劉俊婷，侯睿達，安治國，毛靜濤，侯治富*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.北京龍邁達斯科技開發(fā)有限公司，北京101111)

CD200屬于白細胞分化抗原，是一種Ⅰ型膜糖蛋白[1]，胞膜外區(qū)有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。CD200在人類和嚙齒類動物均有表達，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細胞、活化的T細胞、B細胞、濾泡樹突細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等[1，2]。CD200的主要受體為CD200R，CD200與CD200R的相互作用可作為免疫耐受信號，影響髓細胞的活性，降低它們的遷移作用[3]。CD200R表達相對局限，主要分布于髓系來源的細胞(如樹突細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等)及淋巴細胞[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CD200高表達見于結(jié)腸癌、骨髓瘤、乳腺癌、腦瘤、黑色素瘤和正常間質(zhì)干細胞[5]。因此研究CD200在結(jié)腸癌的表達以及作用機制，可為結(jié)腸癌腫瘤免疫調(diào)節(jié)的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗篩查了43例結(jié)腸癌病例，26例癌旁正常組織。由北京龍邁達斯科技開發(fā)有限公司制作組織芯片。組織芯直徑為1.5 mm，切片厚為2 μm，組織芯數(shù)為69芯。

1.2 實驗方法[6]

(1)將組織芯片切片浸泡于二甲苯中20 min，換新鮮二甲苯重復(fù)一次，進行脫蠟處理；分別配制100%酒精、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸餾水梯度溶液，將脫臘后的組織切片置于100%乙醇浸泡5 minx2次；

(2)依次置于95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、蒸餾水中各浸泡5 min進行水化；

(3)用微波高火加熱抗原修復(fù)液檸檬酸-檸檬酸鈉至沸騰，然后放入切片，再用微波高火加熱5 min，補充蒸餾水恢復(fù)體積后再用微波高火繼續(xù)加熱5 min；

(4)將芯片取出，室溫條件下待其自然冷卻，用新鮮配置的3%H2O2(現(xiàn)用現(xiàn)配)滴片，于室溫下避光孵育10 min；

(5)用PBS洗滌5 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶；

(6)室溫條件下，用10%正常羊血清封閉10 min。

(7)加入1∶50抗CD200抗體(購于美國Abcam公司)，同時用PBS配制的10%正常羊血清作為實驗陰性對照，置于4℃，過夜；

(8)然后用PBS洗滌3次，每次5 min；嚴格按Dakocytomation Envision + TM System HRP試劑盒的說明書的操作進行染色；

(9)染色后用蘇木精復(fù)染細胞核，用中性樹膠封片；

(10)光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定

CD200的表達定位于細胞膜，陽性產(chǎn)物均為黃色或棕黃色顆粒。結(jié)果根據(jù)陽性細胞染色強度以及陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定：A：按細胞顯色深淺記分，棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無陽性反應(yīng)細胞為0分。B：按顯色細胞數(shù)記分，陽性細胞數(shù)>75%為4分，陽性細胞數(shù)≥51%-75%為3分，陽性細胞數(shù)≥26%-50%為2分，陽性細胞數(shù)≥5%-25%為1分，陽性細胞數(shù)<5%為0分[6]。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

通過芯片技術(shù)對樣本進行免疫組化檢測，其中結(jié)腸癌和癌旁正常組織的表達范圍分為五個等級，強度分為四個等級。結(jié)腸癌組織芯片的免疫組化結(jié)果如表1 和表2所示。對樣本CD200 表達的范圍和強度進行χ2檢驗，統(tǒng)計結(jié)果表明： CD200 在結(jié)腸癌組織中的表達強度與表達范圍均高于正常組織(P=0.001)。

表1 結(jié)腸癌樣本CD200表達范圍

表2 結(jié)腸癌樣本CD200表達強度

3 討論

大腸癌在西方國家居癌癥引發(fā)死亡的第三大殺手[7]，在我國也是最常見的消化道腫瘤之一，我國發(fā)病率也呈逐年增長的趨勢，因此，積極開展結(jié)腸癌的防治研究具有重大科學(xué)意義。據(jù)文獻報道，CD200的表達在某些腫瘤組織(如結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤等)中較高[9]，且在抑制腫瘤免疫方面具有重要作用，提示其是一個潛在的腫瘤干細胞表面標志。本文研究結(jié)果顯示，CD200 在結(jié)腸癌組織中高度表達，正常結(jié)腸組織中CD200的表達強度和范圍均低于結(jié)腸癌組織(P=0.001)。CD200/CD200R的相互作用可以傳遞免疫抑制信號，是體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的維持的參與者。然而，無論在實體腫瘤還是血液腫瘤中，CD200的表達均升高。有學(xué)者指出CD200 高表達可作為結(jié)腸癌患者的重要標志，CD200 分子的高表達與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。結(jié)合本次實驗結(jié)果，提示 CD200 的表達在促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及結(jié)腸癌預(yù)后的研究中具有重要意義。

有研究指出，與CD200-結(jié)腸組織細胞相比，CD200+結(jié)腸細胞較易形成腫瘤細胞，同時，體外實驗顯示 CD200+結(jié)腸癌細胞有更強的侵襲性。研究者將表達CD200的腫瘤接種在NOD/SCID小鼠中，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞對腫瘤的清除作用被其抑制，而加入CD200抗體后，該抑制作用被中和[5]。此外，CD200對調(diào)節(jié)性T細胞的誘導(dǎo)和細胞因子的產(chǎn)生方面有作用，因此通過阻斷抑制CD200分子的作用，對高表達CD200的腫瘤的治療具有潛在的價值。

Kawasaki BT[8]等研究發(fā)現(xiàn)，CD200可表達于大腸癌的干細胞中，是潛在的干細胞表面標志物和免疫抑制因子，認為大腸癌干細胞可能通過表達CD200，依賴其介導(dǎo)的免疫機制來逃避免疫監(jiān)視，表明CD200的表達是大腸腫瘤干細胞和腫瘤免疫之間重要的橋梁。同時，腫瘤干細胞也可能以分泌多種免疫抑制因子的方式來抑制機體的免疫系統(tǒng)，從而在腫瘤干細胞周圍形成一個免疫耐受的微環(huán)境，促使腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10]。通過基因芯片分析CD44+CD133+結(jié)腸癌COLO205細胞和CD200+結(jié)腸癌細胞的表達譜發(fā)現(xiàn)，很多基因在兩種細胞中的表達都增高[11]，均提示大腸癌干細胞可以通過CD200依賴的免疫機制抑制腫瘤免疫。因此阻斷CD200的作用，對于高表達CD200的腫瘤的治療具有重要意義。本實驗驗證的結(jié)腸癌組織中CD200高表達的結(jié)果表明，通過阻斷CD200分子的免疫抑制作用，對結(jié)腸癌治療具有潛在的前景。

[1]黎麗旋,肖 冰.CD200介導(dǎo)的大腸癌干細胞與腫瘤免疫的研究進展[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2012，17(06):364.

[2]Bukovsky A，Presl J，Zidovsky J，et al．Association of some eell surface antigens oflymphoid cells and cell surface differentiation antigens with early rat pregnancy[J]．Immunology，1984，52(4)：631．

[3]Zhang SS,Huang ZW,Li LX,et al．Identification of CD200+ colorectal cancer stem cells and their gene expression profile[J].Oncology reports，2016，36(4):2252.

[4]任 燕.CD200/CD200R1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用機制和意義[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院.2012.

[5]黎麗旋.CD200與CD133+Colo205大腸癌細胞共表達及成瘤實驗研究[D].南方醫(yī)科大學(xué).2013.

[6]侯睿達,安治國,劉俊婷,等.CD200和CD200R在膀胱和腎臟腫瘤表達的研究[J].中國實驗診斷學(xué)，2016，20(10):1661.

[7]唐三元,徐陽炎,曹建國,等.免疫調(diào)節(jié)介導(dǎo)特異乳酸桿菌抑制人結(jié)腸癌裸鼠異種移植瘤生長[J].美國中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2006，8(1):38.

[8]Kawasaki BT,Mistree T,Hurt EM,et al.Co-expression of the tol-eragenic glycoprotein,CD200,with markers for cancer stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2007,36(4):778.

[9]Moreaux J,Veyrune JL,Reme T,et al.CD200:a putative therapeu-tic target in cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,36(6):117.

[10]Holmannova D,Kolackova M,Kondelkova K,et al.CD200/CD200R paired potent inhibitory molecules regulating immune and inflammatory responses;Part II:CD200/CD200R potential clinical applications[J].Acta medica (Hradec Kralove),2012,55(2):59

[11]Shan-Shan ZHANG,Zai-Wei HUANG,Li-xuan LI,et al.Identification of CD200+ colorectal cancer stem cells and their gene expression profile[J].ONCOLOGY REPORTS,2016,36:2252.