陳俊秋 陳津 黃梁滸 趙紅州 付云烽 林娜 朱凌峰 程遠航 王水良譚建明

胰島移植是治療糖尿病的有效方法[1]。2000年Shapiro等[2]首次報道臨床同種異體胰島移植，使1 型糖尿病患者完全脫離胰島素。根據(jù)國際胰島移植隨訪結(jié)果顯示，胰島移植可以改善血糖水平，1年后57%的患者擺脫胰島素依賴[3]。然而胰島移植效果在一定程度上受到移植胰島血管生成障礙所限制[4]。胰島屬內(nèi)分泌組織，分泌的激素直接釋放入血，因此是一個高度血管化的組織細胞團，其周圍的毛細血管網(wǎng)比外分泌組織的密度大5倍。豐富的毛細血管網(wǎng)絡(luò)為胰島提供信號、營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等，維持胰島存活和胰島功能[5-6]。異體胰島移植后，由于新血管尚未生成，無血管期的胰島因缺血、缺氧等引起胰島細胞大量凋亡[7]。此外高濃度的免疫抑制藥物的使用也影響胰島新血管的生成[4]。因此，提高移植胰島血管生成能力對提高胰島移植效果具有重要的意義。

間 充 質(zhì) 細 胞（mesenchymal stem cells，MSC）在體內(nèi)外均能延長胰島的存活時間，起到保護胰島的作用，但是機制尚未明確[8]。MSC外泌 體（Exosomes） 是 由MSC分 泌 的 直 徑 為30 ～ 100 nm的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，可以攜帶MSC的膜蛋白、胞內(nèi)蛋白、mRNAs和miRNAs，影響靶細胞的許多病理生理功能，如抑制免疫細胞增殖和活性，促進血管生成等[9-10]。MSC外泌體是否能促進胰島血管生成，進而提高移植胰島存活率，還尚未見到相關(guān)報道。本研究以小鼠胰島內(nèi)皮細胞MS-1為模型，探討低氧條件下，MSC外泌體對小鼠胰島血管生成的影響。

材料與方法

一、材料

DMEM高糖、低糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清（美國Hyclone公司）；超濾離心管（3 kDa，美國Millipore公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司），磷酸酶抑制劑（美國ROCH公司），蛋白酶抑制劑（美國Millipore Calbiochem 公 司）；鼠 抗 β-actin、CD63、CD81，兔抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HIF1-α、CD9、Flotilin 1 抗體（美國Abcam公司）；兔抗p-mTOR、mTOR抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（美國Thermo公司）；ECL顯色液（美國Thermo公司）；碳膜支持銅網(wǎng)、磷鎢酸染液（中佳科鏡公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：人臍帶MSC由福建省干細胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供，采用含胎牛血清10%的低糖DMEM培養(yǎng)基，按照本實驗室的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)[11]。胰島內(nèi)皮細胞MS-1購自中國科學院上海細胞庫，細胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，隔天換液。

2. MSC條件培養(yǎng)基制備及外泌體的提取：取生長至80%～ 90%的第4代MSC細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，加10 ml無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中，37 ℃、2 % O2、5%CO2低氧培養(yǎng)48 h， 1 200×g離心10 min去除細胞碎片。上清液用0.22 μm的抽濾器過濾后加入超濾管上柱中，4 000×g離心60 min，吸取超濾管內(nèi)富集的外泌體，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。

3.外泌體鑒定：吸取 10 ～ 15 μl外泌體吸附于碳膜支持銅網(wǎng)上，磷鎢酸染液負染1 ～ 2 min，PBS洗滌后晾干，透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)大小。取30 μg外泌體高溫變性后加樣電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，Western Blot方法檢測外泌體標志物CD9， CD81，CD63，F(xiàn)lotilin1的表達。

4.體外血管形成試驗：Matrigel膠4 ℃冰箱融化后加入到預冷的96孔板中，每孔分別加入MS-1細胞2×104個。低氧+外泌體組（HYP+EXO）每孔加入 10 μg/ml外泌體，常氧對照組（NOR）和低氧組（HYP）分別加入等體積PBS。NOR組放入37 ℃、5 % CO2、21%O2的常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，HYP和 HYP+EXO 組放入 37 ℃、2 % O2、5 % CO2的低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h后，觀察血管網(wǎng)形成情況，并用Image J軟件進行分析。

5.細胞mRNA提取及PCR分析：按照本實驗室常用的方法[12]，提取各組MS-1細胞總RNA，經(jīng)RNA定量后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別用Q-PCR和常規(guī)PCR方法檢測VEGF等血管形成相關(guān)基因的表達情況。PCR引物序列如下：VEGF（上游：5'-CACGACAGAAGGAGAGCAGA-3'；下 游：5'-CAGGGCTTCATCGTTACAGC-3'）。 常 規(guī) PCR結(jié)果通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果；Q-PCR結(jié)果以各自β-actin為內(nèi)參，以常氧組為對照，計算2-△△ct值為基因相對表達倍數(shù)。

6. Western Blot檢測VEGF及相關(guān)信號分子的表達：MS-細胞分為NOR組、HYP組和HYP+EXO組，平行培養(yǎng)24 h后，用100 μl裂解液刮下細胞，冰上裂解 10 min，4 ℃、12 000×g離心 30 min，取上清液作為蛋白樣本，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。取30 μg蛋白高溫變性后加樣電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，4 % BSA封閉1 h，加入兔抗鼠VEGF、p-mTOR、mTOR、HIF1-α一 抗（1 : 2 000稀釋）或β-actin內(nèi)參一抗（1 : 5 000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次后，加對應(yīng)的二抗孵育1 h， TBST洗滌3次后加入ECL發(fā)光液暗室曝光成像。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、MSC外泌體分離鑒定結(jié)果

收集MSC低氧條件培養(yǎng)基，經(jīng)超濾離心法富集后，獲得MSC培養(yǎng)上清液中的外泌體。經(jīng)磷鎢酸負染，透射電鏡檢測，獲得的外泌體直徑大小為30 ～ 100 nm 的微粒（圖 1）。經(jīng) Western Blot檢測，所獲得的外泌體表達CD9，CD63，CD81等外泌體標志物（圖 2）。

圖1 電鏡下觀察外泌體的形態(tài)大小（磷鎢酸負染，×50K）

圖 2 外泌體標志物Western Blot檢測鑒定

圖 3 倒置相差顯微鏡下觀察MSC外泌體促進胰島內(nèi)皮細胞MS-1血管形成（×100）

二、MSC外泌體對小鼠胰島內(nèi)皮細胞血管形成的影響

體外血管形成試驗結(jié)果顯示，常氧條件下，胰島內(nèi)皮細胞MS-1未見明顯的血管網(wǎng)形成；低氧條件下，低氧對照組可見少量網(wǎng)狀形成；而加入外泌體組可見大量血管網(wǎng)形成（圖3）。經(jīng)Image J分析，常氧組、低氧組、低氧加外泌體組的血管形成相對長度分別為（393.30±174.20，1467.00±230.00，2386.00±137.70）像素。低氧條件下，胰島內(nèi)皮細胞MS-1較常氧對照組相比，血管形成能力增加（t=4.874，P= 0.0396），而低氧加外泌體組與常氧對照組和低氧組相比，血管形成能力均提高（t= 12.30，P= 0.0065；t= 15.74，P= 0.0040，表 1）。

三、MSC外泌體上調(diào)胰島內(nèi)皮細胞VEGF表達

常規(guī)PCR結(jié)果顯示，低氧條件下，MS-1細胞VEGF表達上調(diào)，MSC外泌體明顯提高低氧條件下MS-1細胞VEGF基因的表達（圖4a，表1）。Q-PCR定量結(jié)果顯示，與常氧對照組（VEGF相對表達量為1.000）相比，低氧組VEGF相對表達量增高（6.52±3.50），差異有統(tǒng)計學意義（t= 4.461，P= 0.0029）；低氧加外泌體組VEGF相對表達量為（20.26±9.972），較常氧對照組和低氧組相比VEGF的表達量均明顯提高（t= 5.462，P= 0.0009；t= 4.238，P= 0.0038）。Western Blot結(jié)果也證實，在蛋白水平，MSC外泌體組VEGF表達也明顯增高（圖 4b）。

四、MSC外泌體上調(diào)HIF1-α和促進mTOR發(fā)生磷酸化

在含氧量正常的條件下，HIF1-α被蛋白酶迅速降解；在低氧條件下，HIF1-α可穩(wěn)定表達。加入MSC外泌體后，HIF1-α表達顯著上調(diào)。同時還發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路在低氧時發(fā)生磷酸化，MSC外泌體可顯著增強mTOR信號通路的磷酸化。（圖5）

表1 Image J血管形成長度分析和VEGF相對表達量

圖 4 MSC外泌體上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子基因表達

圖5 MSC外泌體上調(diào)HIF1-α表達和促進mTOR發(fā)生磷酸化

討 論

外泌體是直徑30 ～ 100 nm的脂質(zhì)雙分子層包裹有蛋白質(zhì)和核酸的小囊泡[9]，是細胞外膜微囊結(jié)構(gòu)重要組成部分[13]。外泌體可以在培養(yǎng)細胞的上清液中，以及許多類型體液中分離得到。MSC可以釋放外泌體，尤其是在低氧環(huán)境下MSC能釋放出大量的外泌體[14]。本研究中通過低氧條件培養(yǎng)MSC，通過超濾離心法，成功的富集MSC條件培養(yǎng)上清液中的外泌體。經(jīng)鑒定大小為30 ～ 100 nm，表達CD9，CD63，CD81等外泌體標志物[15]。

MSC來源的外泌體具有多種MSC的生物活性。MSC外泌體具有免疫抑制的作用，可以抑制T 細胞增殖和誘導CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞增殖，增強異體皮膚移植存活[16]；可以促進異體移植物存活和誘導供體特異的異體移植物免疫耐受[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSC及其來源的外泌體可以介導調(diào)節(jié)血管生成[18-19]。MSC來源的外泌體含有豐富的促血管生成作用的效應(yīng)分子，如血小板衍生生長因子，表皮細胞生長因子，成纖維細胞生長因子等，可通過激活NFκB信號通路調(diào)節(jié)血管生成[20]。一些研究者也在腎缺血再灌注和心肌損傷修復中證實了MSC膜微囊具有促進血管再生的作用[21-22]。本研究證實了MSC外泌體在低氧條件下，能夠促進胰島內(nèi)皮細胞MS-1分化形成血管。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體能夠上調(diào)MS-1細胞HIF1-α和VEGF的表達水平，并激活mTOR信號通路。

HIF1-α可調(diào)節(jié)多種血管生成因子的表達如促紅細胞生成素，表皮細胞生長因子，基質(zhì)金屬蛋白酶和血管生成素2等。在含氧量正常的條件下，HIF1-α被蛋白酶迅速降解；而在低氧條件下，可通過限制脯氨酰羥化酶的活性從而抑制HIF的羥基化，穩(wěn)定HIF1-α的表達[23]。VEGF是在內(nèi)皮細胞中分離和鑒定出來的特異性有絲分裂原，具有誘發(fā)血管再生的能力。在血管再生過程中發(fā)揮重要作用。它可以刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，增加血管的通透性[24]。VEGF與VEGFR結(jié)合后，可以通過激活PLCr-mTORC1信號通路，調(diào)節(jié)ATF6和PERK表達，促進內(nèi)皮細胞存活和血管生成[25]。

本研究結(jié)果表明，在體外細胞實驗中，MSC外泌體可促進低氧條件下的小鼠胰島內(nèi)皮細胞血管生成。MSC外泌體有可能通過上調(diào)HIF1-α，調(diào)節(jié)VEGF表達，激活mTOR信號通路，促進胰島內(nèi)皮細胞血管生成。