青島地區(qū)觀賞鳳梨葉斑病的病原分離與鑒定

孫慧琳　岳弘辰　黃金光　徐曉蘭

摘要：2017年在青島市城陽區(qū)、李滄區(qū)多個(gè)花卉市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，觀賞鳳梨葉斑病發(fā)病率高達(dá)30%～50%。采集觀賞鳳梨葉斑病病葉，對(duì)病原菌進(jìn)行分離，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并通過致病試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：引起青島地區(qū)觀賞鳳梨葉斑病的病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。本研究首次報(bào)道鏈格孢菌引起觀賞鳳梨葉斑病，對(duì)該病害的防治具有重要意義。

關(guān)鍵詞：觀賞鳳梨葉斑?。绘湼矜呔恍螒B(tài)特征；分子鑒定；致病試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0116-04

Abstract The ornamental pineapple leaf spot occurred seriously in several flower markets in Qingdao in 2017 with the disease rate up to 30%～50%. The pathogens were isolated from the infected leaves of ornamental pineapple leaf spot and then identified by morphological and molecular biology methods and verified by pathogenicity test. It showed that the ornamental pineapple leaf spot was caused by Alternaria alternata. This was the first report of ornamental pineapple leaf spot caused by A.alternata in China， and it is of great significance for the prevention and control of the disease.

Keywords Ornamental pineapple leaf spot； Alternaria alternata； Morphological characteristics； Molecular identification； Pathogenicity test

觀賞鳳梨（Ornativa pineapple）屬鳳梨科（Bromeliaceae），原產(chǎn)于中、南美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)，于20世紀(jì)80年代傳入中國，是國內(nèi)外廣受歡迎的室內(nèi)常綠觀賞花卉植物。觀賞鳳梨除具有觀賞價(jià)值外，還具有吸收污染物的特性，可用作空氣污染指示植物[1]。

觀賞鳳梨葉斑病造成葉片產(chǎn)生橢圓形或不規(guī)則形病斑，中央灰褐色，邊緣深褐色，有水漬狀黃色圈，病斑引起葉片局部皺縮，嚴(yán)重可致葉片干枯，使植株生長受阻。國內(nèi)外有關(guān)觀賞鳳梨葉斑病的報(bào)道中，曾莉等[2]鑒定了筒鳳梨擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis spectabilis V. G. Rao & B. R. D. Yadav）、可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat.）、鳳梨頂多毛孢菌（Bartalinia ananassa L. Zeng， Z. D. Jiang et P. K. Chi）、油球擬莖點(diǎn)霉[Phomopsis diplodinoides （Sacc.） Punith.]等8種引起觀賞鳳梨葉斑病的病原菌。馮淑杰等[3]報(bào)道了觀賞鳳梨葉斑病的病原菌為炭疽菌（Colletotrichum sp.）和彎孢霉（Curvularia sp.），兩者單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染都可引起葉斑病的發(fā)生。2014年，在福建省首次報(bào)道彎孢霉（Curvularia clavata）侵染鳳梨（Ananas comosus）葉片引起葉斑病[4]。2017年，觀賞鳳梨葉斑病在青島市城陽區(qū)、李滄區(qū)多個(gè)花卉市場(chǎng)普遍發(fā)生。為了明晰青島地區(qū)觀賞鳳梨葉斑病病原菌，為病害的防控提供理論依據(jù)，本研究結(jié)合病原形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并通過致病性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌可引起觀賞鳳梨葉斑病，為觀賞鳳梨病害的防治提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原物的分離

2017年9月，在青島市城陽區(qū)、李滄區(qū)的花卉市場(chǎng)采集觀賞鳳梨葉斑病病葉，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原物的分離培養(yǎng)。

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后觀察菌落的形態(tài)特征。同時(shí)從培養(yǎng)皿中挑取少量菌絲及孢子，放在滴有無菌水的載玻片上制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡（Olympus BX53）下觀察菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征，并測(cè)量大小。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[5]。用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]，利用另一對(duì)引物H3-1a（5′-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3′）和H3-1b（5′-GCGGGCGAGCT GGATGTCCTT-3′）對(duì)cds histone 保守基因進(jìn)行擴(kuò)增 [7]。PCR反應(yīng)體系均為20 μL，反應(yīng)液為：2 × TSINGKE Master Mix 10 μL，引物（ITS1/ITS4或H3-1a/H3-1b）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。在質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比。

1.4 致病性測(cè)定試驗(yàn)

1.4.1 孢子懸浮液接種 將待接種健康觀賞鳳梨葉部組織用無菌水清洗干凈，70%乙醇消毒。將孢子懸浮液濃度控制在1×105～1×107個(gè)/mL。取20 μL分生孢子懸浮液分別滴至人工刺傷及無刺傷的健康葉片上，以無菌水作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，接種后室溫下保濕培養(yǎng)，每隔24 h觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4.2 菌餅接種 取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病原菌菌餅分別接種在人工刺傷及無刺傷健康葉片上。以空白PDA塊作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，接種后室溫下保濕培養(yǎng)，每隔24 h觀察并記錄發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀賞鳳梨葉斑病的癥狀及病原物形態(tài)特征

2.1.1 觀賞鳳梨葉斑病癥狀 葉斑病只侵染觀賞鳳梨葉片，未發(fā)現(xiàn)侵染花序的現(xiàn)象。發(fā)病初期，葉片邊緣出現(xiàn)小的褪綠斑，隨后褪綠部分逐漸變褐，并向葉片內(nèi)部逐漸擴(kuò)展為橢圓形或不規(guī)則形病斑，有黃色暈圈。病害發(fā)展后期，病斑邊緣顏色加深為黑褐色，造成葉片局部卷曲，影響植株的正常生長（圖1A）。

2.1.2 病原菌形態(tài)特征 將保存的菌株接種于PDA培養(yǎng)基（9 cm×9 cm）后，菌落鋪展近圓形，氣生菌絲初為白色，后逐漸變?yōu)榛液稚?（圖1B）。菌絲無色透明，分生孢子梗淡褐至褐色，以合軸式延伸。分生孢子頂端無喙或有喙，單生或串生，倒棍棒形、橢圓形或卵圓形，大小為（19.9～44.0） μm×（7.2～16.5） μm，具橫膈膜2～6個(gè)，1～5個(gè)縱、斜隔膜，分隔處略縊縮。短喙柱狀或錐狀，大小為（0～16.2） μm×（2.1～4.5） μm（圖1C和D）。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)觀賞鳳梨葉斑病病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到長度為544 bp的rDNA-ITS序列（Accession No. KY307851）（圖2A）。將該序列在GenBank中進(jìn)行同源性分析比較，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該菌株的rDNA-ITS序列與已報(bào)道的A. alternata（KY307851、KJ008698、KR709045等）和A. tenuissima（KF919124、JF802103、KF887098等）的同源性均達(dá)99%以上。通過對(duì)菌株cds histone保守基因序列進(jìn)行擴(kuò)增（圖2B）并比對(duì)，與已報(bào)道的鏈格孢菌株A. alternata（KF997064、KF308951、AF404593等）的同源性均達(dá)到99%，最終確定該菌株為鏈格孢菌。

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

用孢子懸浮液（濃度為4.5×105個(gè)/mL）接種，無論自然條件還是刺傷接種均未發(fā)病（圖略）。用菌餅接種，自然條件下未發(fā)病，刺傷條件接種48 h后發(fā)病癥狀明顯（圖3）。

3 討論與結(jié)論

葉斑病是觀賞鳳梨的主要病害之一，在廣東等地區(qū)均有報(bào)道[2]，隨著觀賞鳳梨在北方地區(qū)的流行，觀賞鳳梨葉斑病有逐漸加重的趨勢(shì)。本研究于2017年9月在青島多地花卉市場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)觀賞鳳梨葉斑病發(fā)生普遍，隨即開展了病原菌的分離、鑒定工作，并根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病試驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定該病原菌為鏈格孢菌，此為國內(nèi)外首次報(bào)道由A. alternata引起觀賞鳳梨葉斑病。

鏈格孢屬（Alternata）真菌種類繁多，一些小孢子鏈格孢廣泛存在于自然界中，腐生于植物殘?bào)w及其它物質(zhì)中，而一些大孢子鏈格孢能侵染活體植物葉片，造成葉斑病[7]。鏈格孢菌寄主廣泛，可以危害十字花科、茄科等多種蔬菜，也可造成煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病等病害。在本研究的致病試驗(yàn)中，自然無傷接種條件下觀賞鳳梨葉片未出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象，但在有傷口菌餅接種條件下保濕48 h后出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，證明鏈格孢菌為觀賞鳳梨的一種弱致病菌，可以從傷口侵染植株造成葉斑病。因此在觀賞鳳梨的栽培生產(chǎn)和搬運(yùn)過程中，應(yīng)該注意保護(hù)植株葉片防止造成傷口，以此切斷病原菌侵染途徑，達(dá)到防治觀賞鳳梨葉斑病的目的，從而提高觀賞鳳梨的觀賞價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)：

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