表面細(xì)胞不斷脫落到腸腔，脫落后的癌細(xì)胞比正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞有生存優(yōu)勢，正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞在原位發(fā)生凋亡，或從基底膜分離時迅速退化，然后被巨噬細(xì)胞吞噬；而結(jié)直腸癌細(xì)胞通?？傻挚共⑻用撌С驳蛲龆３滞暾?，可持續(xù)從結(jié)直腸黏膜脫落［4］。脫落的癌細(xì)胞排出體外期間可暫時存在于黏液層而進(jìn)一步得到保護(hù)［5］。但難以從右側(cè)結(jié)腸腫瘤患者收集完整的結(jié)腸細(xì)胞［6］。因此，檢測發(fā)育不良的癌細(xì)胞成分比全細(xì)胞檢出率更高。同時腫瘤大量發(fā)育異常細(xì)胞及其成分脫落進(jìn)入腸腔，亦為糞便檢測提供了分析標(biāo)本。結(jié)直腸屬于堿性環(huán)境，DNA能在糞便內(nèi)穩(wěn)定存在［7］，且保持完整，較片段化DNA更易檢測［8］。此外，可從糞便標(biāo)本中分離DNA進(jìn)行生物標(biāo)志物分析，用于CRC或腺瘤早期檢測。腫瘤最常見的表觀遺傳學(xué)改變是DNA異常甲基化，而DNA甲基化常發(fā)生在結(jié)直腸癌早期，易在患者糞便中檢測。

2 CRC糞便DNA單基因檢測

2.1 腺瘤性結(jié)腸息肉病基因

腺瘤性結(jié)腸息肉病基因（adenomatous polyposis coli gene，APC）位于染色體 5q21-22，長約 108 kb，屬于抑癌基因，負(fù)責(zé)調(diào)控Wnt信號通路中生長促進(jìn)基因誘導(dǎo)因子β-連環(huán)蛋白（β-catenin）。APC基因突變發(fā)生在CRC早期階段，突變的APC蛋白不能下調(diào)和抑制Wnt信號通路中的β-catenin，但可能導(dǎo)致其免于降解，使游離的β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)集聚并進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活下游相關(guān)靶癌基因，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［9］。有研究報道，APC基因突變可引發(fā)結(jié)直腸腺瘤性息肉，也可直接導(dǎo)致家族性腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP）發(fā)生［10］。Traverso 等［11］檢測 28例非轉(zhuǎn)移性CRC患者及18例腫瘤直徑＞1 cm腺瘤患者糞便樣本中APC基因突變情況，結(jié)果26例被檢出APC突變（敏感性為57%），而對照組均未檢出。以上研究提示，APC基因突變與CRC早期事件發(fā)生關(guān)系密切，檢測APC基因可能有助于CRC篩查。

2.2 p53基因

p53基因位于染色體17p，全長16～20 kb，是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最強(qiáng)的抑癌基因。在CRC中，p53基因突變主要發(fā)生在進(jìn)展期腺瘤向癌轉(zhuǎn)變階段，亦是此過程的關(guān)鍵因素。鐘選芳等［12］在CRC篩查中發(fā)現(xiàn)p53基因在CRC和結(jié)直腸腺瘤中的突變率達(dá)65.2%和25.0%，而正常組不存在突變。劉三紅等［13］從20例CRC手術(shù)切除腫瘤組織和術(shù)前糞便中分別提取DNA，發(fā)現(xiàn)癌組織均有p53外顯子5～8特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其中發(fā)生突變12例；糞便標(biāo)本80%有p53特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，8例檢測到相同的基因突變，p53突變的檢出敏感性為66.7%。提示CRC患者或CRC癌前病變患者糞便中均可能存在p53基因突變，其在CRC患者糞便和腫瘤組織中亦存在。因此，糞便中突變的p53基因或可作為早期發(fā)現(xiàn)CRC或CRC癌前病變的重要生物標(biāo)志物，對其檢測可作為結(jié)直腸癌篩查的重要輔助手段。

2.3 K-Ras基因

K-Ras基因?qū)儆赗as基因家族，位于染色體12p，編碼蛋白屬三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白類，主要參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。K-Ras基因突變使GTP蛋白穩(wěn)定處于活化狀態(tài)并持續(xù)信號傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞無控制增生并惡性轉(zhuǎn)化。在K-Ras基因突變中，主要是密碼子12、13和61突變。吳偉等［14］觀察散發(fā)性CRC K-Ras基因12、13密碼子位點(diǎn)突變情況，發(fā)現(xiàn)12和13密碼子均可發(fā)生突變，12密碼子突變發(fā)生率最高，且易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Li等［15］鑒定CRC和結(jié)直腸晚期腺瘤患者糞便中K-Ras基因的突變情況，突變率分別為82.4%和80.0%，且糞便樣本（45.0%）和參考組織樣本（55.0%）的突變檢測率高度一致。綜上，目前K-Ras基因已應(yīng)用于臨床，但僅限于血液和腫瘤組織檢測，對結(jié)直腸癌篩查有一定價值，在糞便DNA檢測中的應(yīng)用僅在研究階段，未應(yīng)用于臨床。

2.4 痙攣性截癱-20基因

痙攣性截癱-20 基因（spastic paraplegia 20，SPG20）定位于13q13.3染色體，編碼Spartin多功能蛋白。研究證實(shí)SPG20基因甲基化與CRC密切相關(guān)。Lind等［16］研究顯示，在CRC或腺瘤細(xì)胞中SPG20基因啟動子區(qū)域呈異常高甲基化狀態(tài)，而正常黏膜中沒有SPG20高甲基化。Zhang等［17］收集96例CRC患者癌組織和糞便樣本以及30份健康者糞便樣本，結(jié)果顯示，在組織樣本中，85.4%發(fā)生SPG20超甲基化；在CRC患者糞便樣本中，80.2%發(fā)生SPG20超甲基化，特異性為100%，糞便SPG20基因甲基化檢測結(jié)果與組織檢測結(jié)果基本一致。提示糞便SPG20基因甲基化或可代替結(jié)直腸癌組織作為CRC診斷的非侵入性生物標(biāo)志物。

2.5 分泌型卷曲相關(guān)蛋白2基因

分泌型卷曲相關(guān)蛋白2基因（secreted frizzled-re lated protein，SFRP2）是分泌性糖蛋白家族的重要成員，亦是腫瘤Wnt/β-catenin信號通路的拮抗因子之一。有研究報道，當(dāng)SFRP2基因發(fā)生甲基化而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默時，其對Wnt信號的拮抗作用減弱或消失，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［18］。Zhang等［19］分析 48 例 CRC 患者、35例腺瘤患者、32例增生性息肉和30名正常人糞便樣本中SFRP2基因啟動子的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)56.3%的CRC患者、51.4%的腺瘤患者和12.5%的增生性息肉患者檢測到高甲基化的SFRP2。有報道［20］SFRP2啟動子甲基化是非常敏感的糞便DNA檢測單一標(biāo)志物。Kriegsh?user等［21］應(yīng)用甲基化特異性反向雜交法（methylation-specific reverse hybridization，MSRH）檢測18例CRC患者和22名健康志愿者SFRP2基因啟動子甲基化狀況，以熒光定量法作為參照，兩種測定方法均顯示CRC患者SFRP2基因啟動子被甲基化，檢測結(jié)果一致。綜上認(rèn)為，糞便DNA中高甲基化的SFRP2是一種新型的分子生物標(biāo)志物，對診斷早期CRC有較好應(yīng)用前景。

2.6 磷酸酶肌動蛋白調(diào)節(jié)因子3

磷酸酶肌動蛋白調(diào)節(jié)因子3（PHACTR3）定位于20q13.32-q13.33染色體，全長281.3 kb。Rasmussen等［22］系統(tǒng)評價了31篇涉及糞便樣本的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在糞便樣本中，超甲基化的PHACTR3與早期CRC相關(guān)。Bosch等［23］研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸黏膜相比，晚期腫瘤的PHACTR3基因甲基化水平增加了70倍以上，糞便PHACTR3基因甲基化診斷CRC的敏感性達(dá)66%，特異性為100%，診斷進(jìn)展性腺瘤的敏感性為32%。PHACTR3基因是一個新發(fā)現(xiàn)的CRC高甲基化基因，在CRC篩查中亦有一定應(yīng)用前景。

3 CRC糞便DNA多基因聯(lián)合檢測

早期關(guān)于CRC糞便DNA的研究多限于單基因突變檢測，但其靈敏度并不理想。近年，學(xué)者致力于糞便多基因多靶點(diǎn)聯(lián)合檢測研究，以尋求最佳敏感性和特異性組合。

3.1 K-Ras、APC、p53、BAT-26 和 BRAF 基因

Binefa等［24］分析了26例CRC患者糞便中的K-Ras和p53基因，發(fā)現(xiàn)多靶點(diǎn)檢測可提高糞便DNA的敏感性和特異性。Yang等［25］采用L-DNA分析K-Ras、p53和APC基因突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性標(biāo)記BAT-26，其聯(lián)合檢測CRC的敏感性為91%，特異性為93%。Oh等［26］在對4 000多例受試者的大型多中心研究中，發(fā)生結(jié)直腸浸潤性癌糞便DNA檢測的敏感性是糞便隱血試驗(yàn)的4倍（51.6%vs 12.9%，P=0.003），是高度異型增生腺瘤敏感性的2倍以上（40.8%vs 14.1%，P<0.001），提示糞便DNA較糞便隱血試驗(yàn)?zāi)芨舾械貦z測早期CRC。Kalimutho等［27］使用定量變性高效液相色譜法檢測K-Ras、APC、p53和 BRAF基因量化糞便DNA完整性狀態(tài)，結(jié)果顯示，4個基因擴(kuò)增分析提高了對單基因擴(kuò)增、鈣衛(wèi)蛋白評估或免疫法糞便隱血試驗(yàn)（immune fecal occultbloodtest，IFOBT）的敏感性。

3.2 SFRP和WIF-1基因

張虎等［28］研究發(fā)現(xiàn)糞便中 SFRP1、SFRP2、SFRP5和WIF-1基因在CRC及腺瘤中均被甲基化，在CRC中的甲基化率分別為68.8%、56.3%、45.8%和60.4%，高于腺瘤和增生性息肉。聯(lián)合檢測4種糞便基因甲基化，CRC和腺瘤的檢出率提高，敏感性高達(dá)81.8%，特異性為93.3%，明顯高于糞便隱血試驗(yàn)。Aguilera等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在整個CRC發(fā)生過程中出現(xiàn)SFRP1、SFRP2和WIF-1基因甲基化相關(guān)沉默，提示糞便中Wnt拮抗基因甲基化可能成為篩查早期結(jié)直腸癌非侵入性的生物學(xué)標(biāo)志物。

3.3 BMP3、NDRG4、TFPI2、vimentin 和 SFRP2 基因

有研究聯(lián)合檢測 NDRG4、BMP3、TFPI2和vimentin 4個甲基化基因，CRC的檢出率為85%，腫瘤直徑≥1 cm的腺瘤患者檢出率為54%，特異性為90%［30］。Imperiale 等［31］應(yīng)用高甲基化 NDRG4、BMP3與K-Ras突變，發(fā)現(xiàn)糞便DNA檢測CRC的敏感性為92.3%，特異性為86.6%，在檢測晚期癌前病變方面優(yōu)于IFOBT，但特異性較低。Park等［32］研究發(fā)現(xiàn)，甲基化的NDRG4、BMP3、TFPI2和SFRP2啟動子在CRC樣本中檢測率分別為68.8%、40.0%、31.4%和60.0%，高于腺癌樣本中的檢出率，4個標(biāo)志物聯(lián)合檢測CRC和腺癌的敏感性分別為94.3%和72.2%，但特異性較低。提示 NDRG4、BMP3、TFPI2 和 vimentin 或 SFRP2 基因聯(lián)合檢測，敏感性較高，但3個或4個甲基化標(biāo)志物檢測尚不足以用于人群CRC篩查，需進(jìn)一步驗(yàn)證人群中這些標(biāo)志物的甲基化，為CRC尋找新的標(biāo)志物。

3.4 TMEFF2、MGMT和SFRP2基因

Johnson 等［33］研究 SFRP2、TMEFF2 和 MGMT 基因在CRC患者糞便樣本中的甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)超甲基化的TMEFF2和單獨(dú)MGMT僅顯示中等敏感性和特異性，加入SFRP2分析后，診斷CRC和癌前病變的敏感性增加到93.7%。有研究發(fā)現(xiàn)，超甲基化的SFRP2診斷高度發(fā)育不良腺瘤的敏感性為46.0%～66.7%，亦提示其在CRC早期發(fā)展中的作用［34］。由此認(rèn)為，聯(lián)合檢測TMEFF2、MGMT和SFRP2基因可能對 CRC及其癌前病變診斷具有重要作用。

4 展望

CRC發(fā)病是結(jié)直腸細(xì)胞DNA中遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的逐漸積累，單基因突變或分子標(biāo)志物改變常被用于CRC篩查，糞便DNA檢測具有非侵入性、患者依從性好、高敏感性和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，但單基因檢測的敏感性和特異性并不理想，多基因聯(lián)合檢測成為研究熱點(diǎn)。然而，目前糞便DNA檢測費(fèi)用較高，檢測技術(shù)亦尚不成熟，如何選擇合理聯(lián)合檢測基因以提高CRC檢測敏感性及特異性是面臨的難題和挑戰(zhàn)。相信隨著該領(lǐng)域?qū)W者不懈努力以及分子生物技術(shù)不斷發(fā)展，糞便DNA檢測技術(shù)有望成為CRC早期診斷及篩查的重要輔助手段。