郭曉冬,姜曉峰,高 卓

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科,黑龍江 哈爾濱150001)

組織是腫瘤患者檢測(cè)最直接的臨床樣本，但由于腫瘤異質(zhì)性的存在，目前的單一位點(diǎn)穿刺或活檢不能反映腫瘤的全貌，同時(shí)，有創(chuàng)檢測(cè)對(duì)于廣泛人群的早期篩查以及晚期腫瘤的惡病質(zhì)患者也并不適用。血漿游離循環(huán)腫瘤DNA (Cell-free Circulating Tumor DNA，ctDNA)由于保持著與組織樣本一致的遺傳信息，現(xiàn)將其作為組織樣本基因?qū)W檢測(cè)的替代首選。本文將針對(duì)ctDNA的三種檢測(cè)方法(包括ARMS-PCR，dPCR和NGS)及其優(yōu)缺點(diǎn)，包括其在NSCLC早期診斷，個(gè)性化治療和耐藥性監(jiān)測(cè)，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與預(yù)后等臨床應(yīng)用方面做一簡(jiǎn)要概述，同時(shí)針對(duì)目前尚未解決的一些問(wèn)題等方面提出思考意見。

肺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤之一，近2/3的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于腫瘤晚期，由于機(jī)體狀況差等原因無(wú)法或很難獲得足量合格的組織樣本用于診斷及治療。液體活檢是指從體液中獲得來(lái)源于組織的生物學(xué)標(biāo)志物，并通過(guò)對(duì)所得標(biāo)志物的分析來(lái)反映其來(lái)源組織的相關(guān)信息[1]。這一檢測(cè)方法具備無(wú)創(chuàng)性、廣泛性、即時(shí)性等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前常用的液體活檢分析對(duì)象主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)、外泌體(Exosomes)和游離腫瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)。ctDNA來(lái)源于原發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，存在形式更加穩(wěn)定且易于檢測(cè)，可直接使用血漿樣本，這種檢測(cè)在具備無(wú)創(chuàng)性和可重復(fù)性的同時(shí)，還可有效的避免腫瘤本身存在的異質(zhì)性。故本文就ctDNA在NSCLC中的應(yīng)用做一介紹。

1 ctDNA的檢測(cè)方法及優(yōu)缺點(diǎn)

游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是指一般存在于血漿、血清、腦脊液中，由細(xì)胞凋亡、壞死釋放入體液的DNA片段，大小約為150-200 bp。正常個(gè)體中的cfDNA主要來(lái)自于凋亡的骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，少部分來(lái)自于組織。目前cfDNA 已被廣泛應(yīng)用于孕婦產(chǎn)前篩查(NIPT)、移植反應(yīng)監(jiān)測(cè)和腫瘤的個(gè)體化治療等方面。ctDNA是cfDNA的一部分，特指來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的cfDNA[2]。目前針對(duì)ctDNA的檢測(cè)方法，大體分為以下幾類：突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)PCR、數(shù)字PCR、新一代測(cè)序(NGS)等。每一種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)[3]，下面將其做一具體介紹。

1.1 ARMS-PCR

ARMS是一種在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)已知點(diǎn)突變的方法，也稱為等位基因特異擴(kuò)增法。該法通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5′端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合型突變，分別加入這兩種引物及3′引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，需有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可延伸并得到擴(kuò)增引物，如果錯(cuò)配位于3′端則導(dǎo)致不能衍生擴(kuò)增，則稱為ARMS；該方法可以實(shí)現(xiàn)在同一基因中進(jìn)行兩種或多種基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)，屆時(shí)利用熒光定量PCR平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)稀有突變檢測(cè)，達(dá)到提高檢測(cè)敏感性與特異性的目的。

目前根據(jù)ARMS原理檢測(cè)ctDNA的ADX-ARMS@EGFR試劑盒已經(jīng)被國(guó)家藥監(jiān)局(CFDA)批準(zhǔn)，Cobas@ERFR也已經(jīng)被確定與用來(lái)檢測(cè)EGFR的外顯子19的缺失和L858R的置換突變，相比之下dPCR和NGS還尚未得到批準(zhǔn)；然而由于ARMS每次都只能檢測(cè)一種已知基因的突變位點(diǎn)，且有文獻(xiàn)表明不同試劑盒對(duì)ctDNA的提取結(jié)果會(huì)造成很大影響，因而在臨床上的應(yīng)用也受到了一定的影響[4]。

1.2 dPCR

dPCR技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)方法，它包括微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、乳液PCR和chip-PCR。與傳統(tǒng)PCR不同，它的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)單個(gè)突變基因進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。它的原理是將每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)分配至大量微滴中，以每個(gè)微滴作為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)熒光信號(hào)的比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后計(jì)算出樣本中的拷貝數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的絕對(duì)定量。

因?yàn)樗臋z測(cè)優(yōu)勢(shì)，使這種方法的靈敏度和特異性都明顯高于其他方法，目前有文獻(xiàn)表明，ddPCR是檢測(cè)EGFR突變最敏感的平臺(tái)[5]；但是由于引物位置、探針修飾等因素對(duì)結(jié)果可能造成影響，故檢測(cè)時(shí)應(yīng)將這些作為結(jié)果評(píng)估的因素。

1.3 NGS

高通量測(cè)序，又名下一代測(cè)序，目前的主要檢測(cè)平臺(tái)包括三類羅氏454測(cè)序儀，Illumina公司的Solexo基因組分析儀和ABI的SOliD分析儀[6]。454測(cè)序儀原理是將PCR反應(yīng)的每一個(gè)堿基的延伸和熒光信號(hào)先偶聯(lián)，通過(guò)記錄熒光信號(hào)的強(qiáng)弱和有無(wú)，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定序列的目的；Illumina與454測(cè)序儀的原理類似，同樣都是SBS(邊合成邊測(cè)序)，但其熒光基團(tuán)直接連于堿基上；而Solid分析儀連接的序列是8個(gè)堿基的探針混合物，根據(jù)序列的順序，樣品就可以被探針標(biāo)記，借此引發(fā)熒光信號(hào)的產(chǎn)生。NGS可以用于廣泛突變的檢測(cè)，目前對(duì)深度測(cè)序的開發(fā)也是開拓了其應(yīng)用平臺(tái)，如SiRe平臺(tái)，經(jīng)驗(yàn)證SiRe具有較高的分析性能和0.01%的檢測(cè)限[7]。然而反應(yīng)的效率和測(cè)序深度對(duì)檢測(cè)結(jié)果起到至關(guān)重要的作用，此外耗時(shí)長(zhǎng)，成本高也限制了其在臨床上的應(yīng)用。

除了上述的三種方法外，核酸質(zhì)譜-色譜聯(lián)用技術(shù)(MALDI-TOF-MS)也可用于ctDNA的檢測(cè)，該技術(shù)的檢測(cè)原理是將待測(cè)樣本轉(zhuǎn)換成高速運(yùn)動(dòng)的離子，根據(jù)不同離子擁有的質(zhì)核比(m/Z)，對(duì)基因進(jìn)行檢測(cè)分析。這種方法的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快，可以對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，缺點(diǎn)在于全程需要較多的手工操作，對(duì)樣本的前處理耗時(shí)可能較長(zhǎng)[8]。

2 ctDNA在NSCLC中的臨床價(jià)值

2.1 早期診斷

有臨床證據(jù)表明，ctDNA的含量與臨床分期密切相關(guān)。但目前對(duì)癌癥早期ctDNA的檢測(cè)則成為的臨床挑戰(zhàn)難題。眾所周知，ctDNA占cfDNA的比例很低，故對(duì)于其早期檢測(cè)來(lái)說(shuō)，富集程度和靈敏度的提高顯得尤其重要[9]。

近期發(fā)表在Nature Medicine[10]上一篇文章中提到了一種全新的ctDNA的檢查方法：癌癥個(gè)體化深度測(cè)序分析法，簡(jiǎn)稱CAPP-Seq。該方法集合了目前對(duì)于早期ctDNA提取方法存在的問(wèn)題后加以改進(jìn)，首先對(duì)ctDNA進(jìn)行捕獲，后進(jìn)行深度測(cè)序，即完成了富集化又增加了檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果顯示，對(duì)于Ⅱ-Ⅳ期的NSCLC檢測(cè)敏感性為100%。Ⅰ期的敏感性為50%，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于比例低至0.02%的ctDNA來(lái)說(shuō)也同樣能被檢測(cè)到，結(jié)果得到了ROC曲線的驗(yàn)證結(jié)果為0.99和0.95，由此可見CAPP-Seq檢測(cè)的能力。這一方法的建立對(duì)肺癌早期中ctDNA的檢測(cè)有重要作用，更為ctDNA用于早期腫瘤檢測(cè)開辟了新思路。

2.2 個(gè)體化治療與耐藥性監(jiān)測(cè)

對(duì)于NSCLC來(lái)說(shuō)，驅(qū)動(dòng)基因EGFR的突變是最常發(fā)生的事件，針對(duì)其的分子靶向藥物(主要包括酪氨酸激酶抑制劑TKI)更是治療所必需，有證據(jù)顯示接受靶向治療的患者的中位生存期為3.5年，高于非靶向治療的患者(中位生存期為2.4年)；但個(gè)體化治療后的耐藥也是靶向治療的必然結(jié)果。因此對(duì)于NSCLC來(lái)說(shuō)，針對(duì)性的個(gè)體化治療與及時(shí)的耐藥性監(jiān)測(cè)更是ctDNA所需要解決的重要問(wèn)題[11]。

2017年5月發(fā)表在Ontarget上的有關(guān)ctDNA檢測(cè)EGRF突變一文中指出了關(guān)于運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性(CastPCR)的方式檢測(cè)NSCLC中的驅(qū)動(dòng)突變基因的可行性[12]。此實(shí)驗(yàn)收集了107名NSCLC患者的血漿樣本和與之對(duì)應(yīng)的用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中以組織樣本的檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)以檢測(cè)CastPCR的檢測(cè)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出的EGFR T790M突變的靈敏性，特異性和一致性分別為54.6%(31/55),94.2%(49/52)和74.8%(80/107)；而PPV和NPV也高達(dá)91.2%(31/34)和67.1%(49/73)。該實(shí)驗(yàn)方法的意義對(duì)于臨床的知道指導(dǎo)意義在于，對(duì)于組織不可獲取的患者來(lái)說(shuō)，可選取這一方法進(jìn)行篩查突變情況，如發(fā)現(xiàn)突變陽(yáng)性可為臨床用藥起到一定的指導(dǎo)作用。

同時(shí)一項(xiàng)來(lái)自于Dana-Farber癌癥中心的研究結(jié)果顯示出微滴式數(shù)字PCR在檢測(cè)治療療效和耐藥情況的檢測(cè)結(jié)果[13]。該研究為前瞻性實(shí)驗(yàn)，患者采用埃羅替尼進(jìn)行治療后，觀察患者對(duì)于治療的反應(yīng)情況。對(duì)使用此類藥物的患者我們進(jìn)行了連續(xù)的監(jiān)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在疾病出現(xiàn)的前幾周或幾個(gè)月，大多數(shù)患者都已出現(xiàn)ctDNA的分子應(yīng)答和EGFR T790M的突變。后來(lái)的跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)在影像學(xué)出現(xiàn)改變的前16個(gè)月就可以由ctDNA發(fā)現(xiàn)耐藥性發(fā)生突變。

目前針對(duì)EGFR基因的突變檢測(cè)，我國(guó)也制定了《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》[14]，該指南對(duì)肺癌中EGFR基因突變和靶向治療做出了明確指示，在大樣本III期的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因的檢測(cè)對(duì)治療晚期NSCLC患者的意義，同時(shí)確定了EGFR基因的突變是TKIs個(gè)體化治療和耐藥性檢測(cè)的關(guān)鍵。

2.3 監(jiān)測(cè)術(shù)后殘留與復(fù)發(fā)

近期的一篇文章中，針對(duì)ctDNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后評(píng)估能力做了研究。該文是國(guó)內(nèi)首次對(duì)肺癌患者術(shù)后ctDNA檢測(cè)的報(bào)道，同時(shí)揭示了基于二代測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)ctDNA發(fā)揮的巨大潛能[15]。該實(shí)驗(yàn)選取了30例Ⅰ-Ⅱ期和11例Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者，分別采集了術(shù)前和術(shù)后的外周血和手術(shù)組織樣本。通過(guò)檢測(cè)深度大于10000x的Ion Torrent Proton平臺(tái)(其中包含了50個(gè)腫瘤用藥耐藥基因和腫瘤檢測(cè)相關(guān)的2865個(gè)熱點(diǎn)突變)進(jìn)行深度測(cè)序。結(jié)果顯示，27對(duì)樣本中檢測(cè)到1個(gè)或者多個(gè)突變。在驅(qū)動(dòng)基因EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA和ERBB2中檢測(cè)到tDNA和/或ctDNA突變36個(gè)。其中大多數(shù)(26/36；72.2%)突變?yōu)镾NVs，其它的突變?yōu)椴迦牖蛉笔?1/36和9/36)。在術(shù)前檢測(cè)到的24個(gè)突變中，術(shù)后有91.7%的突變位點(diǎn)的突變豐度出現(xiàn)了顯著下降。其中，Ia期和Ib期癌癥患者血漿ctDNA突變豐度在術(shù)后下降最多，而相對(duì)較晚期(IIa和IIIa期)的腫瘤患者血漿ctDNA突變豐度下降較少。這證實(shí)了ctDNA能夠?qū)崟r(shí)敏感地反應(yīng)患者的腫瘤基因突變信息和腫瘤負(fù)荷，并且可用于檢測(cè)腫瘤患者術(shù)后微小病灶殘留，評(píng)估腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

該實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)展示了ctDNA在檢測(cè)微小病灶及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)方面的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相比，ctDNA更能直接反應(yīng)出在治療檢測(cè)中的價(jià)值，對(duì)臨床治療的全程可以提供更明確的指導(dǎo)。

3 存在的問(wèn)題及解決方法

3.1 如何提高ctDNA的檢出率

ctDNA在血液中的濃度多低于100 μg/L，平均約為30 μg/L。研究表明，ctDNA的含量會(huì)隨著腫瘤的進(jìn)程而增加。癌癥早期或緩解期比例可低至游離DNA含量的0.01%-1%，在中晚期約占8%-10%[16]，但ctDNA提取中往往會(huì)混有其他背景DNA片段，會(huì)極大影響結(jié)果的判讀，因而ctDNA的檢出率在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中尤其重要。

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道，提高ctDNA的檢出率的方法大概可以總結(jié)為四類。前兩種方法有相似之處，均為通過(guò)推測(cè)ctDNA的來(lái)源進(jìn)行更進(jìn)一步的深入檢測(cè)，因?yàn)閷?duì)驅(qū)動(dòng)突變的針對(duì)性更強(qiáng)，所以檢出率會(huì)得到一定程度的提高。一種由華盛頓大學(xué)的研究人員明確，利用深度測(cè)序推測(cè)核小體模式，進(jìn)而推斷不同基因的表達(dá)情況，再將其與不同細(xì)胞和組織的RNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而推斷具體的病變部位[17]；另一種則是通過(guò)全基因組測(cè)序，推測(cè)其原發(fā)部位的表達(dá)量。通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)核小體的結(jié)合情況來(lái)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，間接推測(cè)基因表達(dá)量[18]。第三種方法則是基于有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA比cfDNA更短[19]，因而對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)篩選出較短片段的ctDNA對(duì)于檢測(cè)突變靈敏度更重要。第四種是糾正實(shí)驗(yàn)算法，可提高檢測(cè)下限。若ctDNA本身的含量低，背景DNA會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)假陽(yáng)性率的上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)?shù)任活l率低于0.02%時(shí)，假陽(yáng)性率可高達(dá)50%。針對(duì)這一問(wèn)題，斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)研究了一種iDES的算法[20]，該算法可檢測(cè)低至0.004%的突變頻率。該算法包括兩部分，一是提高ctDNA的標(biāo)記技術(shù)，二是糾正算法去除背景，將錯(cuò)配的堿基進(jìn)行剔除。經(jīng)檢測(cè)該方法的SNP錯(cuò)誤率可至最低，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)72%，對(duì)于EGFR突變的檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到92%，特異性達(dá)96%；而且針對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的ctDNA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)限可低至4/105，以上這四種方法大大提高了預(yù)測(cè)性與檢出率。

3.2 血液之外的體液樣本檢測(cè)

我們俗稱的體液大部分都是指血液樣本，但是對(duì)于肺組織來(lái)說(shuō)，痰液無(wú)疑是其最直接的體液樣本。近期由David Wong博士率領(lǐng)的研究小組完成了一項(xiàng)研究[21]，利用EFIRM(電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放和測(cè)量)新技術(shù)來(lái)檢測(cè)肺癌患者中EGFR基因的兩個(gè)致命突變即L858R和外顯子19缺失。該實(shí)驗(yàn)選取了40例NSCLC肺癌患者的痰液樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中證明用該方法檢測(cè)到了22例NSCLC患者的EGFR突變，結(jié)果表明EFIRM檢測(cè)到外顯子19缺失的ROC面積為0.94，檢測(cè)到L858R的ROC面積為0.96。對(duì)于肺癌來(lái)說(shuō)，該技術(shù)的成功為肺癌的診斷提供了一種更加無(wú)創(chuàng)，低成本收益和快速的檢測(cè)手段，同時(shí)也為肺癌的液體活檢開辟了一條新思路。

3.3 關(guān)于檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題

ctDNA的檢測(cè)相對(duì)復(fù)雜，存在多種檢測(cè)平臺(tái)，且涉及到許多方面，包括樣本的前處理、質(zhì)控、提取、上機(jī)、數(shù)據(jù)分析等工作，這些對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。由于缺乏行之有效的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和數(shù)據(jù)分析方法，使大量數(shù)據(jù)無(wú)法整合，這使ctDNA的檢測(cè)和應(yīng)用在臨床上受到了一定限制。

3.3.1質(zhì)控品，標(biāo)準(zhǔn)品的制備 目前就質(zhì)控品來(lái)說(shuō)，有研究建議將包含突變位點(diǎn)的細(xì)胞系基因組DNA和重組質(zhì)粒作為檢測(cè)的質(zhì)控品，而它的具體制備方法和檢測(cè)限度的確定，目前還尚未統(tǒng)一。

近日，來(lái)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的研究人員，建立了一種通過(guò)微球菌消化和CRISPR基因編輯技術(shù)來(lái)制備cfDNA質(zhì)控品的方法[22]。研究人員通過(guò)微球菌核酸酶消化HEK293T細(xì)胞系，并用PCR定點(diǎn)突變和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，制備出了包含多種常見突變的質(zhì)控品，并通過(guò)常用的cfDNA的常用檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果可信。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證為cfDNA質(zhì)控品的建立奠定了基礎(chǔ)，但臨床推廣還值得商榷。至少目前值得肯定的是，作為質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞系基因組DNA和重組質(zhì)粒，應(yīng)具備以下兩個(gè)基本特點(diǎn)[23]：1.質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品片段大小應(yīng)與ctDNA片段大小類似2.其應(yīng)包括廣泛的遺傳變異類型，如單核苷酸變異，染色體插入，缺失，異位等突變。這一點(diǎn)毋庸置疑。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品，英國(guó)Horizon Discovery 公司研發(fā)了商品化的ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品，它同樣來(lái)自于細(xì)胞系基因組DNA[24]。

3.3.2標(biāo)準(zhǔn)操作流程簡(jiǎn)介 標(biāo)準(zhǔn)操作流程主要包括從血液采集到血漿運(yùn)輸與儲(chǔ)存直至提取整個(gè)過(guò)程。類比檢驗(yàn)前、檢驗(yàn)中和檢驗(yàn)后三個(gè)程序來(lái)說(shuō)，檢驗(yàn)前的標(biāo)本合格與否，會(huì)直接影響最終的檢測(cè)結(jié)果。目前推薦的標(biāo)本前處理方案大致如下：采用cfDNA專用常溫采血管進(jìn)行血液采集(在采血過(guò)程中盡量避免血液回流，建議采血約10 ml后顛倒混勻)，保證血液質(zhì)量無(wú)誤后立即送檢；離心(建議1600*g，10 min)，收集血漿層，再離心后分裝。而后進(jìn)行cfDNA的提取，目前建議采用上述提到的Cobas DNA Sample Preparation Kit試劑盒進(jìn)行提取，后用TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，但目前這只是理想化的提取方法，具體操作步驟的制定，還沒(méi)有明確操作指南。

3.4 檢測(cè)平臺(tái)的合理利用

3.4.1dPCR 耐藥性的突變的確定是ctDNA能否向臨床實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。近日有研究者對(duì)常見檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行比較分析后得知：dPCR對(duì)于耐藥性檢測(cè)是最適合的檢測(cè)方法。近日，阿斯利康公司研究團(tuán)隊(duì)對(duì)血漿ctDNAd EGFR突變進(jìn)行了多個(gè)檢測(cè)平臺(tái)的比較后發(fā)現(xiàn)，COBAS EGFR突變檢測(cè)法和數(shù)字PCR中的BEAMing dPCR技術(shù)對(duì)于監(jiān)測(cè)耐藥，表現(xiàn)出高敏感度(78%-100%)和高特異性(93%-100%)。研究者們先用38例樣本進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)對(duì)于常見的T790M突變來(lái)說(shuō)，數(shù)字平臺(tái)(71%)明顯優(yōu)于非數(shù)字平臺(tái)(29-41%)。而后增加至72例后進(jìn)行血漿樣本的評(píng)估，發(fā)現(xiàn)前者的特異性和敏感性分別為73%和67%；后者為81%和58%；以上結(jié)果表明對(duì)于耐藥性的突變檢測(cè)來(lái)說(shuō)，這兩種方法與其他檢測(cè)方法相比，較為敏感和特異[25]。

3.4.2NGS 雖然dPCR在檢測(cè)耐藥性方面優(yōu)勢(shì)明顯，但由于dPCR尚未得到合理審批，相比之下，NGS在北京，上海，浙江等地的貝瑞和康創(chuàng)新技術(shù)已經(jīng)通過(guò)《國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)改局關(guān)于腫瘤診斷與治療項(xiàng)目高通量測(cè)序技術(shù)臨床應(yīng)用試點(diǎn)工作的通知》；此外對(duì)于非T790M基因突變的肺癌患者來(lái)說(shuō)，NGS檢測(cè)則顯得更加意義明確。同時(shí)臨床上對(duì)于精準(zhǔn)、全面、統(tǒng)一，價(jià)格相對(duì)低廉的多基因檢測(cè)需求更是推動(dòng)了NGS的發(fā)展。 有文獻(xiàn)指出，全基因組測(cè)序NGS不僅可以篩選突變，還可以篩選出重排和拷貝數(shù)畸變，并提供個(gè)體遺傳基因組調(diào)查結(jié)果。如上述提到的CAPP-Seq，則可以識(shí)別超過(guò)95%的腫瘤中的突變。除了確定突變特征之外，還測(cè)序可提供個(gè)性化治療，跟蹤突變載荷和抗性機(jī)制的發(fā)生。由于了解整個(gè)分子的組成才能使我們能夠選擇最佳治療方案，這樣看來(lái)，NGS似乎是臨床應(yīng)用時(shí)最適合的檢測(cè)技術(shù)[26]。

同時(shí)有學(xué)者連續(xù)對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者102名獲得的112名血漿樣品進(jìn)行前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)高達(dá)70個(gè)基因的超深度測(cè)序與組織樣本匹配。在45個(gè)基因中檢測(cè)到275個(gè)突變，102個(gè)患者中86個(gè)的ctDNA中至少有一個(gè)改變患者(84%)，其中EGFR變異最常見。 ctDNA NGS檢測(cè)到50個(gè)驅(qū)動(dòng)和12個(gè)抗性基因和22個(gè)其他基因的突變。 而連續(xù)102例患者完成ctDNA NGS，組織測(cè)序僅為50名患者成功(49%)。 在24個(gè)組織和19個(gè)ctDNA中檢測(cè)到可行的EGFR突變樣品，產(chǎn)生79%的一致性，且發(fā)現(xiàn)組織和采血之間的時(shí)間間隔更短，一致性越高。此實(shí)驗(yàn)用數(shù)據(jù)充分證明 ctDNA NGS的臨床應(yīng)用價(jià)值[27]。

3.4.3數(shù)據(jù)的處理與分析 2016年4月23日，中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)和中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟(CAGC)聯(lián)合發(fā)布了《二代測(cè)序(NGS)技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷的共識(shí)》。該共識(shí)對(duì)信息學(xué)分析提出了要求，具體如下：生物信息學(xué)流程必須針對(duì)所使用的技術(shù)平臺(tái)；任何化學(xué)成分的改變、濃縮方法或生物信息學(xué)分析平臺(tái)應(yīng)該保證后續(xù)的有效性；診斷實(shí)驗(yàn)室必須驗(yàn)證所有的生物信息學(xué)流程(公用工具或商業(yè)軟件包)的標(biāo)準(zhǔn)信息設(shè)置，以確保相關(guān)數(shù)據(jù)更改后(新版本)及時(shí)跟進(jìn)，診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用當(dāng)前注釋相關(guān)變異體的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)庫(kù)。該共識(shí)意見對(duì)生物信息學(xué)方法做出了具體要求，對(duì)ctDNA的數(shù)據(jù)分析和處理起到了更加明確的指示作用。

3.5 尚未解決的問(wèn)題與思考

3.5.1ctDNA含量與分期 分期對(duì)于腫瘤的診治尤為重要，目前我們還停留在ctDNA檢測(cè)的起跑線上。對(duì)ctDNA的定量檢測(cè)后，是否可以實(shí)現(xiàn)這兩者的相關(guān)性研究，這路途還很遙遠(yuǎn)。同時(shí)這也是實(shí)現(xiàn)ctDNA能否向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。可以設(shè)想未來(lái)如果可以通過(guò)對(duì)ctDNA的絕對(duì)定量檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的分期，甚至可以實(shí)現(xiàn)確定哪個(gè)范圍為用藥人員，哪個(gè)范圍為手術(shù)人員，這對(duì)于早日實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)醫(yī)療”是有所裨益的。

3.5.2對(duì)ctDNA檢測(cè)人員的規(guī)范化培訓(xùn) 由于ctDNA本身含量少，豐度低。因而精準(zhǔn)提取對(duì)于檢測(cè)結(jié)果來(lái)說(shuō)顯得至關(guān)重要。建議應(yīng)定向培養(yǎng)專業(yè)的檢測(cè)技術(shù)人員對(duì)標(biāo)本進(jìn)行完好的處理(其中最重要的是降噪處理)來(lái)有效避免人為因素導(dǎo)致的檢測(cè)誤差；此外還包括定價(jià)問(wèn)題。正如現(xiàn)在的檢驗(yàn)項(xiàng)目一樣，不同的檢測(cè)方法，試劑耗材會(huì)有所差異，對(duì)于不同的ctDNA檢測(cè)方法，也應(yīng)采取不一樣的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，這也更加合理。

結(jié)語(yǔ)

對(duì)于NSCLC來(lái)說(shuō)，液體活檢正發(fā)揮著巨大的潛能。針對(duì)液體活檢中的ctDNA，其各自提取和檢測(cè)方法的不足之處還有待完善；針對(duì)NSCLC的早期診斷，個(gè)體化治療及耐藥性監(jiān)測(cè)，甚至包括預(yù)后復(fù)發(fā)評(píng)估的意義也將伴隨著提取和檢測(cè)方法的改進(jìn)而更加意義明確。但是對(duì)于檢測(cè)后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方面，目前我們了解的還甚少，故建議將這一部分作為以后的研究熱點(diǎn)。同標(biāo)準(zhǔn)化一樣，盡早制定出相對(duì)完善的共識(shí)意見；此外其他液體活檢的研究還方興未艾，探討它們的聯(lián)合檢測(cè)的意義，任重而道遠(yuǎn)。

[1]沈曉燕，章 抗，楊 楊，等.液體活檢在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2017,25(01):160.

[2]瞿國(guó)英,郁愛平．外周血游離 DNA作為腫瘤標(biāo)志物的臨床展望和生物學(xué)意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016，37(9):1234.

[3]Xu Ting,Kang XZ,You XF，et al.Cross-Platform Comparison of Four Leading Technologies for Detecting EGFR Mutations in Circulating Tumor DNA from Non-Small Cell Lung Carcinoma Patient Plasma[J].Theranostics,2017,7:1437.

[4]Kwapisz D,The first liquid biopsy test approved.Is it a new era of mutation testing for non-small cell lung cancer[J]?Annals of Translational Medicine,2017,5:46.

[5]Suzawa K,Yamamoto H,Ohashi K,et al.Optimal method for quantitative detection of plasma EGFR T790M mutation using droplet digital PCR system[J].Oncology Reports,2017,37:3100.

[6]Goodwin S,McPherson JD，McCombie WR,et al.Coming of age:ten years of next-generation sequencing technologies[J].Nature,2016,17:333.

[7]Malapelle,Umberto MD,Clara R,et al.Development of a gene panel for next generation sequencing of clinically relevant mutations in cell-free DNA from cancer patients[J].British Journal of Cancer,2017,116:802.

[8]Masters GA,Krilov L,Bailey HH,et al.Clinical Cancer Advances 2015:Annual Report on Progress Against CancerFrom the American Society of Clinical Oncology[J].Journal of Clinical Oncology,2015,33:786.

[9]Perez RC,Canadas GM,Robles AI,et al.Liquid biopsy in early stage lung cance[J].Transl Lung Cancer,2016,5:517.

[10]Newman MA,Bratman SV,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J].Nature Medicine,2014,20:548.

[11]Kasahara N，Kenmotsua H,Serizawa M,et al.Plasma epidermal growth factor receptor mutation testing with a chip-based digital PCR system in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].Elsevier Lung Cancer,2017,106:138.

[12]Yang Y,Shen X,Li R,et al.The detection and significance of EGFR and BRAF in cell-free DNA of peripheral blood in NSCLC[J].Oncotarget,2017,8:49773.

[13]Oxnard GR,Paweletz CP,Kuang Y,et al.Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J].Clin Cancer,2014,20:1698.

[14]《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》制，非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)．非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015,95(46)：3721.

[15]Guo N N,Lou Feng,Ma Y.et al.Circulating tumor DNA detection in lung cancer patients before and after surgery[J].Scientific Reports,2016,6:33519.

[16]Holdhoff M,Schmidt K,Donehower R,et al.Analysis of Circulating Tumor DNA to Confirm Somatic KRAS Mutation[J].Natl Cancer Inst,2009,101:1284.

[17]Snyder MW,Kircher M,Hill AJ,et al.Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin[J].Cell,2016,164:57.

[18]Ulz P,Thallinger GG,Auer M,et al.Inferring expressed genes by whole-genome sequencing of plasma DNA[J].Nature Genetics,2016,48:1273.

[19]Underhill HR,Kitzman JO,Hellwig S,et al.Fragment Length of Circulating Tumor DNA[J].PLOS Genetics,2016,12:e1006162.

[20]Newman AM,Lovejoy AF,Klass DM,et al.Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA[J].Nature biotechnology,2016,34:547.

[21]Fang Wei,Lin Chien-Chung,Joon A,et al.Noninvasive Saliva-based EGFR Gene Mutation Detection in Patients with Lung Cancer[J].Care Med,2014,190:1117.

[22]Tsang JC,Chan KC.Quality Materials for Quality Assurance in the Analysis of Liquid Biopsy Samples[J].ClinChem,2017,63:1431.

[23]Zhang R,Peng Rong,Li Z,et al.Synthetic Circulating Cell-free DNA as Quality Control Materials for Somatic Mutation Detection in Liquid Biopsy for Cancer[J].Clin Chem,2017,63:1465.

[24]徐 婷，徐國(guó)賓,賈淑芹，等.循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)在惡性腫瘤診治中的應(yīng)用進(jìn)展與問(wèn)題思考[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2016，35(2)：81.

[25]Xu Ting,Kang XZ,You XF，et al.Cross-Platform Comparison of Four Leading Technologies for Detecting EGFR Mutations in Circulating Tumor DNA from Non-Small Cell Lung Carcinoma Patient Plasma[J].Theranostics,2017,7:1437.

[26]Gu J，Zang W,Liu B,et al.Evaluation of digital PCR for detecting low-level EGFR mutations in advanced lung adenocarcinoma patients:A cross-platform comparison study[J].Oncotarget,2017,8:67810.

[27]Thompson JC,Yee SS,Troxel AB,et al.Detection of therapeutically targetable driver and resistance mutations in lung cancer patients by next generation sequencing of cell-free circulating tumor DNA[J].Clin Cancer,2016,22:5772.