陳 媞，龍友華，2，劉阿麗，2，黃文源，2，李榮玉，2，尹顯慧，2，胡安龍，2，李 明，2，吳小毛，2*

( 1.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550025)

土壤酶是土壤中具有催化能力的一些特殊蛋白質(zhì)類化合物的總稱[1]。土壤中的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化離不開土壤酶的參與，因此可以根據(jù)一些土壤酶活性的變化來探明土壤中各類生物活動和化學(xué)過程的動向和強(qiáng)度。土壤酶活性不僅可以側(cè)面反映土壤的肥力，還能作為研究自然物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要參考。在探究污染物對土壤的影響時，土壤酶活性可以作為判斷和評價污染程度的敏感指標(biāo)[1-3]。

精異丙甲草胺(S-metolachlor) 是一種酰胺類除草劑，化學(xué)名為2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)-N-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙基]乙酰胺。精異丙甲草胺能夠抑制發(fā)芽的雜草種子蛋白質(zhì)的合成，對大部分一年生的單子葉雜草和某些闊葉雜草有良好的防除作用，在多種經(jīng)濟(jì)作物(玉米、煙草、蔬菜等)的田間除草上均有使用。酰胺類除草劑活性高，作用時間長，作用效果好，在農(nóng)業(yè)活動中廣泛施用的同時，其在土壤中的殘留以及造成的污染也引發(fā)了人們的重視[3-5]。本研究選用花溪煙田土壤為材料，采用毒理學(xué)實驗方法，記錄并評價精異丙甲草胺脅迫下煙田土壤過氧化氫酶、脫氫酶、脲酶和磷酸酶的動態(tài)變化過程，為全面客觀地評價精異丙甲草胺生態(tài)效應(yīng)提供參考，也有助于在煙草生產(chǎn)活動中安全、合理地使用該藥品。

1 材料與方法

1.1 供試藥品及試劑

精異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品[≥ 97.7%，85%(S)isomer]購自美國迪馬科技有限公司。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為二次重蒸水。

1.2 儀器和設(shè)備

6890N氣相色譜HP-5石英毛細(xì)管柱(美國Agilent)，SW-CJ-1FD 超凈工作臺 (杭州錢江儀器設(shè)備有限公司)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AL104分析天平(瑞士梅特勒)，HZQ-Q恒溫振蕩器(常州澳華儀器有限公司)，GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(蘇州江東精密儀器有限公司)，BIC-300人工氣候培養(yǎng)箱(上海博訊)等。

1.3 土樣采集和處理

1.3.1不同濃度精異丙甲草胺處理 土壤采自貴州貴陽花溪煙草種植試驗地，分別稱取500 g煙田土壤于1000 mL 燒杯中，28℃恒溫培養(yǎng)7 d后，分別加入含精異丙甲草胺濃度為1、3、6、9、12 mg/kg的甲醇溶液中，待溶劑揮發(fā)后攪拌均勻，用蒸餾水調(diào)節(jié)土壤水分至土壤最大持水量的60%，每處理均設(shè)3次重復(fù)，同時設(shè)空白對照。

土樣于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1、3、7、14、21、30、45和60 d后取樣測定土壤過氧化氫酶、脫氫酶、脲酶和磷酸酶的活性。適時稱重補(bǔ)充水分，保持土壤含水量恒定。

1.3.2根際土壤的采集與處理 在花溪煙草種植試驗地中，采集以烤煙K326煙株為中心15 cm半徑范圍鏟出整個土塊，抖落多余土壤后，將煙株根系連同與之緊密黏附的土壤置于保鮮袋帶回，仔細(xì)刷下并收集根系周圍的土壤，風(fēng)干，1 mm孔徑過篩，作為煙株根際土壤。

分別稱取2組500 g煙株根際土樣(或花溪煙田土樣)于1000 mL燒杯中，在其中1組根際土樣(或煙田土樣)中加入1 mL含精異丙甲草胺的甲醇溶液，使除草劑濃度均為6 mg/kg，用蒸餾水調(diào)節(jié)濕度至土壤最大持水量的60%，設(shè)置3個重復(fù)及1個空對照。培養(yǎng)方式同1.3.1。

1.4 測定對象和方法

過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，脫氫酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法測定，脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測定，磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 精異丙甲草胺對煙田土壤酶活性的影響

2.1.1過氧化氫酶

圖1 精異丙甲草胺對煙田土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil catalase

由圖1可知，低濃度(1～3 mg/kg)處理下，過氧化氫酶活性表現(xiàn)為先激活后恢復(fù)；中等濃度(6 mg/kg)或高濃度(9～12 mg/kg)精異丙甲草胺處理下，土壤過氧化氫酶活性的變化趨勢為激活-抑制-激活或恢復(fù)。試驗前14d，各濃度處理對土壤中過氧化氫酶活性均表現(xiàn)為激活作用，且激活程度與處理濃度成正比關(guān)系，在1 d時，激活程度達(dá)到最大值。1、3、6、9、12 mg/kg精異丙甲草胺處理的激活率分別為9.47、19.51、25.57、34.85、40.53%，除1～3 mg/kg處理組外，處理之間的酶活性均存在顯著差異。試驗14 d后，各濃度的抑制作呈現(xiàn)出減弱趨勢，其中低濃度(1～3 mg/kg)處理組的過氧化氫酶活性在21 d恢復(fù)至對照水平。而中、高濃度(6～12 mg/kg)處理組的酶活性從21 d開始被抑制，分別在45、60 d時恢復(fù)至對照水平。

2.1.2脫氫酶

圖2 精異丙甲草胺對煙田土壤脫氫酶活性的影響Fig.2 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil dehydrogenase

由圖2可知，低濃度(1～3 mg/kg)處理組在試驗期內(nèi)酶活性基本與對照持平；中、高濃度(6～12 mg/kg)處理組對脫氫酶活性的影響呈現(xiàn)激活-抑制-恢復(fù)-激活的變化過程。試驗進(jìn)行1周時，6～12 mg/kg各處理對土壤過氧化氫酶活性表現(xiàn)為與濃度成正比的激活作用，培養(yǎng)3 d時達(dá)到最大值，6、9、12 mg/kg處理的激活率分別為3.72、5.50、5.99%，均顯著高于對照水平。14 d時各處理均表現(xiàn)出與濃度成正比的抑制作用，且中高濃度(6、9、12 mg/kg)處理組的抑制作用達(dá)到最峰值，抑制率分別為6.33、7.45、9.12%。試驗兩周后抑制作用逐漸減弱，3 mg/kg處理組的酶活性在30 d時恢復(fù)至對照水平，在45 d時各處理組的酶活性受到第二次激活，該狀態(tài)一直持續(xù)到試驗結(jié)束。

2.1.3脲酶 如圖3所示，低濃度(1～3 mg/kg)精異丙甲草胺對土壤脲酶活性的影響表現(xiàn)為先激活、后恢復(fù)、再激活的變化趨勢，中等濃度(6 mg/kg)、高濃度(6～12 mg/kg)處理土壤脲酶活性的變化則表現(xiàn)為先抑制、后恢復(fù)或再激活。培養(yǎng)第1周時，低濃度(1～3 mg/kg)處理對脲酶活性均表現(xiàn)激活作用，2周后激活作用逐漸降低，45 d時作用消失，脲酶活性與對照持平。中等濃度(6 mg/kg)和高濃度(9～12 mg/kg)處理土壤的脲酶活性表現(xiàn)為持續(xù)抑制，在7 d時抑制作用達(dá)到最大值，中、高(6、9、12 mg/kg)濃度處理組的抑制率分別為5.98、8.62、12.02%。處理1周后抑制作用逐漸減弱，6、9和12 mg/kg精異丙甲草胺處理土壤的酶活性分別在14 、21和30 d時恢復(fù)至對照水平，并分別于30、45和60 d時略高于對照水平。

圖3 精異丙甲草胺對煙田土壤脲酶活性的影響Fig.3 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil urease

2.1.4土壤磷酸酶

圖4 精異丙甲草胺對煙田土壤磷酸酶活性的影響Fig.4 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil phosphatese

由圖4可知，除12 mg/kg處理組外，其余濃度精異丙甲草胺處理對土壤磷酸酶活性的影響均呈現(xiàn)抑制-恢復(fù)-激活的規(guī)律，12 mg/kg處理組的磷酸酶活性表現(xiàn)為先抑制、后恢復(fù)的趨勢。在試驗第1周，各處理對土壤磷酸酶活性均表現(xiàn)出與濃度成正比的抑制作用，在7 d時抑制效應(yīng)達(dá)到最大，4個處理組的酶活性分別為對照的98.31、93.22、93.78、84.19、75.14%。試驗2周后，各處理的抑制作用呈現(xiàn)減弱趨勢，其中1 mg/kg處理組的酶活性在整個試驗期內(nèi)基本與對照持平，3、6 mg/kg處理組的酶活性在14、21 d恢復(fù)至對照水平，分別于21、30 d高于對照組，9、12 mg/kg處理組的磷酸酶活性在45、60 d恢復(fù)到對照水平，9 mg/kg處理組的酶活性在60 d時高于對照組。

2.2 精異丙甲草胺對烤煙植株根際土壤酶活性的影響

2.2.1過氧化氫酶 如圖5所示，在整個試驗期內(nèi)，各處理根際土壤的過氧化氫酶活性均高于對照土壤，精異丙甲草胺處理根際土壤的過氧化氫酶活性呈現(xiàn)激活-恢復(fù)的變化趨勢。在試驗前期(1～14 d)，各處理對土壤過氧化氫酶活性均有一定的激活作用，激活作用均在1 d時最為強(qiáng)烈，根際土壤過氧化氫酶活性分別比對照土增加了31.82%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性僅增加25.57%，處理土壤的根際效應(yīng)R/S為1.14，而對照土壤的根際效應(yīng)R/S為1.05。第21 d時，激活效應(yīng)消失，表現(xiàn)為抑制作用，30 d左右精異丙甲草胺對根際與非根際土壤酶活性的抑制作用消失，過氧化氫酶受到第二次激活，且激活效應(yīng)一直繼續(xù)到試驗結(jié)束，但酶活性與對照土壤不存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 精異丙甲草胺對烤煙植株根際與非根際土壤過氧化氫酶活性的影響Fig.5 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil catalase

2.2.2脫氫酶

圖6 精異丙甲草胺對烤煙植株根際與非根際土壤脫氫酶活性的影響Fig.6 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil dehydrogenase

從圖6可以看出，在試驗的各個時期，無論是對照土樣，還是處理土樣，根際土的脫氫酶活性均比同期的非根際土壤酶活性要高。精異丙甲草胺處理后，根際土壤脫氫酶活性的變化為激活-抑制-恢復(fù)-激活。在試驗初期(1～3 d)，土壤脫氫酶活性表現(xiàn)為激活狀態(tài)，激活作用和根際效應(yīng)均在3 d時達(dá)到峰值，根際土壤脫氫酶活性為對照土壤對108.83%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性為對照土壤的103.72%，根際效應(yīng)R/S為1.08，差異均達(dá)顯著水平(p<0.05)。3 d后，處理對脫氫酶的刺激作用逐漸降低，根際與非根際土壤的酶活性均在7 d時恢復(fù)至對照水平，在14 d時被顯著抑制(p<0.05)，30 d時酶活性恢復(fù)至正常水平，45 d時脫氫酶受到第二次激活，且酶活性顯著高于對照土壤，并一直繼續(xù)至試驗結(jié)束。

2.2.3脲酶

圖7 精異丙甲草胺對烤煙植株根際與非根際土壤脲酶活性的影響Fig.7 Effect of S-metolachlor contamination on activity of rhizophere and non-rhizosphere soil urease

由圖7可知，在整個試驗期間，精異丙甲草胺對土壤脲酶活性的影響呈現(xiàn)先抑制、后恢復(fù)、再激活的變化動態(tài)。對根際土壤脲酶活性的抑制作用在7 d時達(dá)到最大值，處理根際土壤脲酶活性比對照土壤的降低了6.36%，非根際土壤酶活性比對照土壤的降低了5.98%，此時根際效應(yīng)R/S也達(dá)到峰值，為1.09，且相應(yīng)對照的根際效應(yīng)與R/S為1.08，均存在顯著差異(p<0.05)。7 d后精異丙甲草胺對土壤酶活性的抑制作用逐漸降低，21 d時恢復(fù)至對照水平，并在30 d時高于對照土壤。在整個試驗期內(nèi)，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土樣脲酶活性均要高于非根際土樣。

2.2.4磷酸酶 從圖8可以看出，培養(yǎng)期間，根際土磷酸酶活性均高于同期的非根際土。在試驗前期(1～21 d)，與非根際土壤相似，處理的根際土壤磷酸酶受到抑制，7 d時，抑制效應(yīng)達(dá)到峰值，精異丙甲草胺處理根際土壤的磷酸酶活性為對照土壤的86.29%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性為對照土壤的85.31%，而處理根際土壤酶活性分別為處理非根際土壤的112.58%，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S為1.13，而對照土壤的根際效應(yīng)R/S為1.11，存在顯著差異(p<0.05)。14 d后抑制作用逐漸減弱，在21 d時恢復(fù)至對照水平，30 d后酶活性高于對照土壤，60 d時差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。

圖8 精異丙甲草胺對烤煙植株根際與非根際土壤磷酸酶活性的影響Fig.8 Effect of S-metolachlor contamination on activity of soil catalase rhizophere and non-rhizosphere soil phosphatese

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：精異丙甲草胺對煙田土壤酶活性的影響不僅與土壤酶的種類有關(guān)，更取決于精異丙甲草胺的濃度和處理時間。培養(yǎng)前期(1～2周)，除草劑對土壤過氧化氫酶表現(xiàn)出激活作用，對磷酸酶則表現(xiàn)出抑制作用，作用程度均與濃度成正比，當(dāng)除草劑濃度高時對脲酶活性有抑制作用，濃度范圍在9～12 mg/kg時對土壤脫氫酶具有激活作用。培養(yǎng)后期(2周以后)，所測四種酶活性表現(xiàn)為恢復(fù)、抑制或激活的變化趨勢。因此，土壤過氧化氫酶和磷酸酶可以在污染早期作為表征精異丙甲草胺殘留污染的生物活性指標(biāo)。精異丙甲草胺除草劑在整個試驗周期內(nèi)，無論是處理土壤，還是對照土壤，根際土壤酶活性均高于非根際土，存在明顯的根際效應(yīng)。就土壤酶而言，在污染早期，土壤過氧化氫酶和磷酸酶對精異丙甲草胺較敏感，可以作為表征精異丙甲草胺殘留土壤污染的生物活性指標(biāo)。

其他關(guān)于精異丙甲草胺的研究已探明該除草劑對土壤微生物的動態(tài)響應(yīng)也存在明顯的根際效應(yīng)，且真菌為精異丙甲草胺脅迫下的優(yōu)勢種群。但土壤微生物對該除草劑的降解是否存在直接或間接的作用尚不明確，可采用分子手段對該根際土壤中的微生物進(jìn)行分析，探究起關(guān)鍵作用的種群，進(jìn)一步探討精異丙甲草胺在煙田土壤中的降解機(jī)理。

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