陳興銀，彭昌琴，陸贈(zèng)玉，楊 鵬，關(guān) 萍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

刺梨(RoseroxburghiiTratt)，又名送春歸、文先果，薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木[1]。原產(chǎn)于云貴高原。主要分布貴州、四川、重慶等地[2]。前人研究報(bào)道，刺梨的抗氧化、防癌、抗輻射、消炎等藥理作用具有極高的醫(yī)療價(jià)值。刺梨中含有豐富Vc、多種人體必需氨基酸、黃酮、多糖等物質(zhì)，具有進(jìn)一步加工成品的價(jià)值，尤其因果實(shí)富含Vc而備受?chē)?guó)內(nèi)外關(guān)注，同時(shí)還具有觀賞價(jià)值[3-5]。ISSR是Zietkiewicz在1994年所建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)[6]。ISSR同時(shí)具備RAPD、SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，且具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前ISSR已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性及植物系統(tǒng)演化、分類(lèi)等研究[7]。鄢秀芹等對(duì)刺梨轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析[8]。文曉鵬等利用RAPD、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同自然分布區(qū)刺梨的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明來(lái)自貴州的刺梨遺傳多樣性最為豐富[9，10]?；谫F州地區(qū)刺梨遺傳多樣性豐富進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州不同地區(qū)野生刺梨及近緣種無(wú)籽刺梨親緣關(guān)系近分析。為進(jìn)一步對(duì)刺梨親緣關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于ISSR分子標(biāo)記的14份樣品，13份都來(lái)自于貴州不同地區(qū)，及一份來(lái)自于重慶的(表1)。各樣品均采集新鮮葉片作為材料，采集后立即用硅膠干燥、保存?zhèn)溆?。其?中樣品所對(duì)應(yīng)的序號(hào)也是個(gè)樣品的代號(hào)。

表1 研究所用材料名稱、來(lái)源Tab.1 List of materials used in the study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組總DNA的提取 取新鮮葉片放于冰盒中，帶回-20℃保存?zhèn)溆?，植物DNA采用天根公司植物DNA提取試劑盒提取。DNA提取后，1%瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，DNA濃度稀釋至20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的合成與篩選 ISSR引物的合成根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(University of BritisHColumbia，UBC)公布的引物序列(http： / /www.biotech.ubc.ca /services / naps / primers.html)，由昆明碩擎有限公司合成，共50條，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的13條引物用于刺梨與無(wú)籽刺梨資源遺傳多樣性擴(kuò)增分析。

1.2.3ISSR反應(yīng)體系及程序 ISSR反應(yīng)體系為：25 μL反應(yīng)體系，1 μLDNA模板，1 μL引物，12.5 μLMix，Mix和分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000的Maker購(gòu)于昆明碩擎有限公司，其余用ddH2O補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序參照楊帆等(2011)[11]：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性15 s，58℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，57℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，54℃退火35 s，72℃延伸90 s，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94℃變性15 s，53℃退火35 s，72℃延伸90 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。取5 μL在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳1 h左右，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按條帶的有無(wú)分別統(tǒng)計(jì)條帶。有條帶記為1，無(wú)條帶記為0，把得到的0，1分布矩陣從Excel 2003中導(dǎo)入軟件NTsys 2.10e中，用SM法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)用50條引物對(duì)14份材料基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增篩選引物，ISSR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2。13條引物對(duì)14份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出162條DNA條帶，其中150條為多態(tài)性條帶。擴(kuò)增出來(lái)引物的條帶數(shù)在4～22之間，平均為12.5條，多態(tài)百分率為92.54%，有10條引物擴(kuò)增的多態(tài)性百分率為100%。其中UBC881擴(kuò)增出來(lái)的條帶最多(22條)，圖1是引物UBC881 ISSR擴(kuò)增出來(lái)的結(jié)果。

表2 ISSR引物序列及擴(kuò)增多態(tài)性百分比Tab.2 ISSR primer sequences and I percentage of amplified polymorphism

圖1 UBC881引物的電泳結(jié)果 M.DL2000 maker

2.2 樣品遺傳相似系數(shù)的ISSR分析

13對(duì)引物組合擴(kuò)增得到162條帶，用NTsys2.10e軟件計(jì)算各個(gè)樣品間的遺傳相似性系數(shù)，表3。由表3可知，來(lái)自貴州不同地區(qū)的14個(gè)野生樣品，其相互間的相似系數(shù)為0.50～0.85。相似系數(shù)最大樣品組合有兩個(gè)，分別是來(lái)自安順關(guān)嶺縣與六盤(pán)水的刺梨、貴陽(yáng)息烽與六盤(pán)水的刺梨，相似系數(shù)均為0.85。相似系數(shù)最小樣品組合為來(lái)自黔西南興仁的刺梨與貴陽(yáng)植物園無(wú)籽刺梨，相似系數(shù)為0.50。相似系數(shù)在0.8及以上的組合有8個(gè)，分別為來(lái)自貴陽(yáng)燕樓鄉(xiāng)與安順關(guān)嶺縣、畢節(jié)七星關(guān)區(qū)與貴陽(yáng)息烽的刺梨，相似系數(shù)均為0.83。來(lái)自畢節(jié)七星關(guān)區(qū)分別與安順關(guān)嶺縣、六盤(pán)水的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.82。來(lái)自安順關(guān)嶺縣分別與貴陽(yáng)花溪、貴陽(yáng)息烽的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.80。刺梨與無(wú)籽刺梨之間相似系數(shù)為0.50～0.67。來(lái)自貴陽(yáng)植物園無(wú)籽刺梨分別與六盤(pán)水、黔西南興仁的刺梨組合，相似系數(shù)分別為0.67、0.50。無(wú)籽刺梨互相間的相似系數(shù)為0.56～0.78。來(lái)自貴陽(yáng)植物園與黔西南興仁的野生無(wú)籽刺梨、來(lái)自安順光枝無(wú)籽刺梨組合相似系數(shù)分別為0.56、0.67。來(lái)自安順光枝無(wú)籽刺梨與黔西南興仁的野生無(wú)籽刺梨相似系數(shù)為0.78。刺梨間相互的相似系數(shù)為0.55～0.85。

2.3 樣品UPGMA聚類(lèi)結(jié)果分析

由圖2可看出，來(lái)自銅仁梵凈山、貴陽(yáng)燕樓鄉(xiāng)、安順關(guān)嶺縣、六盤(pán)水、畢節(jié)七星關(guān)區(qū)、貴陽(yáng)息烽的刺梨聚為一支，且來(lái)自安順關(guān)嶺縣刺梨與六盤(pán)水刺梨相距最近，親緣關(guān)系最近。來(lái)自重慶開(kāi)縣的刺梨單獨(dú)聚為一支。來(lái)自遵義桐梓、貴陽(yáng)花溪、遵義道真縣的刺梨聚為一支，來(lái)自貴陽(yáng)花溪刺梨與遵義道真縣的刺梨親緣關(guān)系較近。安順，光枝無(wú)籽刺梨與黔西南興仁野生無(wú)籽刺梨聚為一支，來(lái)自黔西南興仁的刺梨與貴陽(yáng)植物園無(wú)籽刺梨單獨(dú)聚為一支。

表3 11份野生刺梨和無(wú)籽刺梨資源的遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic similarity coefficients of R. roxburghii and R. sterilis material

圖2 11份刺梨和3份無(wú)籽刺梨植物材料的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 R. roxburghii and 3 R. sterilis

3 討 論

在親緣關(guān)系上，相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系也越近。ISSR分析結(jié)果顯示，同屬遵義市桐梓縣和道真縣的刺梨，遵義道真縣與貴陽(yáng)花溪親緣關(guān)系比與遵義桐梓的近。同屬花溪區(qū)的刺梨，貴陽(yáng)花溪燕樓鄉(xiāng)與貴陽(yáng)息烽縣的親緣關(guān)系比與貴陽(yáng)花溪大。貴州關(guān)嶺縣和貴州六盤(pán)水相似系數(shù)最大(0.85)，親緣關(guān)系最近。說(shuō)明刺梨間的親緣關(guān)系與地理分布沒(méi)有相關(guān)性。此結(jié)果與文曉鵬對(duì)30份不同地方野生刺梨多樣性分析的相一致。2009年，安明態(tài)等發(fā)現(xiàn)貴州薔薇屬的一個(gè)新變種，發(fā)布新種為光枝無(wú)籽刺梨[12]。表2中不同地方的野生刺梨的遺傳相無(wú)籽刺梨間相似系數(shù)為0.56～0.78，組合為黔西南興仁野生無(wú)籽刺梨和安順光枝無(wú)籽刺梨的相似系數(shù)最大為0.78，其數(shù)值處于刺梨相互間遺傳系數(shù)0.55～0.85間，且大于刺梨與無(wú)籽刺梨相互間的最大相似系數(shù)0.67。據(jù)此可認(rèn)為來(lái)自黔西南野生興仁無(wú)籽刺梨和安順光枝無(wú)籽刺梨是同一個(gè)種。其結(jié)果與李旦等利用AFLP分子標(biāo)記和DNA條形碼對(duì)無(wú)籽刺梨鑒定中得到興仁無(wú)籽刺梨與安順光枝無(wú)籽刺梨為同一種的結(jié)果相一致[13]。

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