丁智穎 綜述 明健 審校

國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為抑癌基因的失活和癌基因的激活與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與有關(guān)。近年來分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了很多新的癌基因和抑癌基因，PTEN基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）（與張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因）與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移及凋亡有關(guān)，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因。目前多數(shù)研究證實(shí)PTEN基因在子宮內(nèi)膜癌中的突變率高于K-ras、P53等，被稱為管家基因，作為早期診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標(biāo)志物。

一、 PTEN基因的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)

（一）PTEN基因的發(fā)現(xiàn)

1997年Li等[1]應(yīng)用代表性差異法對(duì)原發(fā)性乳腺癌10q23同源性丟失區(qū)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)一種新基因—PTEN。同時(shí)Steck等[2]用外顯子俘獲法在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中分離出定位于染色體10q23上的腫瘤抑制基因，認(rèn)為其與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，將其命名為多種進(jìn)展期癌中發(fā)生突變的基因。1997年4月另一研究小組在研究細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶時(shí)克隆出一種在人體上皮細(xì)胞內(nèi)豐富表達(dá)的酪氨酸磷酸酶，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可使其下調(diào)[3]，將其命名為 TGF-β 調(diào)節(jié)的上皮細(xì)胞富含的磷酸酯酶。后來人們通過比較三者的cDNA和表達(dá)的蛋白質(zhì)，將其鑒定為同一基因?，F(xiàn)在叫做PTEN。

（二）PTEN基因的結(jié)構(gòu)

PTEN基因位于10q23.3染色體上，cDNA序列由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，包含1 209個(gè)核苷酸，編碼403個(gè)氨基酸[1-2]。PTEN是具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白質(zhì)磷酸酶雙特異性作用的磷酸酶。5'端有804個(gè)核苷酸的非翻譯區(qū)，該區(qū)有鳥嘌呤和胞嘧啶重復(fù)的多個(gè)序列，為甲基化提供了基礎(chǔ)。編碼第5外顯子的122 ～ 133個(gè)氨基酸的蛋白酪氨酸磷酸酶區(qū)域與蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的催化中心具有同源序列，認(rèn)為PTEN具有雙特異性磷酸酶功能[4]。PTEN蛋白高度保守，有2個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：N端功能域，磷酸酶結(jié)構(gòu)域，含有一段參與細(xì)胞的聚集粘著的蛋白酪氨酸磷酸酶催化區(qū)與調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸小泡運(yùn)輸?shù)膹埩Φ鞍缀洼o助蛋白同源區(qū)，其突變熱點(diǎn)位于第5外顯子區(qū)域（活性位點(diǎn)）；C端含有C2結(jié)構(gòu)域、PEST結(jié)構(gòu)域（350-375，379-396）和PDZ結(jié)構(gòu)域（PSD95，Dlg和ZOl），PTEN不需要鈣離子的協(xié)助能直接連接到細(xì)胞膜上與C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的結(jié)合和蛋白質(zhì)膜定位有關(guān)；PDZ結(jié)構(gòu)域可以增強(qiáng)PTEN的磷酸酶活性和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；PEST結(jié)構(gòu)域可以維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[5-8]。

（三） PTENP1的研究現(xiàn)狀

1. PTENP1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：長(zhǎng)非編碼RNA（IncRNAs）是一種缺少啟動(dòng)子而不能編碼蛋白質(zhì)的基因，長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，與腫瘤生長(zhǎng)及多種生物學(xué)功能有關(guān)，PTENP1屬于IncRNAs的一種。PTENP1是一個(gè)位于9p13.3的單外顯子基因，是反轉(zhuǎn)錄形成的PTEN基因無內(nèi)含子拷貝。雖然以前報(bào)道PTENP1不發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但是最近的數(shù)據(jù)表明PTENP1 mRNA在正常和癌組織中都有廣泛的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)PTENP1與PTENmRNA序列同源性為97.8%，二者 CpG島921 bp區(qū)同源性為91%[9]。就3' UTR而言，PTENP1 3'UTR由2個(gè)區(qū)域組成。上游區(qū)域（R1）與PTEN的相應(yīng)區(qū)域同源性為95%。而中部區(qū)域（R2）的同源性下降到50%。3'UTR是與miRNA結(jié)合之處，研究人員推測(cè)兩者接受相同的miRNA調(diào)控。PTENP1序列與PTEN序列的差異僅為18次錯(cuò)配，其中一次錯(cuò)配引發(fā)了蛋氨酸密碼子的錯(cuò)義突變導(dǎo)致起始密碼子消除而不能編碼蛋白質(zhì)[10]。

2. PTENP1在惡性腫瘤中的作用機(jī)制：（1）直接調(diào)控PTEN在子宮內(nèi)膜癌及多種其他腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，PTENP 1的轉(zhuǎn)錄水平總體上低于PTEN水平。二者表達(dá)水平呈正相關(guān)[11]。盡管PTENP 1表達(dá)水平較低，仍可發(fā)揮生物學(xué)活性，在基因的多個(gè)水平對(duì)PTEN發(fā)揮調(diào)控作用，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制作用[12]。（2） ceRNA 假說：microRNA（miRNA）是一類短的非編碼RNA，通過與mRNA序列特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)促進(jìn)mRNA降解或抑制翻譯[12]。研究發(fā)現(xiàn)在PTEN完全缺失的黑色素瘤中PTENP 1仍表現(xiàn)出抑制腫瘤作用[13]，還有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)PTENP 1的表達(dá)，會(huì)引起PTEN的增加，但PTEN水平仍低于正常上皮[14]。說明PTENP 1和PTEN存在共同的靶miRNA，PTENP 1通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，間接調(diào)控PTEN的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制作用。Qin等[15]在子宮內(nèi)膜癌中用雙熒光素酶證實(shí)miR- 21與PTEN 3' UTR直接結(jié)合，調(diào)節(jié)PTEN蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖。Kovalenko等[16]通過研究PTEN及PTENP1的5'端序列在子宮內(nèi)膜癌和增生組織中的甲基化，表明PTENP 1基因序列的甲基化可以抑制miRNAs參與的PTEN轉(zhuǎn)錄過程，并符合競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性miRNAs，PTEN基因的表達(dá)伴隨著miRNAs干擾機(jī)制的抑制。參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制。Masunaga等[17]通過對(duì)胸腺瘤研究發(fā)現(xiàn)PTENP 1基因的轉(zhuǎn)錄本是PTENmRNA對(duì)抗PTEN相關(guān)miRNAs的誘餌。 miRNAs與PTENmRNA相互作用并抑制PTENmRNA翻譯，PTENP 1的轉(zhuǎn)錄可以與PTEN靶向miRNAs競(jìng)爭(zhēng)，是PTENmRNA與PTEN靶向miRNAs相互作用的調(diào)節(jié)因子。miR-20a[18]、miR-19b[19]、miR-106b /miR-93[20]和 miR-21[21]等是目前研究的與此機(jī)制有關(guān)的miRNA。（3）編碼反義RNA與mRNA 互補(bǔ)的RNA分子稱為反義RNA，研究發(fā)現(xiàn)PTENP 1有2個(gè)RNA亞型。α亞型對(duì)PTEN的轉(zhuǎn)錄在表觀遺傳水平上起到負(fù)向調(diào)控，它與PTEN啟動(dòng)子結(jié)合，通過募集DNMT3a和EZH 2（染色質(zhì)阻遏蛋白）起作用。相反，β型通過mRNA與PTENP 1的配對(duì)結(jié)合，改變PTENP 1的穩(wěn)定性和miRNA活性從而促進(jìn)PTEN表達(dá)[22]。

3.影響PTENP1表達(dá)的因素：（1）啟動(dòng)子的異常甲基化Kovalenko等[23]分析了PTEN和PTENP 1在子宮內(nèi)膜增生和癌癥中的甲基化狀態(tài)。18例子宮內(nèi)膜癌中11例PTEN基因啟動(dòng)子未甲基化，9例子宮內(nèi)膜增生中5例PTENP 1甲基化。PTENP 1啟動(dòng)子的異常甲基化高于PTEN。去甲基化藥物處理后的細(xì)胞系兩者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平提高。（2）基因拷貝缺失：一組基因庫數(shù)據(jù)正式證明了PTENP1位點(diǎn)上存在著獨(dú)立的基因組拷貝數(shù)丟失，細(xì)胞系中存在拷貝數(shù)的缺失則PTENP 1 表達(dá)水平更低。染色體9p的缺失、CDKN2A位點(diǎn)缺失與該拷貝的缺失無關(guān)[12]。

二、PTEN在子宮內(nèi)膜癌中的突變

1983年，Bokhman等[24]定義了兩種類型的子宮內(nèi)膜癌，指出“Ⅰ型”癌癥被認(rèn)為是由雌激素驅(qū)動(dòng)的，主要是低級(jí)別的子宮內(nèi)膜樣癌，“Ⅱ型”癌癥代表較高級(jí)別的非子宮內(nèi)膜樣癌，與雌激素刺激無關(guān)或在萎縮的子宮內(nèi)膜發(fā)生。WHO將子宮內(nèi)膜癌分為子宮內(nèi)膜癌、漿液癌、癌肉瘤和透明細(xì)胞癌[25]。目前認(rèn)為BokhmanⅠ型與WHO分型中的低度子宮內(nèi)膜癌相對(duì)應(yīng)。Ⅱ型主要對(duì)應(yīng)的是漿液性癌和透明細(xì)胞癌。分子學(xué)特征檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅰ型）易發(fā)生PTEN、CTNNB1（β-catencin）、ARID1A （BAF250a）、PIK3CA基因突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，而非子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅱ型）分子學(xué)改變主要為p53抑癌基因突變[26-27]。 Tashiro等[28]檢測(cè)的16例子宮內(nèi)膜癌患者中PTEN突變均發(fā)生在子宮內(nèi)膜樣癌。徐冰等[29]研究了子宮內(nèi)膜癌52例、正常子宮內(nèi)膜10例，發(fā)現(xiàn)PTEN突變見于預(yù)后較好的子宮內(nèi)膜樣癌，未發(fā)生PTEN突變見于腺鱗癌、漿液性乳頭狀腺癌、透明細(xì)胞癌和鱗癌。子宮內(nèi)膜樣癌和非子宮內(nèi)膜樣癌具有不同分子途徑，前者多數(shù)患者預(yù)后較好，在組織上有一定程度的子宮內(nèi)膜分化，而后者預(yù)后較差，多發(fā)生于萎縮無增生的子宮內(nèi)膜，兩者基因突變機(jī)制不同。

三、PTEN的抑癌機(jī)制

PTEN基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及血管生長(zhǎng)主要是通過影響下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K/protein kinase B，Akt/the mammalian target of Rapamycin，mTOR）、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）這3條信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的，該基因的丟失或突變均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

1. PI3K/AKT/mTOR途徑：PI3K是一種二聚酶，它由調(diào)控亞基P85和催化亞基p110組成。PI3K由3種亞型組成，只有IA型的PI3K與人類癌癥有關(guān)，AKT激酶家族有3種高度同源的亞型：AKT1、AKT2和AKT3。雷帕霉素（mTOR）是一種重要的調(diào)控因子，通過mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲?；罨腜I3K / AKT通路促進(jìn)mTORC1活化，mTORC1過活化也導(dǎo)致PI3K / AKT信號(hào)的反饋抑制[30]。PI3k / AKT / mTOR途徑可以被多種受體激活，刺激PI3K轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上，4，5一 二 磷 酸 磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol一 4，5一trisphosphate，PIP2）磷酸化為 3，4，5 一三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol一3，4，5一trisphosphate，PIP3）。隨后，PIP 3激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和AKT。上游激酶AKT磷酸化失活結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2，使mTOR激活，從而允許信號(hào)傳播[31-32]。PTEN負(fù)性調(diào)控該通路，PTEN產(chǎn)物具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶活性。脂質(zhì)磷酸酶活性在G2/S檢查點(diǎn)引起細(xì)胞周期阻滯，通過將PIP 3脫磷酸化回PIP 2而抑制PIP 3磷酸化，并影響下游的AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使AKT介導(dǎo)的抑制凋亡作用減弱，這樣可以控制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖失控，使腫瘤消退。蛋白磷酸酶活性可以抑制細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移。因此，PTEN活性的喪失導(dǎo)致細(xì)胞異常生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡的逃逸[26]。

2. FAK途徑：FAK是細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)、細(xì)胞存活、增殖和活力的重要介質(zhì)[33]。Taumra等[34]在缺失PTEN的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTEN基因，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，推測(cè)PTEN參與了整合素介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移途徑，F(xiàn)AK磷酸化而被激活，活化的FAK進(jìn)而激活p130crk聯(lián)系底物（p130crk-associated substrate，p130ca）磷酸化，二者結(jié)合成FAK/P130Cas復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。PTEN通過抑制FAK的磷酸化，從而抑制細(xì)胞的遷移。同樣在人類胃癌組織中，PTEN蛋白水平與FAK蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，PTEN抑制胃癌的增長(zhǎng)和入侵FAK的表達(dá)[35]。而且在對(duì)小細(xì)胞肺癌的研究結(jié)果也顯示，p53 / PTEN缺陷增加了FAK信號(hào)通路過度激活相關(guān)的侵襲能力[36]。Waite等[37]和Diao等[38]通過實(shí)驗(yàn)證明，PTEN基因中存在較高同源性的兩部分：N端序列、整合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中的細(xì)胞骨架蛋白tensin，其突變和失活與部分腫瘤的惡性進(jìn)展常有關(guān)，細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移中可能有PTEN的參與。結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的整合蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白與FAK連接，同時(shí)，配體整合素-FAK-p130Ccas復(fù)合物能啟動(dòng)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3. 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK / MAPK途徑：Yart等[39]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN過表達(dá)可選擇性抑制與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的ERK通路持續(xù)活化，從而負(fù)性調(diào)節(jié)ERK / MAPK信號(hào)途徑，作用方式主要有：（1）通過抑制Shc磷酸化而抑制MAPK，然后阻止下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；（2）阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)是通過影響胰島素受體底物 1的磷酸化水平和胰島素受體底物1/Grb2/SOS復(fù)合物形成，使MAPK的磷酸化作用下降，抑制了細(xì)胞周期素Dl實(shí)現(xiàn)的；（3）PTEN還可以影響ERK/MAPK信號(hào)上游Ras的活化，抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；（4）PIP3脫磷酸可以阻斷Gabl向胞膜轉(zhuǎn)移，從而阻滯MAPK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[39-40]。

四、抑癌基因PTEN及PTENP1在子宮內(nèi)膜癌中的臨床意義

1. PTEN的臨床意義：PTEN基因?qū)?xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用在突變或缺失時(shí)失去作用，磷酸酶活性喪失，從而使細(xì)胞持續(xù)增殖、惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了腫瘤的形成。因此，PTEN可作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷的標(biāo)志物—子宮內(nèi)膜癌的管家基因。Samar等[41]研究認(rèn)為PTEN表達(dá)缺失與組織學(xué)類型有關(guān)（P＜ 0.05），與病理分級(jí)無關(guān)（P＞ 0.05）。Veyse 等[42]認(rèn)為PTEN陽性組與陰性組在分期、分級(jí)、LVSI、腫瘤大小等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。PTEN陽性表達(dá)與肌層浸潤(rùn)呈正相關(guān)（P= 0.02）。Akiyama等[43]認(rèn)為臨床分期早、組織學(xué)分化程度高和無淋巴血管侵犯等生物學(xué)行為較好的子宮內(nèi)膜癌患者中常發(fā)生PTEN基因的突變。研究人員通過子集分析法發(fā)現(xiàn)， 早期（Ⅰ和Ⅱ期）患者PTEN基因丟失的趨勢(shì)強(qiáng)于晚期（Ⅲ和Ⅳ期）患者（P＜ 0.05）。因此早期診斷子宮內(nèi)膜癌及癌前病變有賴于對(duì)PTEN基因表達(dá)缺失的檢測(cè)。魯曉東等[44]發(fā)現(xiàn)PTENmRNA 表達(dá)量在正常子宮內(nèi)膜組織中最高，在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)低于增生的子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。PTENmRNA表達(dá)水平在腺癌和鱗癌間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05）。PTENmRNA 表達(dá)水平在FIGO分期高、肌層浸潤(rùn)深和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。PTENmRNA診斷子宮內(nèi)膜癌的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為85.3%、83.6%和0.842%。將PTEN作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷的分子標(biāo)志物，有較好的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。

2. PTENP1的臨床意義：研究人員在腎透明細(xì)胞癌、胃癌中建立了應(yīng)用PTENP1聯(lián)合其他 lncRNAs用于早期診斷的分子生物學(xué)模型[45-46]。在口腔鱗癌、食管鱗癌和腎透明細(xì)胞癌中PTEN的表達(dá)量和疾病的預(yù)后正相關(guān)[21、47-48]。在子宮內(nèi)膜癌中PTENP1呈低表達(dá)且表達(dá)陽性組比陰性組復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率要低[11]。PTENP1在子宮內(nèi)膜癌早期診斷及預(yù)后方面意義重大，需要大樣本資料繼續(xù)深入研究。

3. PTEN和PTENP1在子宮內(nèi)膜癌的治療進(jìn)展：目前在子宮內(nèi)膜癌中針對(duì)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路為靶點(diǎn)的新型特異性藥物如：PI3K 抑制劑：渥曼青霉素、LY294002、BYL719等，AKT 抑制劑：派立福辛，mTOR 抑制劑：雷帕霉素及其衍生物替西羅莫司、依維莫司，PI3K/mTOR 雙重抑制劑：XL765、GDC-0980 和 PF-04691502 等，這些藥物在子宮內(nèi)膜癌的臨床試驗(yàn)中取得了滿意的療效。但是單藥治療的療效并不滿意，如何聯(lián)合其他化療藥物、放療等手段治療子宮內(nèi)膜癌仍然需要更深入的研究[49]。LncRNAs是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，處于起步階段，研究最多的是各種腫瘤中ceRNA機(jī)制方面，PTENP1的研究為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。

PTEN基因自發(fā)現(xiàn)以來一直是研究的熱點(diǎn)，它受多種因素調(diào)控，主要通過3條信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的發(fā)育，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PTEN基因突變僅局限于Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中未檢測(cè)到該基因突變。子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)有賴于PTEN基因突變的檢測(cè)，并為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了新的靶點(diǎn)。在PTEN基因突變的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中導(dǎo)入外源性PTEN基因，細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移會(huì)受到抑制，說明PTEN基因可以廣泛抑制細(xì)胞的增殖，有理由認(rèn)為PTEN的抑癌功能及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能，為人工調(diào)節(jié)PTEN水平及干涉其作用通路達(dá)到抑制腫瘤提供新的治療思路。對(duì)PTENP1的深入研究，為子宮內(nèi)膜癌靶向治療開辟了新的道路。