R9—FOXM1（1—234aa）重組蛋白批量純化及其抑瘤效應研究

譚擁軍+余景衛(wèi)+陳燕+向勤+譚桂湘

摘 要：通過基因工程構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET15b-R9-FOXM1（1-234aa），轉(zhuǎn)化大腸桿菌建立構(gòu)建表達R9-FOXM1（1-234aa）的菌株.采用原核表達系統(tǒng)和His-tag親和純化手段，規(guī)?；苽浼兓┠る腞9-FOXM1（1-234aa），獲得的蛋白的純度達到90%以上.用R9-FOXM1（1-234aa）穿膜肽處理不同的腫瘤細胞，通過MTT實驗研究其細胞效應.結(jié)果顯示：當R9-FOXM1（1-234aa）穿膜肽的濃度達到2 mM時，腫瘤細胞的死亡率為50%左右.實驗表明穿膜肽R9-FOXM1（1-234aa）抑制不同腫瘤細胞的生長，有可能成為治療腫瘤的潛在蛋白類藥物.

關(guān)鍵詞：多聚精氨酸；細胞穿膜肽；FOXM1；腫瘤治療

中圖分類號：Q784 文獻標志碼：A

Study of Scale Purification and Anti-tumor Efficacy ofR9-FOXM1（1-234aa） Recombinant Protein

TAN Yongjun，YU Jingwei，CHEN Yan，XIANG Qin，TAN Guixiang

（College of Biology， Hunan University， Changsha 410082，China）

Abstract：A recombinant protein expression vector pET15b-R9-FOXM1（1-234aa） was constructed and transformed to E. coli in order to generate a strain expressing R9-FOXM1（1-234aa）. The recombinant protein R9-FOXM1 （1-234aa） （R9-FOXM1（1-234aa）） was isolated at a large scale through His-tag affinity chromatography. The purity of the purified protein reached 90%. Moreover， MTT assay was used to test the effect of R9-FOXM1（1-234aa） on cells， and the test results showed that R9-FOXM1（1-234aa） caused the cell death of different types of cancer cells with a half lethal dose around 2 mm。 The results also demonstrated that R9-FOXM1（1-234aa） suppressed the proliferation of cancer cells and may be considered as a potential angent for anti-cancer in the future.

Key words：arginine-rich； cell-penetrating peptides； FOXM1； tumor therapy

Forkhead Box（Fox）基因廣泛分布于從酵母到人的各種真核生物，構(gòu)成一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，在哺乳動物中已擁有超過40個以上的成員，分別參與調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、代謝及細胞凋亡等生理過程[2].該家族的成員FOXM1，首先被發(fā)現(xiàn)是一個調(diào)控細胞周期和細胞增殖的蛋白[3].在細胞增殖過程中，F(xiàn)OXM1表達水平增高，并參與調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)的多個基因轉(zhuǎn)錄，從而控制細胞的DNA復制與有絲分裂過程[4-6]，還與DNA損傷修復有關(guān)[7-8].通過小鼠肝臟再生模型的研究發(fā)現(xiàn)，當從肝細胞中特異性敲除FOXM1基因之后，肝臟再生過程中DNA的復制降低了80%，而有絲分裂被完全抑制[5].在FOXM1被敲除的肝細胞中，細胞核內(nèi)累積了大量細胞周期蛋白激酶的抑制蛋白p21Cip1和p27Kip1，從而大大降低了DNA的復制水平[5-6，9].同時，F(xiàn)OXM1還上調(diào)激活DNA復制所必須的Cdc25A 磷酸酶的表達[5].另一方面，F(xiàn)OXM1的缺失抑制了有絲分裂過程：因為FOXM1控制著許多與有絲分裂相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，其中包括cyclin B1，Cdc25B，polo-like kinase 1（PLK1），aurora B kinase，Survivin，著絲粒蛋白A（CENPA）和CENPB基因[5-6，10-11].此外，不同器官中有條件敲除FOXM1還抑制了致癌劑所誘導的肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等實體瘤的發(fā)生和發(fā)展[9，12-13].

FOXM1蛋白氮端能夠通過與碳端結(jié)合，干擾FOXM1碳端的磷酸化，抑制FOXM1轉(zhuǎn)錄活性、競爭性阻礙FOXM1與其他腫瘤促進因子互作及促瘤信號通路對FOXM1的修飾活化作用等[14].在細胞周期G2階段，F(xiàn)OXM1的激活依賴cyclin A/cdk的磷酸化，缺失N端的FOXM1不再依賴cyclin A，細胞周期被激活[15].

細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是由氨基酸組成具有穿透細胞膜能力的多肽，最早從人HIV-1的TAT蛋白中發(fā)現(xiàn)：該蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段區(qū)域[16]；多聚精氨酸作為目前已知最為簡單有效的細胞穿膜肽，其中以九聚精氨酸 （R9）效率最高（大約為TAT的20倍），具有極大的研究及應用價值[17].本實驗通過構(gòu)建攜帶R9的FOXM1-N（1-234aa）原核誘導表達體系，采用His-tag親和純化手段進行批量純化，選用不同腫瘤細胞株，研究重組蛋白對腫瘤細胞的影響.endprint

1 材料與方法

1.1 材 料

乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549來源于（American Type Culture Collection，ATCC），二苯基溴化四氮唑藍（MTT）由上海生工提供，DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基均為GIBCO公司產(chǎn)品，HisTrapTMFF.crude，AKTA均由GE公司提供.

1.2 方 法

1.2.1 pHis-FOXM1（1-234aa）-R9的構(gòu)建

設(shè)計NcoI，BamHI限制性內(nèi)切酶上下游引物，引物序列如下：

引物1（上游引物）：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG AAA ACT AGC CCC CGT CG.

引物2（下游引物）：GCG GAT CCC TAC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTT CTC CTA GAC ACA GAG TTC TGC CAG G.

以pcDNA3.1-FOXM1為模板，在引物1和引物2的引導下PCR擴增反應體系為：克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-FOXM1（80 ng/μL）1 μL，10X PCR Buffer for KOD-PLus-Neo5 μL，dNTPs（2 mM each）5 μL，MgSO4溶液（25 mM）4 μL，KOD-PLus-Neo（1.0 U/mL）1 μL，引物1（100 nM）1 μL，引物2（100 nM）1 μL，DMSO2 μL，加去離子水補充至反應體系50 μL.PCR反應條件：先94 ℃ 5 min；再95 ℃ 30 s， 57 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s，共30個循環(huán)；然后68 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min.反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化擴增的目的片段，純化產(chǎn)物溶于40 μLTE緩沖液中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?

利用NcoI，BamHI限制性內(nèi)切酶切出克隆片段的粘性末端.酶切體系：目的片段（150 ng/mL）或pET-15b質(zhì)粒（150 ng/mL）6.7 μL，NcoI限制性內(nèi)切酶0.5 μL，BamHI限制性內(nèi)切酶0.5 μL，10X FastDigest Buffer1 μL，加去離子水至總體積10 μL，37 ℃水浴反應30 min.

將NcoI，BamHI限制性內(nèi)切酶處理的目的片段和載體進行連接，連接體系及反應條件為：酶切載體5.63 μL，酶切目的片段2.36 μL，T4 DNA Ligase（5 U/mL）1 μL，10X T4 DNA Ligase buffer1 μL，加去離子水至反應體系10 μL.22 ℃反應20 min，-20 ℃凍存?zhèn)溆?

取一管DH5α感受態(tài)細胞置于冰上溶解，待感受態(tài)完全溶解后，加入1 μL的連接片段，用拇指輕彈混勻，冰上放置30 min.熱激過程：42 ℃熱激90 s，冰上放置2 min；加入1 mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃放置45 min；取200 μL涂布LB平板（氨芐青霉素濃度為25 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)過夜（12～16 h）；挑取單克隆，接種到5 mL的LB培養(yǎng)液（含25 μg/mL 氨芐青霉素） 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜（12～16 h）.提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NcoI，BamHI進行酶切鑒定，保種并分裝測序.pHis-FOXM1（1-234aa）-R9原核表達質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（圖1（a））.

1.2.2 重組蛋白的規(guī)?；苽浼皺z測

將表達載體pHis-FOXM1（1-234aa）-R9轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rostta DE3感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜（12～16 h），隨機挑選一個單克隆，接種到5 mL的LB培養(yǎng)基（含25 μg/mL 氨芐青霉素和25 μg/mL 氯霉素），37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h.將菌液加到100 mL的LB培養(yǎng)液（含25 μg/mL 氨芐青霉素和25 μg/mL 氯霉素）37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜（12～16 h），取菌液檢測OD600值，調(diào)整OD600值至0.8～1，加入IPTG誘導劑（終濃度0.8 mM），30 ℃誘導振蕩培養(yǎng)6 h.4 000 r/min離心20 min收集菌體，用15 mL Binding Buffer（20 mM Na3PO4， 500 mM NaCl， 20 mM imidazole， pH 7.4）重懸菌體，超聲40 min（超3 s，停2 s）破碎菌體.細菌裂解液采用原核表達系統(tǒng)和His-tag親和純化手段，純化后蛋白利用SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測蛋白.

根據(jù)上述確認的菌液進行擴大培養(yǎng)，在8瓶500 mL的搖瓶進行培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，取菌液檢測OD600值，調(diào)整OD600值至0.8～1，加入IPTG誘導劑，30 ℃誘導振蕩培養(yǎng)6 h.4 000 r/min離心20 min收集菌體，用15 mL Binding Buffer重懸菌體，超聲40 min破碎菌體.裂解液用HisTrapTMFF.crude親和層析方法，通過GE AKTA蛋白純化系統(tǒng)，用不同強度的離子濃素洗脫，收集吸收峰出現(xiàn)的樣品，然后利用SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測蛋白.

1.2.3 MTT法檢測細胞活性

取對數(shù)期細胞，以每孔20 000個細胞接種到96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.吸出培養(yǎng)基，加入純化的蛋白，蛋白按照5個濃度梯度，5個平行樣處理細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.每孔加入20 μL MTT培養(yǎng)4 h，小心吸出上清，每孔加100 μL DMSO，用酶標儀測定492 nm的吸光度OD值.利用Origin 9.0軟件系統(tǒng)繪制曲線.

2 實驗結(jié)果endprint

2.1 pHis-FOXM1（1-234aa）-R9的構(gòu)建

PCR擴增R9-FOXM1（1-234aa）目的基因，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶位于700bp位置，如圖1（b）所示.構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pHis-FOXM1（1-234aa）-R9經(jīng)NcoI，BamHI限制性內(nèi)切酶處理，結(jié)果如圖1（c）所示，1號樣品符合結(jié)果，測序結(jié)果比對，與理論序列一致.

2.2 重組蛋白R9-FOXM1（1-234aa）的批量純化及鑒定

裂解液采用原核表達系統(tǒng)和His-tag親和純化手段，采用不同洗脫強度收集純化蛋白，實現(xiàn)規(guī)模化制備純化穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-234aa）的重組蛋白，并獲得純化過程的HPLC分析譜圖圖2（a），橫坐標表示洗脫體積，縱坐標表示吸收峰UV280.吸收峰曲線代表整個過程中UV280檢測結(jié)果，階梯狀曲線代表洗脫液的離子強度（實驗過程中采用梯度洗脫），箭頭為重組蛋白吸收峰.SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測蛋白制備不同階段的蛋白樣品，上樣量均為10 μg（圖2（b），AKTApurifier蛋白純化儀純化過程中不同時間段純化蛋白的純度，100%洗脫時目的蛋白的純度高，箭頭為目的蛋白的位置.Lane1：Marker Lane2：sample Lane3：filtered sample Lane4：No binding sample Lane5：0% elutionB Lane6：30% elutionB Lane7：100% elutionB）.

2.3 重組蛋白R9-FOXM1（1-234aa）對腫瘤細胞的抑制效應

MTT實驗驗證重組蛋白對腫瘤細胞增殖表型的影響：選擇乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549、肝癌HepG2細胞，用不同濃度的重組蛋白（1 μmol/L，3 μmol/L，5 μmol/L，7 μmol/L，9 μmol/L）進行處理，24 h時后檢測細胞的活性，R9-GFP處理作為對照，獲得劑量依賴曲線，如圖3（a）不同濃度重組蛋白處理231細胞，24h后細胞的影響，圖3（c）不同濃度重組蛋白處理A549細胞，24h后細胞的影響，圖3（e）不同濃度重組蛋白處理HepG2細胞，24h后細胞的影響.針對所選細胞，固定重組蛋白處理濃度（1 μmol/L），在處理后不同時間點（1 d，2 d，3 d）檢測細胞活性，獲得相關(guān)細胞的生長曲線，圖3（b）1 μmol/L重組蛋白處理231細胞，3d內(nèi)細胞活性變化，圖3（d）1 μmol/L重組蛋白處理A549細胞，3d內(nèi)細胞活性變化，圖3（f）1 μmol/L重組蛋白處理HepG2細胞，3d內(nèi)細胞活性變化.實驗結(jié)果表明，R9-FOXM1（1-234aa）對不同的腫瘤細胞都具有一定的抑制作用.

3 結(jié) 論

轉(zhuǎn)錄因子FOXM1能刺激細胞增殖、增強DNA損傷修復能力、維持細胞干性、促進細胞遷移，并被作為腫瘤治療的分子靶標，抑制FOXM1有效抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.FOXM1蛋白氮端抑制FOXM1轉(zhuǎn)錄活性、競爭性阻礙FOXM1與其他腫瘤促進因子互作及促瘤信號通路對FOXM1的修飾活化作用等.本實驗研究結(jié)合多聚精氨酸R9穿膜肽，構(gòu)建了穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-234aa）的原核表達質(zhì)粒；采用原核表達系統(tǒng)和His-tag親和純化手段，規(guī)模化制備穿膜肽R9-FOXM1（1-234aa）.相對手動純化，實驗純化手段具有蛋白純度高，產(chǎn)量高，時間短等明顯優(yōu)勢.為進一步的活體實驗提供充足的材料.細胞水平上選擇了不同類型的腫瘤細胞（乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549、肝癌HepG2）開展實驗，證實了R9-FOXM1（1-234aa）對腫瘤細胞的抑制作用，R9-FOXM1（1-234aa）具體的作用機制還需要進一步的研究.本研究為R9-FOXM1（1-234aa）成為新型抗腫瘤蛋白類藥物提供了初步理論基礎(chǔ).

參考文獻

[1] KAESTNER K H，KNOCHEL W，MARTINEZ D E. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors [J]. Genes Development，2000，14（2）：142-146.

[2] HANNENHALLI S，KAESTNER K H. The evolution of Fox genes and their role in development and disease[J]. Nature Review Genetics，2009，10（4）：233-240.

[3] YE H，KELLY T F，SAMADANI U，et al. Hepatocyte nuclear factor 3/fork head homolog 11 is expressed in proliferating epithelial and mesenchymal cells of embryonic and adult tissues[J]. Molecular Cell Biology，1997，17（3）：1626-1641.

[4] YE H，HOLTERMAN A X，YOO K W，et al. Premature expression of the winged helix transcription factor HFH-11B in regenerating mouse liver accelerates hepatocyte entry into S phase[J]. Molecular Cell Biology，1999，19（12）：8570-8580.

[5] WANG X，KIYOKAWA H，DENNEWITZ M B，et al. The Forkhead Box m1b transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regeneration[J]. Proceeding of the National Academy of Science USA，2002，99（26）：16881-16886.endprint

[6] WANG I C，CHEN Y J，HUGHES T，et al. Forkhead box M1 regulates the transcriptional network of genes essential for mitotic progression and genes encoding the SCF （Skp2-Cks1） ubiquitin ligase [J]. Molecular Cell Biology，2005，25（24）：10875-10894.

[7] TAN Y，RAYCHAUDHURI P，COSTA R H. Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes[J]. Molecular Cell Biology，2007，27（3）：1007-1016.

[8] TAN Y，CHEN Y，YU L，et al. Two-fold elevation of expression of FoxM1 transcription factor in mouse embryonic fibroblasts enhances cell cycle checkpoint activity by stimulating p21 and Chk1 transcription [J]. Cell Proliferation，2010，43（5）：494-504.

[9] KALINICHENKO V V，MAJOR M L，WANG X M B，et al. Foxm1b transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19ARF tumor suppressor [J]. Genes Development，2004，18（7）：830-850.

[10]KRUPCZAK-HOLLIS K，WANG X，KALINICHENKO V V，et al. The mouse Forkhead Box m1 transcription factor is essential for hepatoblast mitosis and development of intrahepatic bile ducts and vessels during liver morphogenesis [J]. Developmental Biology，2004，276（1）：74-88.

[11]WANG X，QUAIL E，HUNG N J，et al. Increased levels of forkhead box M1B transcription factor in transgenic mouse hepatocytes prevent age-related proliferation defects in regenerating liver [J]. Proceeding of the National Academy of Science USA，2001，98（20）：11468-11473.

[12]KIM I M，ACKERSON T，RAMAKRISHNA S，et al. The Forkhead Box m1 transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer[J]. Cancer Research，2006，66（4）：2153-2161.

[13]YOSHIDA Y，WANG I C，YODER H M，et al. The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer [J]. Gastroenterology，2007，132（4）：1420-1431.

[14]PARK H J，WANG Z，COSTA R H，et al. An N-terminal inhibitory domain modulates activity of FoxM1 during cell cycle [J]. Oncogene，2008，27（12）：1696-1704.

[15]LAOUKILI J，ALVAREZ M，MEIJER L A，et al. Activation of FoxM1 during G2 requires cyclin A/Cdk-dependent relief of autorepression by the FoxM1 N-terminal domain [J]. Molecular and Cellular Biology，2008，28（9）：3076-3087.

[16]REGBERG J，SRIMANEE A，LANGEL U，et al. Applications of cell-penetrating peptides for tumor targeting and future cancer therapies [J]. Pharmaceuticals （Basel），2012，5（9）：991-1007.

[17]SCHMIDT N，MISHRA A，LAI G H，et al. Arginine-rich cell-penetrating peptides [J]. FEBS Letters，2010，584（9）：1806-1813.endprint