魚(yú)類腸道菌群與免疫力的相關(guān)性研究

羅亮，趙志剛，都雪，徐奇友

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

腸道菌群作為生物體“被遺忘的器官”在生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其含有的幾百萬(wàn)個(gè)基因也被稱為生物體的“第二基因組”[1]。機(jī)體腸道內(nèi)大量而復(fù)雜的微生物在演變和適應(yīng)過(guò)程中逐漸形成了腸道菌群。魚(yú)類受環(huán)境的影響和作用，腸道內(nèi)進(jìn)化出與所處環(huán)境相適應(yīng)的正常菌群[2]。魚(yú)類腸道中這些有益菌群分泌多糖、脂類、維生素、相關(guān)活性酶類等一系列代謝產(chǎn)物，共同促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的作用。這些有益微生物占優(yōu)勢(shì)時(shí)，抑制了病原微生物的生長(zhǎng)，提高了魚(yú)體的抗病能力，腸道正常菌群就像一道屏障保護(hù)魚(yú)體健康生長(zhǎng)[2,3]。魚(yú)類腸道菌群在促進(jìn)建立機(jī)體免疫、屏障致病菌入侵、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與利用等方面起重要作用[4]。近年來(lái)，腸道菌群與宿主健康的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，作為人類路線圖計(jì)劃（road map plan）一部分的人體微生物群系項(xiàng)目（Human Microbiome Project，HMP）、歐盟資助的“人類腸道宏基因組計(jì)劃”都在如火如荼地進(jìn)行，而且取得了很多重要研究成果[1,5-7]。為提高健康水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，也圍繞著魚(yú)類腸道菌群形成、組成和種類及影響因素、生理功能、與機(jī)體免疫相關(guān)性等方面開(kāi)展了一系列研究。本文著重討論了魚(yú)類腸道菌群結(jié)構(gòu)與免疫力相關(guān)性的研究進(jìn)展。

1 魚(yú)類腸道菌群的形成

腸道菌群與宿主關(guān)系密切，了解腸道菌群在宿主發(fā)育過(guò)程中的變化是揭示腸道菌群形成的關(guān)鍵。有研究者認(rèn)為，腸道菌群與宿主間的復(fù)雜相互作用始于宿主出生之后[8]。Hansen等[9]測(cè)定了鱈Gadus morhua L.和鰈Hippoglossus hippoglossus卵中的菌群，發(fā)現(xiàn)在魚(yú)卵階段由于其消化腺還沒(méi)有形成，不存在菌群定植情況。魚(yú)類發(fā)育早期腸道微生物群落的形成和組成目前仍不清楚[10]。魚(yú)類胚胎在卵膜內(nèi)無(wú)菌環(huán)境中發(fā)育孵化，只有破膜而出接觸外界環(huán)境及獲得開(kāi)口餌料后，腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)才開(kāi)始形成[10,11]。Sugita等[12]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)Oreochromis mossambicus仔魚(yú)在孵出20～60d后，腸道內(nèi)開(kāi)始有菌群定植。他們推斷這些細(xì)菌來(lái)自養(yǎng)殖水、底泥或其他魚(yú)類糞便等外界環(huán)境。史秀清等[13]研究了影響大菱鲆Scophthalmus maximus仔稚魚(yú)發(fā)育早期腸道菌群結(jié)構(gòu)形成的因素，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群結(jié)構(gòu)在開(kāi)口攝食后不久就趨于穩(wěn)定。大菱鲆仔稚魚(yú)腸道對(duì)定植的菌種具有選擇性，一些水環(huán)境和餌料中的非優(yōu)勢(shì)菌也會(huì)定植于腸道，成為大菱鲆腸道中的次優(yōu)勢(shì)菌。仔稚魚(yú)時(shí)期腸道菌群的定植對(duì)后期菌群的形成與發(fā)展具有重要的影響[14]。Roeselers等[15]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Danio rerio飼養(yǎng)在不同條件下腸道菌群中存在著相似的核心微生物組群。

也有部分研究者比較研究了魚(yú)類整個(gè)生命周期腸道菌群組成的變化。Stephens等[16]從受精卵到成魚(yú)7個(gè)特定時(shí)間采樣，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段的斑馬魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)不同。Li等[17]分析了銀鯽Carassius auratus gibelio在不同發(fā)育階段的腸道菌群組成，結(jié)果表明隨著魚(yú)類的發(fā)育，腸道菌群多樣性顯著增加，在相同環(huán)境及投喂情況下，不同發(fā)育階段的銀鯽腸道菌群組成有所改變。腸道菌群的一些特征可能由宿主的發(fā)育決定。魚(yú)類不同發(fā)育階段的腸道菌群形成受到各種外界環(huán)境因素的共同作用和影響。

2 魚(yú)類腸道菌群的數(shù)量及組成

種類、生長(zhǎng)與棲息環(huán)境、是否投餌、投飼策略、腸道自身生理特征等因素均影響魚(yú)類腸道菌群的數(shù)量和組成，這些因素間既統(tǒng)一又相互作用。有研究表明，淡水魚(yú)腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在105～108CFU·g-1之間[12,18]，而海水魚(yú)腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在106～108CFU·g-1之間[19]。Turst&sparrow[20]曾指出，魚(yú)類腸內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量與腸道組織的關(guān)系比與腸道內(nèi)容物的關(guān)系更密切。不同種類的魚(yú)腸道菌群組成也各不相同。李學(xué)梅等[21]采用PCR-DGGE指紋技術(shù)研究了斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus、銀鯽和異育銀鯽Carassius auratus gibelio腸道微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斑點(diǎn)叉尾腸道中檢測(cè)到的菌群主要是變形桿菌門Proteobacteria，而銀鯽和異育銀鯽腸道中菌群主要包括梭桿菌門Fusobacteria中的類群，還包括變形桿菌門中的氣單胞菌Aeromonas，以及一些未知的類群。所研究的不同種類魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群組成不同，這種差異受基因型的影響可能更大。黃麗麗等[22]利用16S rRNA高通量測(cè)序方法比較了新疆冷水魚(yú)腸道中微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種魚(yú)腸道微生物的組成及多樣性在門和屬水平上有明顯差異，而同種冷水魚(yú)的腸道內(nèi)容物和黏膜間微生物群落組成較為相似，無(wú)顯著差異。魚(yú)類生長(zhǎng)或棲息的環(huán)境和其所攝食的餌料是影響魚(yú)類腸道菌群中微生物數(shù)量和組成最重要的兩個(gè)因素。周志剛等[23]利用PCR-DGGE指紋圖譜分析比較了川紋笛鯛Lutjanus sebae及圓白鯧Ephippus orbis消化道壁的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種魚(yú)消化道壁的細(xì)菌多樣性及相對(duì)豐度有明顯區(qū)別，圓白鯧消化道壁細(xì)菌多樣性高于川紋笛鯛，這可能歸因于它們天然棲息地的差異性。白曉慧[24]研究認(rèn)為，消化酶活性在魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。消化酶的活性隨水環(huán)境的變化而改變。尹軍霞等[25]對(duì)魚(yú)食性與腸道菌群關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧Channa argus、鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳊 Parabramis pekinensis、鯽Carassius auratus等4種不同食性魚(yú)的后腸壁和后腸內(nèi)容物中厭氧菌總數(shù)遠(yuǎn)大于好氧菌總數(shù)，后腸內(nèi)容物菌數(shù)遠(yuǎn)大于后腸壁菌數(shù)；不同的魚(yú)后腸壁的好氧菌總數(shù)差別很大（如鰱后腸壁好氧菌總數(shù)7×1010CFU·g-1，而鯽后腸壁好氧菌總數(shù)為1.2×109CFU·g-1，前者是后者的58倍），而厭氧菌總數(shù)差別不大（最大數(shù)鳊與最小數(shù)鰱之間的比值僅為2.4倍）。

3 魚(yú)類腸道菌群與黏膜免疫

魚(yú)腸道內(nèi)棲息著大量的正常菌群，它們覆蓋在腸道表面黏膜上，形成一道天然拮抗致病菌入侵的機(jī)械屏障，同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性免疫反應(yīng)，與宿主共同維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，加強(qiáng)對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)[3,26]。Gallo等[27]研究認(rèn)為，腸道內(nèi)的正常共生菌群可以分泌一些具有抑菌活性的物質(zhì)，抑制病原微生物在腸道黏膜內(nèi)生長(zhǎng)、定植。Bergh等[28]研究指出，在魚(yú)體表和腸道黏膜內(nèi)定植的正常共生菌群作為屏障防止病原菌的入侵和寄居。如腸道中具有抑菌效果的乳酸菌可增強(qiáng)魚(yú)類免疫，促進(jìn)生長(zhǎng)[29]。周金敏等[30]從黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco腸道篩選了病原拮抗性芽孢桿菌，并研究了其特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株F14抗菌譜較廣，抑菌作用強(qiáng)，耐高溫和酸性環(huán)境，在飼料中穩(wěn)定性好，具有做為水產(chǎn)益生菌的潛力。健康魚(yú)腸道菌群的數(shù)量和種類處在動(dòng)態(tài)平衡之中，病原菌不能過(guò)量繁殖，以免引起疾病。但是，當(dāng)腸道正常菌群受到宿主各種因素刺激而失調(diào)時(shí)，病原菌就會(huì)趁機(jī)異常繁殖，導(dǎo)致宿主免疫能力降低而發(fā)病。張正等[31]分析發(fā)現(xiàn)，患病半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis腸道菌群中細(xì)菌種類數(shù)僅是同一養(yǎng)殖系統(tǒng)中健康魚(yú)的45.8%和64.5%，病魚(yú)腸道中細(xì)菌多樣性明顯下降。腸道正常菌群與腸道黏膜的共生互利關(guān)系在魚(yú)類腸道黏膜免疫中具有重要的作用。

4 魚(yú)類腸道菌群與細(xì)胞免疫

魚(yú)類的細(xì)胞免疫包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、淋巴細(xì)胞直接參加的細(xì)胞毒性、移植物排斥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞游走抑制和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等[32]。凡參與免疫應(yīng)答或與免疫有關(guān)的細(xì)胞均稱為免疫細(xì)胞。固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有單核/巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷（Natural killer,NK）等。它們具有吞噬和殺傷功能，也分泌免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[33]。目前關(guān)于魚(yú)類腸道菌群與細(xì)胞免疫間的相互作用研究較少。孫敬鋒等[3]推測(cè)，魚(yú)類腸道正常菌群對(duì)魚(yú)類細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用主要在于對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響。李莉[2]研究了草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的變化與免疫機(jī)能關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著草魚(yú)腸道中氣單胞菌屬細(xì)菌比例下降而腸桿菌科Enterobaeteriaeeae細(xì)菌的含量上升時(shí)，草魚(yú)白細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)明顯上升，這說(shuō)明草魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群的變化可能與增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬活性有關(guān)。利用益生菌鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus JCM1136投喂虹鱒發(fā)現(xiàn)其腸道中的有益菌群比例提高，頭腎白細(xì)胞的吞噬作用也顯著增強(qiáng)[34]。

5 魚(yú)類腸道菌群與體液免疫

體液免疫是指機(jī)體受抗原刺激后，淋巴細(xì)胞分化增殖，產(chǎn)生免疫球蛋白的應(yīng)答過(guò)程[32]。魚(yú)類體液免疫是魚(yú)類免疫的重要組成部分，包括特異性和非特異性體液免疫。魚(yú)類特異性體液免疫主要是指由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類免疫球蛋白，它能與相應(yīng)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。微生物生長(zhǎng)抑制物、補(bǔ)體、干擾素、凝集素、溶菌酶和急性期蛋白等作為非特異性抵抗作用的分子存在于魚(yú)類血液或粘液中[32]。葛莉莉[35]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)無(wú)菌動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)的喂養(yǎng)或喂食益生菌后，機(jī)體腸道形態(tài)和免疫系統(tǒng)迅速反應(yīng)，產(chǎn)生大量不同的針對(duì)腸道正常菌群的特異性抗體表型。王彥波等[36]在研究益生菌免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌09.712（Bacillus coagulans 09.712）在體外能顯著提高對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性，在體內(nèi)能誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答，提高斑馬魚(yú)的免疫力。陳勇等[37]應(yīng)用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立了異育銀鯽免疫抑制性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以研究添加殼聚糖或益生菌?duì)異育銀鯽免疫功能的影響。發(fā)現(xiàn)銀鯽的IgM含量和頭腎的溶菌酶活力均有不同程度的提高，適量的添加殼聚糖或益生菌能夠不同程度地消除魚(yú)類的免疫抑制。

6 結(jié)語(yǔ)

魚(yú)類腸道微生物菌群與宿主的代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫等密切相關(guān)，維持腸道正常菌群動(dòng)態(tài)平衡對(duì)宿主正常生命活動(dòng)至關(guān)重要。益生菌的利用研究主要集中在：一是用益微生物來(lái)調(diào)控養(yǎng)殖水質(zhì)、底質(zhì)，預(yù)防疾病；二是作為魚(yú)飼料添加劑添，提高消化酶、免疫酶等活力，提高魚(yú)機(jī)體免疫力。但是，腸道菌群與魚(yú)類免疫的研究理念、技術(shù)手段還較落后，應(yīng)深入研究腸道菌群與水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力二者之間的關(guān)系。