乳及乳制品中抗生素檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉 碩，王勝潔，賈麗娜

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061100）

牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，可提高人體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)，是對(duì)人類(lèi)最有益、最健康的食品之一。隨著高速發(fā)展的乳及乳制品行業(yè)，其中廣泛應(yīng)用了β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等抗生素，雖然讓畜牧業(yè)達(dá)到了增產(chǎn)的效果，但也不可避免地造成了抗生素的殘留[1]。因此，為解決我國(guó)當(dāng)前乳和乳制品行業(yè)面臨的難題而尋求簡(jiǎn)便快捷、敏感性高的抗生素檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

1 乳制品中抗生素殘留現(xiàn)狀

自2001年10月我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《無(wú)公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中明確提出新鮮牛乳“抗生素不得檢出”的衛(wèi)生指標(biāo)。但對(duì)這一標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)并沒(méi)有嚴(yán)格執(zhí)行，所以一直未能解決我國(guó)奶制品中抗生素殘留問(wèn)題，致使人們開(kāi)始擔(dān)憂(yōu)牛奶的安全問(wèn)題，并成為越來(lái)越受關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。

2009年，劉維華等人[3]對(duì)寧夏的363批生乳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶112批，總抗生素殘留145批，發(fā)現(xiàn)有非法添加、違反休藥期規(guī)定的抗生素超標(biāo)現(xiàn)象。2012年，張萍等人[4]對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)市售包裝純牛奶及奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的生鮮牛奶進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)都有一定量的抗生素殘留。由此看來(lái)，我國(guó)乳業(yè)中還會(huì)長(zhǎng)期存在牛奶中抗生素殘留的現(xiàn)象。

2 乳制品中抗生素來(lái)源

抗生素被廣泛地應(yīng)用到奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，在對(duì)奶牛進(jìn)行疾病治療和飼喂過(guò)程中很容易造成抗生素殘留，更因?yàn)橐恍┤藶橐蛩?，使抗生素直接殘留在牛奶中。乳制品中抗生素殘留的原因有：①抗生素常被?dāng)作治療藥物而用來(lái)預(yù)防和治療奶牛的各類(lèi)疾病，經(jīng)注射或者飼喂進(jìn)入體內(nèi)，通過(guò)血液進(jìn)入乳房而殘留于牛奶中，尤其是治療牛乳腺炎時(shí)使用的灌注法，極易造成殘留；②為達(dá)到預(yù)防疾病并提高產(chǎn)量的目的，在奶牛飼料中加入抗生素，奶牛食用消化，可能進(jìn)入各個(gè)組織器官，造成抗生素殘留；③不法商戶(hù)在擠奶、儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程中的不規(guī)范操作，在高溫季節(jié)向牛奶中摻雜各種抗生素，以防止牛奶酸敗變質(zhì)和細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，直接造成抗生素殘留。

3 乳制品中抗生素殘留危害

抗生素殘留于牛奶中會(huì)降低牛奶品質(zhì)，還會(huì)給飲用的人們帶來(lái)身體上的危害，長(zhǎng)期飲用則非常不利于人體健康，甚至?xí)埩粼诃h(huán)境中污染環(huán)境。乳制品中抗生素殘留的危害有：①長(zhǎng)期飲用含抗生素殘留的牛奶可使人體內(nèi)某些致病菌產(chǎn)生耐藥性，造成菌群失調(diào)，患病后再使用同種藥物會(huì)降低治療效果，自然而然使人的免疫力下降；②在經(jīng)常食用低劑量抗生素殘留食品的情況下，易感人群會(huì)出現(xiàn)超敏反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)喉頭水腫、呼吸困難、血壓下降等癥狀，嚴(yán)重者甚至休克[5]；③對(duì)體內(nèi)敏感菌起到一定的抑制作用，但會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌不敏感，在體內(nèi)擴(kuò)散，造成雙重感染，破壞腸道菌群平衡，從而破壞人體微生態(tài)平衡；④抗生素殘留的牛奶被人或動(dòng)物食用后，未吸收的抗生素會(huì)從尿液和糞便中排出，留在環(huán)境中污染環(huán)境。

4 乳制品中抗生素殘留檢測(cè)方法

近年來(lái)，檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅猛，已經(jīng)有大量簡(jiǎn)便快捷且成本低、靈敏度高的檢測(cè)方法應(yīng)用到乳制品抗生素殘留檢測(cè)中，如微生物檢測(cè)、理化檢測(cè)、免疫檢測(cè)等。未來(lái)更需要人們不斷探索研究出更加精確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法來(lái)滿(mǎn)足日趨嚴(yán)格的檢測(cè)要求。

4.1 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法是經(jīng)典的較為廣泛應(yīng)用的方法，測(cè)定原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物生理機(jī)能、代謝的抑制作用來(lái)定性確定樣品中抗微生物藥物殘留[6]。它的測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果誤差大、操作簡(jiǎn)單、成本低，不需要大型儀器和專(zhuān)業(yè)操作人員完成，可在一般實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)場(chǎng)使用。微生物檢測(cè)主要包括TTC法、試劑盒法等。

TTC法[氯化三苯基四氮唑（Tripheye tetrazolium chloride）]是我國(guó)鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 4789.27—2008） 第一法。其原理是利用 2,3,5氯化三苯四氮唑與指示菌反應(yīng)顯色，當(dāng)物質(zhì)中有抗生素殘留顯色，無(wú)殘留則不顯色。然而，此法的檢測(cè)靈敏度還不夠高，而且時(shí)間較長(zhǎng)，在3 h以上，但很適合奶牛場(chǎng)和食品衛(wèi)生檢測(cè)部門(mén)使用。

黃怡君等人[7]采用TTC法對(duì)奶牛場(chǎng)常用的青霉素、紅霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶等幾種抗菌藥物檢測(cè)其最低檢測(cè)濃度，其結(jié)果為青霉素3 μg/kg，紅霉素 30 μg/kg，卡那霉素 6 200 μg/kg，環(huán)丙沙星500 μg/kg，磺胺嘧啶100 μg/kg。TTC 法應(yīng)用范圍較廣，符合我國(guó)奶牛場(chǎng)中較多種類(lèi)抗生素的使用現(xiàn)狀。

試劑盒法為牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)提供了一種更方便、更有效的方法。其原理為：在65℃加熱微孔板，孢子萌發(fā)產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基的pH值下降，顏色由紫色變?yōu)椴菥G色或黃色。如果牛奶中含有比檢測(cè)限高的抗生素，就抑制了孢子萌發(fā)，不產(chǎn)生酸，培養(yǎng)基保持原來(lái)的顏色。此方法用肉眼觀(guān)察顏色變化即可判斷抗生素殘留情況[8]。

謝莉等人[9]以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌，溴甲酚紫為指示劑，加入合適的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)作為輔助，研制了96孔板試劑盒法。對(duì)牛奶中青霉素、阿莫西林以及頭孢匹林的檢測(cè)限進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)出其檢測(cè)限分別為3，4，8 ng/mL。劉冬梅等人[10]也利用嗜熱脂肪芽孢桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素敏感的特點(diǎn)，優(yōu)化其生長(zhǎng)條件，制成試劑盒，測(cè)出青霉素鈉的檢測(cè)限為2～4 μg/L。試驗(yàn)證明，此法靈敏度高于國(guó)標(biāo)TTC法，而且省去了TTC法復(fù)雜的前處理，便宜快捷，適于推廣應(yīng)用。

4.2 理化檢驗(yàn)法

理化檢測(cè)方法是以抗生素分子性質(zhì)為基礎(chǔ)，借助試驗(yàn)儀器進(jìn)行分離和檢測(cè)的一種方法。分離檢測(cè)應(yīng)用的試驗(yàn)技術(shù)包含色譜和電泳、紫外、熒光、質(zhì)譜等。因?yàn)闄z測(cè)靈敏、結(jié)果精確穩(wěn)定，理化檢測(cè)法是一種精確檢測(cè)抗生素殘留的方法[11]。

王浩等人[12]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)我國(guó)市售的50種乳品進(jìn)行了檢測(cè)，檢出其中樣品氯霉素含量為0.48 μg/kg。這些樣品的檢測(cè)限不合格，違反了我國(guó)食品可食用組織不得檢出氯霉素的相關(guān)規(guī)定。張尹等人[13]結(jié)合超聲輔助萃取和固相柱萃取，優(yōu)化了HPLC色譜分析條件，建立了完整的HPLC檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺抗生素殘留的分析方法。

這些方法具備定性和定量準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)儀器的費(fèi)用較高、程序較復(fù)雜、有機(jī)溶劑的使用量很大，對(duì)人體和環(huán)境具有一定的危險(xiǎn)性。

4.3 免疫分析法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的特點(diǎn)有靈敏度高、特異性強(qiáng)、處理量大等優(yōu)點(diǎn)。目前，應(yīng)用最為廣泛，認(rèn)可最高的是美國(guó)SNAP利用酶聯(lián)免疫和激光探測(cè)技術(shù)研發(fā)的SNAPTM抗生素殘留快速檢測(cè)系統(tǒng)，可以快速檢測(cè)出牛奶中的抗生素殘留量，但其影響因素較多，是國(guó)內(nèi)外抗生素殘留比較普遍、快速的檢測(cè)方法[14]。

ELISA試劑主要對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素較敏感，對(duì)其他抗生素藥物的敏感度不高，何金環(huán)等人[15]用ELISA法對(duì)隨機(jī)抽取的50份純牛奶樣品進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)，測(cè)出其抗生素陽(yáng)性率為20%。姜侃等人[16]建立直接ELISA競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)已知陰性和陽(yáng)性的生鮮牛乳中的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，優(yōu)化了檢測(cè)條件，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，并未出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果。ELISA測(cè)定法適于大量樣品檢測(cè)，可以推廣。

4.4 新檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

免疫分析法具有影響因素多的缺點(diǎn)，理化檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)程序復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高等缺點(diǎn)，為克服上述缺點(diǎn)，將二者結(jié)合已經(jīng)成為當(dāng)今發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。

表面等離子體共振（SPR）生物傳感器利用了免疫學(xué)的測(cè)定原理，可以進(jìn)行多個(gè)樣品的快速檢測(cè)。劉瑾等人[17]在競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的基礎(chǔ)上采用基于表面等離子體共振信號(hào)放大傳感器，對(duì)鏈霉素、卡那霉素的水溶液進(jìn)行了殘留檢測(cè)試驗(yàn)，最低檢測(cè)限分別由34 ng/mL和25 ng/mL降為24 ng/mL和12 ng/mL。結(jié)果表明，SPR生物傳感器在檢測(cè)牛奶抗生素殘留方面具有良好的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)芯片（Protein chip）技術(shù)是將已知的蛋白分子產(chǎn)物固定在經(jīng)特殊化學(xué)處理的固相載體上，根據(jù)生物分子特性，捕捉能與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白，經(jīng)洗滌、純化，再進(jìn)行確認(rèn)和生化分析。金娜等人以免疫競(jìng)爭(zhēng)為原理，優(yōu)化各項(xiàng)影響因素，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出呋喃唑酮代謝物（AOZ）的檢測(cè)限達(dá)到0.1 ng/mL。經(jīng)試驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可以有效進(jìn)行抗生素檢測(cè)分析，適于推廣應(yīng)用。

5 結(jié)語(yǔ)

從近15年來(lái)的檢測(cè)方法在牛奶抗生素殘留檢測(cè)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用狀況來(lái)看，微生物檢測(cè)法不需要大型儀器和專(zhuān)業(yè)操作人員，簡(jiǎn)便、快捷，適用于一般的乳制品廠(chǎng)、奶牛牧場(chǎng)、防疫站使用。免疫分析法雖然取樣量小，前處理簡(jiǎn)單、處理量大，但其影響因素較多，使大部分技術(shù)仍然停留在實(shí)驗(yàn)室水平。近年來(lái)，隨著試驗(yàn)儀器的微型化、便捷化，將生物傳感器與蛋白芯片技術(shù)相結(jié)合，逐步應(yīng)用到牛奶抗生素殘留的檢測(cè)中，或?qū)⑹俏磥?lái)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

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