劉 琪，陳 靜，張佩娜，朱蔚姍，蔣立文

（食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

蠟樣芽孢桿菌是一種能在極端的環(huán)境條件下生存的革蘭氏陽(yáng)性桿狀芽孢菌，大小為（1～1.3）×（3～5）μm，兼性需氧，芽孢不突出菌體，菌體兩端較平整，多數(shù)呈鏈狀排列，與炭疽桿菌相似[1]。它一般被認(rèn)為是污染物，當(dāng)數(shù)量達(dá)到一定級(jí)別也會(huì)引起重大疾病[2]。通常，當(dāng)其在食物中的含量超過(guò)1×105CFU/g·mL時(shí)就有可能造成食物中毒[3]。蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒大多因食用剩飯、剩菜、乳制品等富含碳水化合物的食品[4]。芽胞具有耐熱性，短暫的熱處理會(huì)誘發(fā)芽胞的萌發(fā)，大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素并引發(fā)食物中毒[5]。根據(jù)2008—2010年我國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告管理信息系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)細(xì)菌性食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒在發(fā)生起數(shù)和發(fā)病人數(shù)方面均居前3位[6]。周彥伶等人在研究一起蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒中發(fā)現(xiàn)致病食品中蠟樣芽孢桿菌的菌落總數(shù)大于1×106CFU/g。而蠟樣芽孢桿菌在發(fā)酵豆制品中的安全隱患也已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，其中尤以豆豉、腐乳[7]被研究較多。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

在超市中根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)和區(qū)域加工差異性進(jìn)行樣品的采集，以確保樣品的代表性。采集的樣品有3種類(lèi)型，即豆豉、豆醬和腐乳。

樣品信息見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；50%卵黃乳液，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供；多黏菌素B（MYP及胰酪胨大豆多黏菌素B肉湯配套試劑），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

蠟樣芽孢桿菌生化鑒定盒（葡萄糖（厭氧）、3%過(guò)氧化氫溶液、半固體瓊脂、硝酸鹽（還原）、溶菌酶營(yíng)養(yǎng)肉湯、質(zhì)控營(yíng)養(yǎng)肉湯、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP）、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶體染色液），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；LRH-250型智能生化培養(yǎng)箱，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F型凈化工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；ZWY-210型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品。

表1 樣品信息

表2 蠟樣芽孢桿菌鑒定說(shuō)明

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理方法

稱(chēng)取每種樣品各25 g，分別放入225 mL裝有適當(dāng)玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，然后放入搖床中振搖30 min，再進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)詈笕?～3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行接種培養(yǎng)。

1.2.2 蠟樣芽孢桿菌疑似菌的檢測(cè)

參照GB 4789.14—2014，每個(gè)稀釋度分別取0.3，0.3，0.4 mL接種到3個(gè)MYP瓊脂平板上，在30±1℃培養(yǎng)24～48 h，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。

1.2.3 蠟樣芽孢桿菌的生化鑒定

對(duì)挑選出的蠟樣芽孢桿菌典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，并參照表2進(jìn)行生化鑒定，再對(duì)照表3進(jìn)行判定。

蠟樣芽孢桿菌鑒定說(shuō)明見(jiàn)表2，蠟樣芽孢桿菌與其他類(lèi)似菌的鑒別見(jiàn)表3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 確認(rèn)并計(jì)數(shù)典型菌落

選擇培養(yǎng)出了蠟樣芽孢桿菌典型菌落（粉紅色，周?chē)蟹奂t色的暈）的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板的菌落總數(shù)之和在20～200 CFU，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。

1.3.2 計(jì)算公式

根據(jù)平板上不同的菌落數(shù)情況，選擇不同的計(jì)算公式。

表3 蠟樣芽孢桿菌與其他類(lèi)似菌的鑒別

式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；

A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落總數(shù)；

B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；

C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；

d——稀釋因子。

式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；

A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；

A3——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；

B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；

B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；

C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；

C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；

1.1 ——計(jì)算系數(shù)（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結(jié)果為0，計(jì)算系數(shù)采用1）；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢測(cè)與分析

樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢出情況見(jiàn)表4。

根據(jù)GB 4789.14—2014所確定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，以甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂為培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，對(duì)采自市場(chǎng)上的13個(gè)發(fā)酵豆制品進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如上表所示，不同種類(lèi)、不同地區(qū)、不同生產(chǎn)工藝的發(fā)酵豆制品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌普遍存在。幾類(lèi)發(fā)酵豆制品中均檢出了蠟樣芽孢桿菌，總檢出率為84.6%，其中腐乳和豆豉樣品全部檢出，而豆醬只有一個(gè)樣品檢出。發(fā)酵豆制品是我國(guó)傳統(tǒng)的釀造產(chǎn)品，因其原料不同、產(chǎn)地不同、氣候條件存在差異，且參與發(fā)酵的微生物區(qū)系種類(lèi)復(fù)雜等，產(chǎn)品的微生物控制難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。腐乳生產(chǎn)工藝沒(méi)有殺菌處理過(guò)程，故成品受蠟樣芽孢桿菌及其他雜菌污染的幾率較高。豆豉后期有炒制過(guò)程，但仍均檢出了蠟樣芽孢桿菌，可能是炒制溫度不夠或者炒制時(shí)間不夠。豆醬盡管產(chǎn)品的含水量較高但一般產(chǎn)品保質(zhì)期較長(zhǎng)（長(zhǎng)的有24個(gè)月），生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行了熬制和后期殺菌處理，微生物檢出率相對(duì)腐乳、豆豉要低，這種差異與產(chǎn)品加工工藝和產(chǎn)品品質(zhì)差異有關(guān)。

表4 樣品中蠟樣芽孢桿菌疑似菌檢出情況

2.2 蠟樣芽孢桿菌的鑒定與數(shù)量分析

樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)見(jiàn)表5。

表5 樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)

我國(guó)發(fā)酵豆制品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中并沒(méi)有明確規(guī)定蠟樣芽孢桿菌的殘留限量，但香港地區(qū)食品中蠟樣芽孢桿菌可接受臨界值為1×105CFU/g·mL，因此我國(guó)大多是以此臨界值為參考，當(dāng)攝入的食品中此菌含量大于1×105CFU/g·mL時(shí)，就可能引起食物中毒。試驗(yàn)腐乳樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)大于1×105CFU/g的概率為20%。蠟樣芽孢桿菌風(fēng)險(xiǎn)因子較高的為干型腐乳。從配料方面來(lái)看，干型腐乳中未加入白酒。腐乳生產(chǎn)工藝沒(méi)有殺菌過(guò)程，對(duì)微生物的抑制作用主要靠高鹽和高酒精作用，而干腐乳中沒(méi)有加白酒，故其對(duì)微生物的抑制作用相比其他類(lèi)型的腐乳來(lái)說(shuō)較弱，受雜菌污染的可能性更大。白方腐乳不加油，結(jié)果顯示蠟樣芽孢桿菌數(shù)較少，這與白方腐乳生產(chǎn)企業(yè)控制要求要高有關(guān)。而加入食用油的腐乳中此菌數(shù)量比白方腐乳多，但比干型腐乳少，這可能與加工中熱油較好地將產(chǎn)品空氣排除且工藝相對(duì)粗放有關(guān)。豆醬成品經(jīng)灌裝殺菌后蠟樣芽孢桿菌檢出率一般較低，但試驗(yàn)中樣品6檢出了此菌且含量大于可接受臨界值，可能是加工過(guò)程中殺菌不徹底或是在運(yùn)輸銷(xiāo)售過(guò)程中受到外界雜菌污染。所測(cè)豆豉樣品均經(jīng)高溫炒制，炒制過(guò)程能起到良好的殺菌作用。但豆豉樣品中所測(cè)出的蠟樣芽孢桿菌數(shù)仍有1×102～1×105CFU/g，數(shù)量較多，由此可見(jiàn)，豆豉制作中高溫炒制時(shí)間和溫度需要有保障。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌是條件致病菌，廣泛分布于自然界中，食品中蠟樣芽孢桿菌的來(lái)源主要是外界污染[8]。在本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，豆制品中普遍存在蠟樣芽孢桿菌，檢出率較高，其中豆豉、腐乳中蠟樣芽孢桿菌數(shù)大多偏高。與其他學(xué)者的研究結(jié)果比較相符。如周婷婷[9]在豆制品樣品中發(fā)現(xiàn)腐乳中蠟樣芽孢桿菌檢出率84.2%。不過(guò)已有研究表明蠟樣芽孢桿菌在加工過(guò)程中可通過(guò)加入輔料等方式對(duì)其進(jìn)行控制。如穆可云[10]發(fā)現(xiàn)大蒜提取物對(duì)腐乳中的蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，但這些控制措施并不完善。建議加強(qiáng)豆制品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)，并制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)際接軌，降低食物中毒風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉斌.食品微生物檢驗(yàn) [M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2016：271-275.

[2]S Tusgul，G Prod'hom，L Senn， et al.Bacillus cereus bacteraemia： comparison between haematologic and nonhaematologic patients[J].New Microbes and New Infections，2017，15 （3）：65-71.

[3]周婷婷，易敏英，相大鵬，等.白腐乳及其生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌的污染及防治 [J].中國(guó)釀造，2014，33（5）：77-80.

[4]謝來(lái)球，瞿麗開(kāi).136例蠟樣芽孢桿菌食物中毒案例分析[J].食品安全導(dǎo)刊，2017（6）：31-34.

[5]蔣榮榮，劉曉云，陳雅蘅，等.豆豉中蠟樣芽孢桿菌污染情況分析 [J].中國(guó)釀造，2013，32（3）：67-69.

[6]褚發(fā)軍，冉陸，馬莉，等.2008—2010年全國(guó)突發(fā)公共衛(wèi)生事件網(wǎng)絡(luò)報(bào)告食物中毒流行病學(xué)分析 [J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2012，24（4）：387-390.

[7]廖文生.腐乳生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制措施 [J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2015，25（5）：46-48.

[8]王為民，王燕萍.1起蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒調(diào)查報(bào)告 [J].中國(guó)校醫(yī)，2016，30（11）：832，834.

[9]周婷婷.蠟樣芽孢桿菌在腐乳中的污染狀況及其控制方法研究 [D].廣州：華南理工大學(xué)，2013.

[10]穆可云.大蒜提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制研究 [D].廣州：華南理工大學(xué)，2013.◇