朱劍+蔣雪梅+鐘軍+段翼遠(yuǎn)+鄧林紅

摘 要：為制備p（nBA-DEAEMA）乳液及表面具有纖毛樣結(jié)構(gòu)的共聚物膜材料，采用半連續(xù)乳液聚合法合成p（nBA/DEAEMA）乳液，再用Velcro成型工藝將純化干燥的產(chǎn)物制備成纖毛樣膜.采用傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectrometer，F(xiàn)T-IR）、核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，1HNMR）、凝膠色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）、粒徑分析、掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、靜態(tài)接觸角測(cè)定、示差掃描量熱分析（Differential Scanning Calorimetry，DSC）及力學(xué)分析對(duì)材料進(jìn)行詳細(xì)表征.最后用浸提液實(shí)驗(yàn)對(duì)材料的生物安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià).結(jié)果顯示：FT-IR和1HNMR表明目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確.共聚物乳液的多分散系數(shù)（polydispersity，PDI）為0.385，平均粒徑（Z-average）為46.48 nm.DSC結(jié)果顯示共聚物的玻璃化溫度（glass transition temperature，Tg）和粘流溫度（viscous flow temperature，Tf）分別為33.2 ℃和47.7 ℃.纖毛樣膜對(duì)水的接觸角為102.3°，表面自由能13.81 J·m2.SEM結(jié)果顯示共聚物粒子大小為40～50 nm，纖毛樣層高度為5～10 μm.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示材料對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞（bronchial epithelial cells，BECs）具有可接受的生物安全性.

關(guān)鍵詞：p（nBA-DEAEMA）；乳液；納米粒子；膜材料；生物安全性

中圖分類(lèi)號(hào)：TB 332 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preparation of p（nBA/DEAEMA） Copolymer Brushes and ItsFeasibility Study as Surface Modification for Inner Face ofArtificial Trachea

ZHU Jian1，JIANG Xuemei1，ZHONG Jun1，DUAN Yiyuan1，DENG Linhong1，2

（1. Bioengineering College，Chongqing University，Chongqing 400030，China；

2.Institute of Biomedical Engineering and Health Sciences，Changzhou University，Changzhou 213164，China）

Abstract：p（nBA/DEAEMA） nanoparticles of emulsion and polymeric cilia-like membranes were prepared. Two monomers of n-butyl acrylate （nBA） and 2-（diethylaminoethyl methacrylate） （DEAEMA） were polymerized by semi continuous emulsion polymerization method，and the cilia-like membranes were prepared by attaching a Velcro-like surface to partially coalesced films. Subsequently，the prepared materials were characterized by FT-IR，1HNMR，GPC，SEM，DSC combined with particle size analysis，static contact angle measurements and mechanical analysis. Finally，BECs from SD rats were used to characterize the biosecurity of the material. Correct structure of copolymer was also confirmed by FT-IR and 1HNMR. The particle size analysis of the copolymer emulsion was PDI 0.385 and Z-average was 46.48 nm，while Tg and Tf for copolymer was 33.2℃ and 47.7℃，respectively. The contact angle of polymeric films was 102.3° with water，and the surface free energy was 13.81 J·m2. Meanwhile，SEM photos showed the size of particles was 40 to 50 nm，and the height of cilia-like layer was about 5 to 10 μm. The biosecurity of this material was eventually verified by cell experiments. The copolymer cilia-like membranes can be used as a surface modification material for artificial trachea.

Key words：p（nBA-DEAEMA）； copolymer emulsion； nanoparticles； cilia-like membrane；biosecurityendprint

纖毛是存在于很多生物體器官如氣管等表面的一種毛發(fā)狀結(jié)構(gòu)，可分為原纖毛和運(yùn)動(dòng)纖毛，它們承擔(dān)著大量的生理功能，如保護(hù)器官感知周?chē)渌锓N、應(yīng)對(duì)周邊環(huán)境的物理化學(xué)變化等.氣管內(nèi)的纖毛更是在清除氣道灰塵、細(xì)菌等廢物上起著重要的作用[1].目前針對(duì)氣管缺損的重建氣管依然不具有功能活性的很大原因是由于其內(nèi)表面上沒(méi)有類(lèi)似纖毛狀的結(jié)構(gòu)[2-3].為了解決這一問(wèn)題，研究者們?cè)跉夤苌掀そM織重建的研究中越來(lái)越關(guān)注纖毛層的存在及其功能化.個(gè)別研究報(bào)道在直接培養(yǎng)的組織細(xì)胞表面可以形成自然生長(zhǎng)的纖毛，但這類(lèi)型纖毛尚不具備輸運(yùn)物質(zhì)如氣道廢物的能力[4].另一方面，過(guò)去幾十年里刺激響應(yīng)型聚合物材料與生物系統(tǒng)的相似性及其在仿生生物系統(tǒng)中的應(yīng)用已被越來(lái)越多地證實(shí)[5].得益于微觀(guān)生物力學(xué)的發(fā)展，自然界中運(yùn)動(dòng)型纖毛諸多優(yōu)異的性質(zhì)陸續(xù)被展示在人們面前，特別是其對(duì)于微流體的控制處理能力，使得研究工作者們開(kāi)發(fā)出了很多類(lèi)型的仿生纖毛[6-10].鑒于上述研究，若能將高分子材料和人工纖毛的研究結(jié)合起來(lái)，對(duì)某種聚合物材料進(jìn)行合理的分子設(shè)計(jì)和成型工藝研究，開(kāi)發(fā)出一種與自然生物纖毛系統(tǒng)高度相似并具有優(yōu)良理化及力學(xué)性質(zhì)的聚合物材料，這種復(fù)合型材料或許有助于解決重建氣管移植物功能性的問(wèn)題.

為此，本文選取丙烯酸正丁酯（nBA）和甲基丙烯酸二乙胺基乙酯（DEAEMA）兩種單體采用半連續(xù)乳液聚合的方法共聚合成了納米粒子乳液，并通過(guò)適當(dāng)?shù)某尚图庸すに噷⑵渲苽涑杀砻婢哂欣w毛刷樣結(jié)構(gòu)的膜材料.為檢驗(yàn)所得的膜材料是否真正制備成功，其性能是否滿(mǎn)足作為生物材料的基本要求，我們分別采用FT-IR、1HNMR、GPC、粒徑分析、SEM、靜態(tài)接觸角測(cè)定、熱分析及力學(xué)分析手段對(duì)材料的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)表征，最后還對(duì)材料的生物安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，這些檢測(cè)和表征結(jié)果為材料的后續(xù)應(yīng)用提供了科學(xué)的基礎(chǔ)參數(shù).

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

nBA、DEAEMA、十六烷基三甲基氯化銨（25%）（CTAC）、標(biāo)準(zhǔn)NaOH和HCl均為分析純?cè)噭?，?gòu)于Aldrich公司.偶氮二異丁腈（>98%+）（AIBN，分析純）和氘代二甲基亞砜（試劑純）分別購(gòu)于Adamas公司和Sigma公司.其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)于Sigma公司.

SD大鼠氣道上皮細(xì)胞的分離、純化與鑒定參照本研究室前期相關(guān)研究[11].

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

蠕動(dòng)泵（Masterflex，美國(guó)Masterflex），F(xiàn)T-IR（MAGNA IR 560，美國(guó)Nicolet）， 1HNMR（Ultra Shield400，瑞士布魯克光譜儀器公司），DSC分析儀（DSC200PC，德國(guó)耐池），凝膠滲透色譜儀（7890A/5975C，Agilent），SEM（JSM-5900LV，日本電子株式會(huì)社），納米激光粒度儀（Nano-ZS，英國(guó)Malvern），視頻接觸角測(cè)量?jī)x（OCAHZOO，德國(guó)Dataphysics），冷凍干燥機(jī)（SC21CL，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），電子拉力機(jī)（AI-7000S，高鐵科技股份有限公司），流式細(xì)胞儀（BD（Verse），美國(guó)），光學(xué)磁微粒扭轉(zhuǎn)細(xì)胞測(cè)量系統(tǒng)（EDL Eberhard，美國(guó)）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 共聚物的合成[12]

制備單體預(yù)乳化液：室溫條件下，向一干凈三頸瓶中預(yù)先加入25 mL蒸餾水，通入氮?dú)猓?.2 MPa），稱(chēng)取一定量的CTAC，DEAEMA和nBA，按照該順序先后將上述3種物質(zhì)分別緩慢滴加到三頸瓶里，邊攪拌邊滴加，控制攪拌時(shí)間以保證預(yù)乳化完全.

共聚反應(yīng)：室溫條件下向單體預(yù)乳化液中加入一定量的AIBN，繼續(xù)攪拌1 h.73 ℃條件下，向另一干凈四頸瓶中加入27 mL蒸餾水，通入氮?dú)猓?.2 MPa），安裝固定好冷凝管和攪拌裝置.將制備好的預(yù)乳化液轉(zhuǎn)移到燒杯中，用蠕動(dòng)泵將其緩慢泵入四頸瓶中，控制泵入速率.滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h，調(diào)節(jié)pH值，冷卻出料.

1.3.2 纖毛樣膜材料的制備

纖毛樣聚合物膜材料的制備參照尼龍維克牢的成型工藝執(zhí)行[13]，將共聚所得的膠體懸液直接流平到干燥的聚四氟乙烯基底上，室溫條件下控制環(huán)境相對(duì)濕度為45%，按照80 μm×10 mm×3 mm的規(guī)格成型，成型過(guò)程中控制溫度、蒸汽壓及光線(xiàn)照射.樣品制備好后，待測(cè).

1.3.3 共聚物納米粒子及膜材料的理化性質(zhì)表征

分別用FT-IR，1HNMR，GPC，SEM，DSC，激光粒徑分析儀、接觸角分析儀及材料拉伸試驗(yàn)儀等對(duì)共聚物納米粒子和膜材料進(jìn)行了合適的分析表征.

1.3.4 共聚物材料對(duì)BECs生物學(xué)行為的影響研究

由于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該共聚物具有降解惰性且細(xì)胞不能直接粘附在纖毛樣膜材料表面，所以采用浸提液試驗(yàn)對(duì)材料的體外細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，浸提液（polymer materials culture extract，PMCE）的制備參照GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5：1999執(zhí)行.而后考察了BECs經(jīng)不同時(shí)間梯度的PMCE作用后的細(xì)胞活性、群體遷移能力、粘附能力、內(nèi)源性凋亡及細(xì)胞剛度的變化表征.

2 結(jié)果和分析

2.1 FT-IR分析

圖1是單體及合成的均聚物和共聚物的紅外光譜圖.圖譜中的特征峰歸屬分析如下：1 350～1 500 cm-1區(qū)域內(nèi)均為CH2/CH3中C-H的變形伸縮振動(dòng)峰；1 567.61 cm-1處為C-N的伸縮振動(dòng)峰；1 694.00 cm-1和1 671.88 cm-1處均為C=C的伸縮振動(dòng)峰；1 732.43 cm-1和1 729.00 cm-1處為酯基的伸縮振動(dòng)峰；2 850.84 cm-1處為CH2的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；2 875.13 cm-1處為CH3的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；2 919.20 cm-1為CH2的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；2 960.02 cm-1處為CH3的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰.共聚物的紅外圖譜中，2 850～3 000 cm-1和1 350～1 500 cm-1區(qū)域的峰值來(lái)自C-H的伸縮振動(dòng)和甲基-CH3、次甲基-CH2的變形振動(dòng)重疊而成的多重吸收峰，1 732 cm-1處的吸收峰代表了羰基酯的特征吸收峰.正如所預(yù)期，1 568 cm-1處的特征吸收峰及1 670～1 690 cm-1處C=C伸縮振動(dòng)吸收峰的消失則證實(shí)了共聚的發(fā)生.由此認(rèn)為聚合物材料的制備合成是成功的.endprint

2.2 1HNMR分析

圖2為本文中制備的共聚物的1HNMR圖譜.此圖譜中的特征峰歸屬分析如下：室溫條件下，帶有肩峰的0.85 ppm處的特征峰屬于-CH2-CH3官能團(tuán)，3.9～4.1 ppm處的特征峰屬于-O-CH2官能團(tuán)，這兩處特征峰是共聚物中來(lái)自nBA的單元產(chǎn)生的.1.0 ppm處的來(lái)自于-N-（CH2CH3）2的特征峰、1.2 ppm處的來(lái)自于 -C-CH3官能團(tuán)的特征峰、 3.0 ppm處的來(lái)自于-CH2-N的特征峰以及 3.9～4.1 ppm處來(lái)自于-O-CH2的特征峰則都是由共聚物中來(lái)自DEAEMA的單元產(chǎn)生的.2.5 ppm處的特征峰是溶解DMSO的峰，3.4 ppm處的特征饅頭峰是溶劑DMSO中的水產(chǎn)生的峰.這些數(shù)據(jù)不但更加證實(shí)了共聚反應(yīng)的發(fā)生，而且結(jié)合兩種單體的競(jìng)聚率我們可以計(jì)算出，得到的共聚物是共聚率約為74%的DEAEMA無(wú)規(guī)共聚p（nBA/DEAEMA）.同時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件下單體投料比nBA/DEAEMA = 0.020/0.016，說(shuō)明共聚過(guò)程中，nBA和 DEAEMA兩種單體發(fā)生的是進(jìn)料比約為2∶3的共聚反應(yīng).

2.3 共聚物分子量的測(cè)定

共聚物的分子量分布會(huì)直接影響其強(qiáng)度、粘度等性能，因此我們對(duì)制備得到的共聚物進(jìn)行了分子量分布的測(cè)定.圖3顯示出文中制備共聚物的重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw為1 803 289 Daltons，軟件計(jì)算的各項(xiàng)參數(shù)值見(jiàn)表1.其相對(duì)分子質(zhì)量分布為1.809 559，這種較寬的相對(duì)分子質(zhì)量分布使得我們?cè)诤铣傻墓簿畚锓肿恿亢艽蟮那疤嵯?，后期制備共聚物刷纖毛樣膜的成型工藝中能夠同時(shí)兼顧到其力學(xué)性能和加工性能，這也說(shuō)明得到共聚物在相對(duì)分子質(zhì)量分布上是令人滿(mǎn)意的.

2.4 共聚物懸浮液的粒徑分析

聚合物懸浮液的粒徑及其分布作為其重要性能指標(biāo)之一，對(duì)聚合物最終的使用特別是成膜性能影響重大.研究表明[14]，粒子直徑越小、粒徑分布越寬，生成的聚合物膜致密度越高.本文中得到的共聚物懸浮液外觀(guān)如圖4（a）所示，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，根據(jù)以水為載體的聚合物懸浮液粒徑大小與液體顏色之間的定性關(guān)系[15]，我們推測(cè)本文中聚合物懸浮液的粒子粒徑大小在100 nm以下.

由于所選單體DEAEMA的特殊性，其分子側(cè)鏈末端還帶有叔氨基，因此理論上能夠表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境pH值變化的敏感，而其與H+結(jié)合的程度也會(huì)影響乳液粒子的粒徑大小，所以我們對(duì)共聚物乳液粒子粒徑對(duì)pH值變化的反應(yīng)性質(zhì)做了初步研究（圖4（b））.結(jié)果顯示共聚物乳液粒子的粒徑對(duì)環(huán)境pH值的改變呈現(xiàn)出隨pH值升高粒徑先增大后減小的現(xiàn)象，在pH=3時(shí)粒徑最大，pH=12時(shí)粒徑最小，兩者相差了26.4%，而 pH=6～10之間的乳液粒子粒徑則相差不大.這可能是因?yàn)楹铣傻墓簿畚镆驗(yàn)榭臻g構(gòu)型的影響，能結(jié)合的H+的數(shù)量存在一定范圍，在過(guò)酸（H+過(guò)多）或過(guò)堿（H+過(guò)少）環(huán)境中都不能充分地與H+結(jié)合，因此在pH=3時(shí)結(jié)合最多的H+，整個(gè)分子的側(cè)鏈因?yàn)槭艿阶顝?qiáng)的靜電排斥作用而呈現(xiàn)出最佳的伸展?fàn)顟B(tài)，達(dá)到粒子粒徑的最大.

圖4（c）為采用激光粒度儀在pH=7的條件下定量測(cè)定兩種均聚物及共聚物的粒徑分布情況的結(jié)果，縱坐標(biāo)為測(cè)定結(jié)果中的光強(qiáng)度值.從圖中可以看到，不管是均聚物乳液還是共聚物乳液，粒徑分布的均一性都較好，p（nBA），p（DEAEMA）及p（nBA/DEAEMA）三者的PDI分別為0.451，0.207和0.385，其Z-Average分別為44.24 nm，1 797 nm和46.48 nm.可見(jiàn)，共聚物乳液粒子的粒徑與p（nBA）均聚物乳液粒子的粒徑較為相近，但p（DEAEMA）均聚物乳液粒子的粒徑則比前兩者大出接近36倍，排除相同合成工藝因素的影響，這可能是由于DEAEMA這種單體的相對(duì)分子質(zhì)量比nBA的相對(duì)分子質(zhì)量大得多，相同質(zhì)量的單體合成的均聚物的相對(duì)分子質(zhì)量就更大，而粒徑大小Rh與相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系為：Rh=kM^a，即相對(duì)分子質(zhì)量越大，粒徑就越大，因此造成均聚物p（DEAEMA）的粒徑比其他兩種聚合物的粒徑大得多.

就聚合物本身來(lái)看，粒子粒徑小而比表面積增大，在成膜后不僅能使膜更致密而且還能增大粘液與其接觸的面積，在受到力學(xué)刺激時(shí)就能消耗更多的能量，產(chǎn)生更多有效的力學(xué)行為.

2.5 SEM和膜材料的接觸角分析

圖5（a）和5（b）是共聚物乳液粒子及膜材料表面的掃描電鏡圖.從圖中可以看出，共聚物乳液粒子的直徑在40～50 nm左右，這與前面粒徑測(cè)試的結(jié)果一致.膜材料表面上形成的的纖毛樣結(jié)構(gòu)高度約為5～10 μm，這與3～7 μm的人體氣道纖毛相比，尺寸大小相似.因此，將該膜材料作為人工氣管內(nèi)表面修飾材料代替實(shí)現(xiàn)氣道纖毛的模擬存在拓?fù)鋵W(xué)上的可能.圖5（c）和5（d）表示了水和乙二醇兩種測(cè)試液在纖毛樣膜材料表面的接觸角測(cè)定結(jié)果.通過(guò)計(jì)算可以得到，材料的表面自由能為13.81 J·m2.這種較為疏水的特性能形成一定的水屏障效應(yīng)，有利于蛋白質(zhì)吸附，且在生理環(huán)境中大部分蛋白都帶有負(fù)電荷，而本文中制備的材料表面帶有一定數(shù)量的正電荷，因此還會(huì)發(fā)生靜電吸引作用而建立起離子鍵，這種吸附作用能幫助材料獲得更好的生物相容性.

2.6 DSC分析

本文合成的共聚物最終有望作為一種生物材料應(yīng)用于生物體內(nèi)，因此為了排除其可能在室溫（25 ℃）和體溫（37 ℃）兩種溫度環(huán)境下發(fā)生明顯的性質(zhì)改變，對(duì)其進(jìn)行熱分析是很有必要的.圖6是合成的共聚物的DSC曲線(xiàn)，可以看出，共聚物的熱分解溫度為47.7 ℃，遠(yuǎn)高于生理溫度，因此可以預(yù)見(jiàn)若將該材料在生理溫度（37 ℃）下使用，材料是能夠保持其熱穩(wěn)定性的.

2.7 纖毛樣共聚物膜材料的力學(xué)性能分析

作為人工氣管內(nèi)壁的涂覆修飾材料，與氣管替代物一起被放置在受體體內(nèi)，經(jīng)常會(huì)受到交變壓力、彎曲、扭曲等各種外力的作用，若材料力學(xué)性能不佳，會(huì)在植入后發(fā)生一些不可逆轉(zhuǎn)的損壞，給患者造成很大痛苦甚至威脅生命.因此，本文也對(duì)膜材料的力學(xué)性能進(jìn)行了初步表征.表2是所得的力學(xué)性能參數(shù).從表2可以看出，制備所得的膜材料抗張強(qiáng)度達(dá)到1.41MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為134.73%.endprint

2.8 BECs經(jīng)PMCE作用后的生物學(xué)行為表征

各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如圖7所示.從圖中可以看出，MTT測(cè)試和LDH測(cè)試的結(jié)果一致，得到的聚合物材料的毒性為1級(jí)，作為生物醫(yī)用材料應(yīng)用，其毒性在可接受范圍內(nèi).受試細(xì)胞受不同時(shí)間梯度PMCE作用后，對(duì)其群體遷移和側(cè)向遷移能力有一定程度的抑制，但隨著浸提時(shí)間的增加，細(xì)胞受浸提液作用后的遷移能力又會(huì)出現(xiàn)一定程度的回升，這說(shuō)明PMCE對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制是有時(shí)間范疇的.測(cè)試細(xì)胞在不同時(shí)間梯度PMCE 作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞的粘附能力表現(xiàn)出顯著性差異，這表明文中制得的PMCE對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的粘附存在著不可忽略的影響，且最終細(xì)胞的粘附率穩(wěn)定維持在74%左右的水平，與對(duì)照組細(xì)胞相比，粘附能力下降了18.1%.這表明細(xì)胞的該項(xiàng)能力與其群體遷移能力變化的情況類(lèi)似，細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)時(shí)間梯度的PMCE能表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，即后期細(xì)胞粘附能力基本不再發(fā)生顯著性的變化，具有一定的時(shí)間范疇.經(jīng)48 h脫血清饑餓處理以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡以后，空白對(duì)照組與所有實(shí)驗(yàn)組之間晚期凋亡的細(xì)胞比例存在顯著性差異，且所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率均低于對(duì)照組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組之間凋亡率的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)隨PMCE時(shí)間增加而先降低后又緩慢回升的現(xiàn)象，受15 dPMCE作用的細(xì)胞組凋亡率最低，達(dá)到2%左右，而后受30 dPMCE作用的細(xì)胞組凋亡率又回升到7.5%左右，這表明本文中合成的聚合物材料的降解產(chǎn)物會(huì)顯著抑制SD大鼠氣道上皮細(xì)胞的凋亡.測(cè)試細(xì)胞在不同時(shí)間梯度PMCE 作用下其剛度都呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，受30 dPMCE作用的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞剛度比對(duì)照組細(xì)胞降低了31.4%.就實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞而言，受20 dPMCE作用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組剛度達(dá)到最高，達(dá)到0.8 Pa/nm，與對(duì)照組有顯著性差異，這表明本文中合成的共聚物降解產(chǎn)物對(duì)SD大鼠氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞剛度有顯著性影響，經(jīng)其PMCE作用后的細(xì)胞剛度明顯減小.

生物材料與細(xì)胞的相互作用中，細(xì)胞粘附是基礎(chǔ)，這種粘附性質(zhì)的差異會(huì)影響細(xì)胞的增殖、遷移、鋪展生長(zhǎng)等其他細(xì)胞行為.細(xì)胞在聚合物材料表面的粘附過(guò)程大致為[16]：首先聚合物通過(guò)吸水膨脹作用或表面潤(rùn)濕作用與細(xì)胞粘膜緊密接觸，接著聚合物鏈滲入細(xì)胞間連接的縫隙，最后他們之間形成一些弱的化學(xué)鍵而產(chǎn)生粘附.結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，雖然本文合成的聚合物材料相對(duì)分子質(zhì)量大、膜材料表面張力增大等性質(zhì)都有利于細(xì)胞在其上的粘附，但細(xì)胞最終不能直接在纖毛樣聚合物膜材料表面粘附，我們對(duì)材料細(xì)胞毒性的評(píng)級(jí)結(jié)果排除了引起這種不粘附現(xiàn)象的材料毒性的關(guān)系，而猜測(cè)是材料疏水的纖毛樣拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表面直接阻斷了細(xì)胞向材料靠近的可能.在實(shí)際應(yīng)用中，這種對(duì)細(xì)胞靠近粘附阻斷的能力使得其作為人工氣管內(nèi)表面修飾材料時(shí)能夠阻止鄰近組織向重建氣管內(nèi)壁爬行，防止氣道再狹窄的發(fā)生.

對(duì)于細(xì)胞受材料浸提液中降解產(chǎn)物影響后相關(guān)細(xì)胞行為變化的研究結(jié)果，我們認(rèn)為其相似的粘附行為和遷移行為的變化結(jié)果，是由于疏水性的丙烯酸酯類(lèi)聚合物主要是以緊密粘附的方式吸附周?chē)奈镔|(zhì)[17]，而其降解下來(lái)的小分子產(chǎn)物可能在細(xì)胞膜內(nèi)外進(jìn)出，當(dāng)細(xì)胞剛與這些小分子接觸時(shí)，由于胞外電荷環(huán)境等的驟然變化刺激等使得細(xì)胞在粘附和遷移行為方面都必須做出應(yīng)答，這種應(yīng)答行為中一個(gè)重要的方面就是通過(guò)結(jié)構(gòu)性的粘附來(lái)維持細(xì)胞的增殖遷移功能[18]，且這種應(yīng)答的過(guò)程是需要一定時(shí)間的，因此我們推測(cè)，在這段時(shí)間過(guò)程中，受刺激的細(xì)胞粘附和遷移兩方面的行為與正常環(huán)境中的細(xì)胞相比就會(huì)表現(xiàn)出一定的下降，待到應(yīng)答行為完成，其粘附和遷移行為便不再發(fā)生變化甚至不同程度的回升，因此我們得到實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的這兩種行為對(duì)于材料降解產(chǎn)物的刺激具有一定的時(shí)間范疇.而PMCE對(duì)BECs的凋亡表現(xiàn)出的顯著抑制作用，這對(duì)氣道具有組織保護(hù)作用，從而維護(hù)呼吸系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[19].

已有研究中，越來(lái)越多的證據(jù)表明，氣道疾病發(fā)生形成復(fù)雜應(yīng)力場(chǎng)時(shí)，上皮細(xì)胞組織承受了最大的壓力[20]，很多研究也都證實(shí)了氣道上皮細(xì)胞在氣道炎癥發(fā)生時(shí)能對(duì)外界應(yīng)力產(chǎn)生應(yīng)答[21].本文中使用方法對(duì)SD大鼠氣道上皮細(xì)胞剛度的測(cè)定其實(shí)反映的是細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白F-action的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞剛度發(fā)生了顯著性的減小，我們推測(cè)材料降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)在進(jìn)出細(xì)胞膜的過(guò)程中影響了細(xì)胞骨架正常狀態(tài)下的預(yù)應(yīng)力狀態(tài)[22]，造成了初期細(xì)胞剛度的顯著下降，但隨后細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)答機(jī)制又使細(xì)胞自我調(diào)整了骨架重構(gòu)的狀態(tài)，最終達(dá)到平衡，出現(xiàn)剛度穩(wěn)定的狀態(tài).

3 結(jié) 論

本文針對(duì)人工氣管內(nèi)表面纖毛上皮缺失的問(wèn)題，以研究背景成熟深入且生物相容性較好的nBA和DEAEMA作為研究對(duì)象制備出了一種表面具有纖毛樣結(jié)構(gòu)的纖毛樣共聚物膜材料，對(duì)材料從化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)3個(gè)方面進(jìn)行了研究，提示了該材料在人工氣管內(nèi)表面修飾材料領(lǐng)域應(yīng)用的可行性.得到的主要結(jié)論如下：

1）合成的共聚物是一種超高分子量聚合物，其粒徑分布特征也為膜材料制備提供了理論基礎(chǔ)，而共聚物膜材料的疏水性、與人體氣道纖毛長(zhǎng)度相近的纖毛樣層高度及優(yōu)良的力學(xué)性能都證明了材料在人工氣管內(nèi)表面修飾材料領(lǐng)域的應(yīng)用可能，特別是FT-IR和1HNMR的詳細(xì)分析結(jié)果更是從分子組成結(jié)構(gòu)層面共同證實(shí)了聚合的發(fā)生及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)正確性.

2）共聚物的熱穩(wěn)定性和細(xì)胞安全性都表明了共聚物作為生物材料應(yīng)用的可行性，這種生物相容性的考察拓寬了丙烯酸酯類(lèi)聚合物在傳統(tǒng)的眼科、牙科及藥物緩釋材料中的應(yīng)用，為人工氣管功能化奠定了基礎(chǔ).

因此，無(wú)論從理化性質(zhì)、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和生物安全性的衡量上看，該膜材料很有可能作為一種人工氣管內(nèi)表面的修飾材料以代替實(shí)現(xiàn)氣道纖毛的模擬存在甚至物質(zhì)輸運(yùn)功能.

參考文獻(xiàn)

[1] VOGEL Gretchen. News focus： Betting on cilia[J].Science，2005，310（5746）： 216-218.endprint

[2] SATOH S， EISTRODT J， HINRICHS WL，et al. Tissue engineered prefabricated vascularized flaps [J]. Head & Neck，2007，29（5）： 458-464.

[3] SATOH S， EISTRODT J， HINRICHS WL，et al. Prevention of infection in a porous tracheal prosthesis by omental wrapping[J].Asaio Transactions，1990，36（3）： 438-440.

[4] KOMURA Makoto，KOMURA Hiroko，KANAMORI Yuta-ka，et al.An animal model study for tissue-engineered trachea fabricated from a biodegradable scaffold using chondrocytes to augment repair of tracheal stenosis[J]. Journal of Pediatric Surgery，2008，43（12）： 2141-2146.

[5] URBAN Marek W. Stratification，stimuli-responsiveness，self-healing，and signaling in polymer networks[J].Progress in Polymer Science，2009，34（8）： 679-687.

[6] TOONDER Jaap Den， BOS Femke， BROER Dick，et al. Artificial cilia for active micro-fluidic mixing [J]. Lab on a Chip，2008，8（4）： 501-632.

[7] KHADERI Syed， HUSSONG Jeanettem，WESTERWEEIL Jerry，et al.Fluid propulsion using magnetically-actuated artificial cilia-experiments and simulations [J]. The Royal Society of Chemistry，2013，3（31）： 12735-12742.

[8] OOSTEN Casper L， BASTIAANSEN Cees W， BROER Dirk J. Printed artificial cilia from liquid-crystal network actuators modularly driven by light [J]. Nature Materials，2009，8（8）： 677-682.

[9] ZARZAR Lauren D， KIM Philseok， AIZENBERG Joanna. Bio-inspired design of submerged hydrogel-actuated polymer microstructures operating in response to pH [J]. Advanced Materials，2011，23（12）： 1442-1446.

[10]VOLDER Michael De， PARK S， TAWFICK Sameh，et al. Stain-engineered manufacturing of freeform carbon nanotube microstructures [J]. Nature Communications，2014（5）：4512.

[11]樊磊磊. 壓力對(duì)共培養(yǎng)上皮細(xì)胞下的氣道平滑肌細(xì)胞影響的研究[D]. 重慶：重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，2010： 14-20.

FAN Leilei. A study on the effects of pressure force on airway smooth muscle cells via co-cultured epithelial cells [D]. Chongqing： College of Bioengineering，Chongqing University，2010： 14-20. （In Chinese）

[12]OVANDO-MEDINA Victor M， PERALTA Rene D， MENDIZABAL Eduardo. Semicontinuousmicroemulsion copolymerization of vinyl acetate and butyl acrylate： high solid content and effect of monomer addition rate [J]. Colloid and Polymer Science，2009，287（5）： 561-568.

[13]HIPPMANN Sophie， HEIN Christoph， HOFFMANN Hartmut. Correlation between the adhesive tensile strength and the engagement grade of crosswise oriented nonwovens of metal hook and loop fasteners [J]. Production Engineering，2008，2（4）： 395-400.

[14]VISSCHERS Marcel， LAVEN Jozua， GERMAN Anton L. Current understanding of the deformation of latex particles during film formation [J].Progress in Organic Coatings，1997，30（1/2）：39-49.endprint

[15]TADROS Tharwat， IZQUIERDO P， ESQUENA J，et al. Formation and stability of nano-emulsions [J].Advances in Colloid and Interface Science，2004，108/109（10）： 303-318.

[16]YANG Dayun，LU Xiaoying，HONG Ying，et al.The molecular mechanism of mediation of adsorbed serum proteins to endothelial cells adhension and growth on biomaterials [J]. Biomaterials，2013，34（23）： 5747-5758.

[17]JOHNSTON Robert L， SPALTON David J， HUSSAIN Ali，et al. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials [J].Journal of Cataract & Refractive Surgery，1999，25（8）： 1109-1115.

[18]XIANG Yang， TAN Yurong， ZHANG Jiansong，et al. Wound repair and proliferation of bronchial epithelial cells regulated by CTNNAL1 [J]. Journal of Cellular Biochemistry，2007，103（3）： 920-930.

[19]FARAH Claude S， KING Gregory G， BROWN Nathan J，et al. The role of small airways in the clinical expression of asthma in adults [J].Journal of Allergy and Clinical Immunology，2012，129（2）： 381-387.

[20]SADOSHIMA Junicha， IZUMO Seigo. The cellular and molecular response of cardiac myocytes to mechanical stress [J].Annual Review of Physiology，1997，59（1）： 551-571.

[21]VLAHAKIS Nicholas E， HUBMAYR Rolf D. Invited review： plasma membrane stress failure in alveolar epithelial cells [J]. Journal of Applied Physiology，2000，89（6）： 2490-2496.

[22]INGBER Donald E. Cell structure and hierarchical systems biololy [J].Journal of Cell Science，2003，116（7）： 1157-1173.endprint