張 斌

（中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，湖南 長沙410004）

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國栽培面積最大的速生用材樹種之一［1］，也是我國南方速生豐產(chǎn)用材林區(qū)的主要造林樹種，其栽培面積和蓄積量均居于我國前列，在我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮了重要作用。經(jīng)過“六五”至“十二五”的發(fā)展，杉木遺傳改良取得了重大突破，已建成3代杉木種子園，林分蓄積增長量在10%以上，為我國杉木遺傳改良奠定了良好的基礎(chǔ)［23］，但同國外針葉樹種的遺傳改良相比，仍存在較大差距，杉木遺傳質(zhì)量仍有較大的上升空間［47］。離子注入作為一種新的育種手段，跟航天育種相比具有成本低、效率高的優(yōu)點(diǎn)，近年來得到了廣泛的應(yīng)用，并在農(nóng)作物及林木育種上取得了一定的成功［811］。將離子注入杉木的研究表明，離子注入對杉木苗木生長具有明顯的促進(jìn)作用，但對于杉木種子發(fā)芽及發(fā)芽生理的研究未見報(bào)道，以杉木種子為試材，探索不同離子注入處理對種子發(fā)芽率及種子萌發(fā)過程中生理酶活性的影響，其結(jié)果為杉木良種選育及遺傳改良提供了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

杉木種子采自湖南攸縣2代杉木種子園，種子采集、調(diào)制后備用。種子優(yōu)良度92%，千粒重（350±6）g，含水率8%。

1.2 研究方法

試驗(yàn)選用同創(chuàng)LZD1000型多功能離子注入機(jī)進(jìn)行離子注入，分別采用氮、鈦?zhàn)鳛殡x子源，以未注入處理作對照。實(shí)驗(yàn)開始前，將3份各重400 g的種子分別放入不同的靶盤中，抽取真空，將真空度控制在（5.0～6.0）×10－3Pa，離子注入能 量為 30 Ke V／10 m A，注入總量為5×1016ions·cm－2，注入脈沖間隔時(shí)間為5 s。離子注入處理完成后，即進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)及種子保護(hù)酶活性的測試，實(shí)驗(yàn)4次重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)及分析方法

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑Gt／Dt（式中，Gt為t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）；

活力指數(shù)（VI）＝S×GI（式中，S為已發(fā)芽種子的鮮重）。

保護(hù)酶活性測試：SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑光還原法（NBT法），POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性測定采用紫外吸收法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法（TBA法），數(shù)據(jù)的整理及制圖采用Excel 2013進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行ANOVA單因素分析和LSD多重比較，均值計(jì)算采用Data Analysis功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮、鈦離子注入對杉木種子發(fā)芽能力的影響

種子的發(fā)芽能力通常用發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及種子活力指數(shù)表示，但又各有不同，發(fā)芽率強(qiáng)調(diào)種子的發(fā)芽潛力，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)突出種子發(fā)芽的整齊性，活力指數(shù)強(qiáng)調(diào)幼苗期的潛在活力大小。

從圖1可看出，供試種子批的常規(guī)發(fā)芽率為38.89%，發(fā)芽率最低，經(jīng)氮、鈦離子注入處理后，種子發(fā)芽率分別提高了18.85%、20.00%，同未處理種子相比發(fā)芽率提高程度均達(dá)到了顯著性水平（顯著性分別為0.011、0.008）。對比氮、鈦2種離子的處理效果來看，鈦離子注入處理后，杉木種子發(fā)芽率略有提高，提高了0.97%，未達(dá)到顯著性差異，從數(shù)據(jù)來看，氮、鈦離子注入處理均能提高杉木種子的發(fā)芽率，但兩者效果不存在明顯差異。

圖1 離子注入對杉木種子發(fā)芽率的影響

種子發(fā)芽勢反映了種子批的發(fā)芽整齊狀況，是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。由圖2可發(fā)現(xiàn)，杉木種子的常規(guī)發(fā)芽勢為22.44%，經(jīng)氮、鈦離子注入處理后，杉木種子的發(fā)芽勢提高了34.67%（顯著性水平0.001）和16.83%（顯著性水平0.036），離子注入處理能顯著提高杉木種子的發(fā)芽整齊性。對比氮、鈦離子處理后的發(fā)芽勢，氮離子注入處理顯著優(yōu)于鈦離子處理（顯著性水平0.029），發(fā)芽勢提高了15.27%。

圖2 離子注入對杉木種子發(fā)芽勢的影響

發(fā)芽指數(shù)是種子活力的一種表述方式，種子發(fā)芽越快，發(fā)芽指數(shù)越大，種子活力越高、質(zhì)量越好。常規(guī)處理?xiàng)l件下，杉木種子的發(fā)芽指數(shù)為11.85（圖3），經(jīng)氮、鈦離子注入處理后，發(fā)芽指數(shù)分別提高到15.14和14.19，分別提高了27.76%（顯著性水平0.003）和19.75%（顯著性水平0.016），離子注入處理效果顯著。不同離子注入處理間對比發(fā)現(xiàn)，氮離子注入后，杉木種子的發(fā)芽指數(shù)相比鈦離子注入提高了6.69%，差異不顯著（顯著性水平0.227）。

圖3 離子注入對杉木種子發(fā)芽指數(shù)的影響

活力指數(shù)不僅反映了種子的發(fā)芽速度，也反映了幼苗期的生長勢，活力指數(shù)越大，種子活力越好，幼苗期的長勢越好。氮、鈦離子注入處理顯著提高了杉木種子的活力指數(shù)（圖4），由對照處理時(shí)的128.40，分別提高到202.15和184.22，分別較對照處理提高了57.44%和43.47%，達(dá)到了極顯著性差異（顯著性水平分別為0.000和0.000）。不同離子注入處理間未達(dá)到顯著性差異（顯著性水平0.057），但氮離子注入處理后杉木種子活力指數(shù)較鈦離子注入處理略高出9.73%。

2.2 氮、鈦離子注入對杉木種子保護(hù)酶活性的影響

植物在受到逆境影響后，會通過提高自身的保護(hù)酶活性來達(dá)到適應(yīng)逆境環(huán)境、正常生長的要求，通過外在的手段刺激植物保護(hù)酶活性的提高，不僅有利于提高植物的抗性，同時(shí)也能促進(jìn)植物的生長。在真空環(huán)境下通過氮、鈦不同離子注入，促進(jìn)杉木種子保護(hù)酶活性的變化，進(jìn)而達(dá)到提高杉木種子生理活性的目的。

圖4 離子注入對杉木種子活力指數(shù)的影響

圖5 離子注入對杉木種子SOD活性的影響

不同離子注入對杉木種子SOD酶活性的影響不同（圖5），氮離子注入處理后，杉木種子的SOD活性由1.41 U／mg提高到1.70 U／mg，提高了20.57%，但差異不顯著（顯著性水平0.098），而鈦離子注入使SOD活性提高了55.43%，增加幅度極顯著（顯著性水平0.002）對比氮離子處理，鈦離子注入處理對杉木種子的SOD活性影響較大，處理后SOD活性也高出29.22%，優(yōu)勢顯著（顯著性水平0.015）。

圖6 離子注入對杉木種子POD活性的影響

離子注入對杉木種子POD活性的影響表現(xiàn)出同SOD活性類似的規(guī)律，在提高酶活性方面，離子注入的效果優(yōu)于對照處理，鈦離子的效果優(yōu)于氮離子。離子注入對于杉木種子POD活性的提高有顯著的促進(jìn)作用，與對照相比，氮、鈦離子注入后杉木種子的POD活性分別提高了20.63%（顯著性水平0.001）和35.46%（顯著性水平0.000），鈦離子注入的效果相比氮離子處理的顯著提高了12.29%（顯著性水平0.003）。

逆境條件下產(chǎn)生的過氧化氫會對植物體產(chǎn)生傷害，過氧化氫酶活性的增加，有利于清除植物體內(nèi)過多的過氧化氫。從圖7可看出，氮離子注入的效果優(yōu)于鈦離子處理，CAT活性分別由對照時(shí)的1.16 U／（g·min）提高到1.69 U／（g·min）和1.56 U／（g·min），漲幅為45.56%（顯著性水平0.000）和33.82%（顯著性水平0.000），氮、鈦離子處理間也達(dá)到了顯著性的差異（顯著性水平0.019）。

圖7 離子注入對杉木種子CAT活性的影響

2.3 氮、鈦離子注入對杉木種子質(zhì)膜透性的影響

一般植物在逆境條件下就會產(chǎn)生質(zhì)膜過氧化，而氧化產(chǎn)物為丙二醛（MDA），MDA的存在會對細(xì)胞具有毒性。MDA含量的多少往往反映了逆境對植物的傷害程度，MDA含量越高，受傷害程度越大。由圖8可看出，離子注入處理對杉木種子的傷害程度較大，MDA含量分別比對照增加了47.83%和72.69%，均達(dá)到了極顯著差異（顯著性水平均為0.000），鈦離子對種子的損傷也比氮離子大，MDA含量增加了16.82%，差異顯著（顯著性水平0.005）。

圖8 離子注入對杉木種子MDA含量的影響

3 討論與結(jié)論

離子注入處理作為一種較新穎的育種手段，國內(nèi)眾多學(xué)者最早將其作為航天育種的革新技術(shù)應(yīng)用到農(nóng)作物的育種和培育工作中，近年來，不斷有學(xué)者嘗試研究離子注入技術(shù)對木本植物的影響［1213］，筆者根據(jù)多年來在離子注入領(lǐng)域的嘗試和探索，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出了對于安全含水量較低的木本植物種子具有廣泛適應(yīng)性的離子注入劑量和能量指標(biāo)，本研究的開展即基于該離子注入能量和劑量指標(biāo)。

杉木作為南方重要的速豐樹種，其種子發(fā)芽率低，不利于工廠化育苗工作的開展，同時(shí)相比外來的桉樹、濕地松等樹種，其成材時(shí)間長。開展種子發(fā)芽及生理研究是杉木良種選育的第一步，離子注入杉木種子后，其發(fā)芽率顯著提高，發(fā)芽的整齊性也增強(qiáng)，種子活力指數(shù)增加，說明離子注入處理對杉木種子具有明顯的促進(jìn)發(fā)芽效果，其結(jié)果與傘樹［14］上表現(xiàn)一致，特別是氮離子的注入，由于在輻射過程中，部分氮離子會殘留在種子內(nèi)部，成為合成種子活性物質(zhì)的組成成分，促進(jìn)了種子內(nèi)部生理物質(zhì)的合成反應(yīng)，也對種子體內(nèi)包括赤霉素在內(nèi)的生長素的合成產(chǎn)生了促進(jìn)作用［15］，或打亂并嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中［16］，從而促進(jìn)杉木種子生理活性的提高；而鈦離子作為重金屬元素，在相同的能量條件下，轟擊杉木種子的動能更大，所引起的生理活性物質(zhì)合成和DNA片段更加多樣［17］，既可引起促進(jìn)植物生長的正變化，也會產(chǎn)生抑制生長發(fā)育的負(fù)變化。從處理后的杉木種子發(fā)芽情況分析，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的能量和劑量條件下，氮離子注入處理對提高杉木種子發(fā)芽率、發(fā)芽整齊性及苗木潛在活力具有最佳的影響，而且氮元素容易獲得，對于杉木而言，采用氮離子注入的方式具有最好的發(fā)芽效果，但同時(shí)鈦離子注入也能產(chǎn)生顯著的影響，但效果略低于氮離子。

離子注入處理也是一種逆境脅迫，在真空條件下，高能離子束的不斷轟擊，除產(chǎn)生高溫作用外，還能穿透種皮及細(xì)胞，高溫及穿透作用，刺激杉木種子產(chǎn)生大量的超氧自由基及過氧化物等，誘使杉木種子啟動自由基清除功能［18］。從SOD、POD活性變化規(guī)律來看，鈦離子注入能產(chǎn)生更多的過氧化物和超氧化物，對杉木種子的結(jié)構(gòu)損傷較大，因此也產(chǎn)生較多的MDA；氮離子注入對杉木種子的損失相對較小，但會刺激杉木種子產(chǎn)生更多的CAT。雖然氮、鈦離子對杉木種子的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了損傷，但在現(xiàn)有的能量和劑量條件下，并未產(chǎn)生負(fù)面的影響，在并未損害種子自我修復(fù)能力的同時(shí)，提高了種子的修復(fù)能力，而作為種子生命力最直觀的體現(xiàn)，氮離子對杉木種子的發(fā)芽及種子活力產(chǎn)生的促進(jìn)作用更明顯，因此，從開展杉木實(shí)生苗培育及良種選育的角度來分析，氮離子注入更加適合，但哪種離子注入方式對杉木育種及培育效果更明顯，還有待長期的觀測。

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