李明生 ， 靳冬武 ， 張 健 ， 馮玉萍 ，鄭 榮 ， 張 磊 ， 李 倬 ， 馬忠仁 ，3

（1.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

從豬、?；蜓蛞扰K中提取的蛋白質(zhì)分解酶胰蛋白酶[1]是絲氨酸蛋白酶家族中特有的成員，屬于肽鏈內(nèi)切酶，特異性的水解堿性的精氨酸和賴氨酸羧基所組成的肽鍵[2]。廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、食品、洗滌劑、皮革、醫(yī)藥等領(lǐng)域中[3-4]，尤其是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中應(yīng)用極為廣泛[5-6]。目前國(guó)內(nèi)外幾乎所有科研與生產(chǎn)用戶細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶都依賴美國(guó)Gibco和Hyclone兩家公司，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)幾乎為空白。這是因?yàn)樵谝鹊鞍酌钢苽溥^程中酶原激活條件的重要性。這種酶在哺乳動(dòng)物的胰腺中以無活性的胰蛋白酶原的形式合成和儲(chǔ)存，同時(shí)也包含有另一種相似的結(jié)構(gòu)和功能特性的絲氨酸蛋白酶糜蛋白酶[7]，在酶原激活過程中，胰蛋白酶和糜蛋白酶在一定的條件下相互轉(zhuǎn)化。而在體內(nèi)胰蛋白酶原是由胰臟中胰腺細(xì)胞合成并分泌到十二指腸，并在腸激酶的催化下將胰蛋白酶原激活為有活性的胰蛋白酶[8-9]，激活的胰蛋白酶能夠催化許多胰腺來源的無活性的酶原，例如胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶原和羧肽酶，而蛋白酶活化受體直接或間接控制腸道消化效率[10]。因此，作者以豬胰臟為原料，酶活力為衡量指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶原體外激活條件進(jìn)行研究，采用離子交換層析對(duì)激活后的粗制胰蛋白酶進(jìn)行純化，得到細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶單品，最后探討該單品對(duì)BHK-21和Vero兩種貼壁依賴性細(xì)胞的消化效果，為細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶的進(jìn)一步研究和國(guó)產(chǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰臟：由青海省樂都縣屠宰場(chǎng)提供；細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶：購自美國(guó)Hyclone和Gibco公司；苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （BAEE）：購自Sigma公司；DEAE Sepharose FF：購自美國(guó)GE公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)染marker：購自Bio-Rad公司；BHK-21細(xì)胞和Vero細(xì)胞：由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供；DMEM培養(yǎng)基：購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；新生牛血清：購自蘭州民海生物工程有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OA2000型實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯定時(shí)攪拌器：上海毆河機(jī)械設(shè)備有限公司；SG2型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；DYY-12型電泳儀：北京市六一儀器廠；KjeltecTM 8200型凱氏定氮儀：丹麥Foss公司；LGJ--200F真空冷凍干燥機(jī)：北京松源興科技發(fā)展有限公司；Biomate 5型紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；超濾儀：PALL公司；AKTA Purifier快速純化液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)GE公司；CKX41型倒置生物顯微鏡：OLYMPUS。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝路線 新鮮胰臟預(yù)處理→提取→鹽析制備胰蛋白酶原→酶原的激活→超濾脫鹽→離子交換層析→冷凍干燥

1.3.2 單因素試驗(yàn) 根據(jù)工藝路線，取胰臟2 kg，加入3倍體積pH 3.0的純化水?dāng)嚢杼崛?4 h后，加入硫酸銨至0.75飽和度鹽析制備胰蛋白酶原。以激活激活劑濃度、激活時(shí)間、pH值、溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，做平行實(shí)驗(yàn)3次，確定影響胰蛋白酶活力的最佳單因素條件。

1）激活劑濃度對(duì)酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導(dǎo)劑，控制體系的激活時(shí)間1.5 h、pH 8.0、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度分別設(shè)置為 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L。

2）激活時(shí)間對(duì)酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導(dǎo)劑，控制體系的激活pH 8.0、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度0.2 mol/L。激活時(shí)間分別設(shè)置為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

3）激活pH對(duì)酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導(dǎo)劑，控制體系的激活時(shí)間1.5 h、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度0.2 mol/L，激活pH 值分別設(shè)置為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

4）激活溫度對(duì)酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導(dǎo)劑，控制體系的激活時(shí)間1.5 h、pH 8.0，激活劑氯化鈣的終濃度為0.2 mol/L，激活溫度分別設(shè)置為 4、8、12、16、20 ℃。

1.3.3 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 選擇激活劑的濃度、激活時(shí)間、pH值和溫度4個(gè)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)得出的結(jié)果，選擇合適的水平采用L9（34）正交試驗(yàn)確定胰酶提取的最佳工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)L9（34）因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)L9（34）因素水平Table 1 Factors and levels for L9（34） orthogonal test

1.3.4 胰蛋白酶的純化 采用AKTA層析進(jìn)行純化，具體洗脫條件為：DEAE Sepharose FF為介質(zhì)的層析柱；A 液：10 mmol/L pH 9.0的 Tris-HCl；B 液：10 mmol/L pH 9.0的 Tris-HCl和 0.2 mol/L NaCl組成；上樣液：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在20～30 mg/mL；流速：1 mL/min。

1.3.5 胰蛋白酶活力和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的檢測(cè)胰蛋白酶活力按照中華人民共和國(guó)藥典2010版二部胰蛋白酶效價(jià)測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)；蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度按照中華人民共和國(guó)藥典2010版二部附錄ⅦM第一法凱氏定氮法檢測(cè)[1]。

1.3.6 SDS-PAGE分析 采用SDS-PAGE對(duì)胰蛋白酶純化效果進(jìn)行鑒定，電泳條件：5 g/dL pH 6.8的濃縮膠，12 g/dL pH 8.8的分離膠；樣品中加入等量的 2×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性 5 min，15 μL 上樣。80 V電泳2 h后將膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3.7 胰蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用 將胰蛋白酶配制成0.25%活力為1∶250的胰蛋白酶液，選擇BHK-21和Vero兩種傳代細(xì)胞進(jìn)行消化試驗(yàn)，連續(xù)消化培養(yǎng)10代，記錄消化時(shí)間并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。同時(shí)用Gibco和Hyclone的胰蛋白酶作為對(duì)照組。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 每組實(shí)驗(yàn)平行3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最后結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 激活劑濃度對(duì)酶活力的影響 Ca2+是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵離子，諸如從胰腺腺泡細(xì)胞中酶原的分泌[11-12]。胰腺分泌的消化酶是由Ca2+濃度、神經(jīng)遞質(zhì)和激素對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的受體結(jié)合調(diào)控來實(shí)現(xiàn)[13]。作者以CaCl2為激活劑，對(duì)Ca2+的濃度進(jìn)行研究。由圖1可以看出，隨著激活劑濃度的提高，酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。在激活劑濃度為0.1～0.15 mol/L范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力急劇增加（p＜0.05），在激活劑濃度為 0.2 mol/L 時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為1 896.69±6.79，當(dāng)激活劑濃度提高至0.25 mol/L時(shí)，酶活力與最高值沒有明顯的差異（p＞0.05），隨后急劇下降（p＜0.05）。 因此，激活劑的濃度以0.2 mol/L為最佳。

圖1 激活劑濃度對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of activation concentration on trypsin activity

2.1.2 激活時(shí)間對(duì)酶活力的影響 選擇最佳激活時(shí)間，既能使胰蛋白酶充分激活，又能避免活化后的胰蛋白酶自身降解，是把握激活時(shí)間的關(guān)鍵[14]。作者對(duì)胰蛋白酶的激活時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著激活時(shí)間的增加，酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，不同時(shí)間的酶活力差異極其顯著（p＞0.01）。 在 0.5～1.5 h 范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力急劇增加（p＜0.01），在1.5 h時(shí)酶活力達(dá)到最高值，為2 522.77±219.55，隨后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力急劇下降（p＜0.01），說明激活時(shí)間對(duì)胰蛋白活力尤為重要。因此激活時(shí)間1.5 h為最佳。

圖2 激活時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of activation time on trypsin activity

2.1.3 激活pH對(duì)酶活力的 由圖3可以看出，隨著激活pH的增加酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。在7.0～8.0 h范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力差異明顯 （p＜0.01），在pH 8.0時(shí)酶活力達(dá)到最高值，為2 660.10±49.94。隨后隨著pH的變化，酶活力逐漸下降（p＞0.05），因此激活pH 8.0為最佳。Khandagale AS等[15]人從印度馬鮫魚中分離純化了胰蛋白酶，并對(duì)胰蛋白酶的特性進(jìn)行了研究。Senphan T等[16]人從太平洋白蝦的肝胰腺中分離純化了胰蛋白酶，Liu CH等[17]人從斜帶石斑魚中分離純化了胰蛋白酶。其激活的pH為均為8.0。這與本研究的激活pH相一致。

圖3 激活pH對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of activation pH on trypsin activity

2.1.4 激活溫度對(duì)酶活力的影響 由圖4可以看出，隨著激活溫度的增加，酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。不同溫度下酶活力差異極為顯著（p＜0.01）。在4～16℃范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力差異明顯 （p＜0.01），16℃時(shí)酶活力達(dá)到最高值，為 2 845.21±49.45，當(dāng)激活溫度提高至20℃時(shí)，酶活力明顯下降（p＜0.05），這可能是因?yàn)樵谝鹊鞍酌柑崛∫褐泻写罅康拿拥鞍酌福诩せ钸^程中胰蛋白酶與糜蛋白酶相互轉(zhuǎn)化，而激活溫度過高，胰蛋白酶急劇轉(zhuǎn)化為糜蛋白酶。因此，激活溫度以16℃為最佳。

圖4 激活溫度對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of activation temperature on trypsin activity

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定影響酶活力的4個(gè)因素（激活劑濃度、激活時(shí)間、pH值、溫度）的主要水平。通過L9（34）正交試驗(yàn)確定胰蛋白酶原激活的最佳條件，其結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2的K值可得胰蛋白酶激活的最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即激活劑的濃度為0.2 mol/L，激活時(shí)間為1.5 h，激活pH為8.5，激活溫度為16℃，在此條件下通過驗(yàn)證可得酶活力達(dá)到2 953.68 U/mg，優(yōu)于表2中實(shí)驗(yàn)號(hào)為2的結(jié)果（2 892.84 U/mg），因此確定最優(yōu)激活組合為A2B2C3D2。由極差R可以看出，影響胰蛋白酶活力的四因素的主次順序?yàn)镈（激活溫度）＞B （激活時(shí)間）＞C （激活 pH）＞A （激活劑濃度）。

2.3 胰蛋白酶的純化

激活后粗品胰蛋白酶液經(jīng)超濾濃縮至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在20～30 mg/mL范圍內(nèi)，電導(dǎo)500 us/cm以下，調(diào)pH至9.0后采用0.45 μm膜過濾后直接上樣于已平衡好的DEAE Sepharose FF層析柱，然后采用100%10 mmol/L pH 9.0的Tris-HCl洗脫并收集洗脫峰，超濾濃縮后凍干，純化過程的參數(shù)詳見表3?？梢钥闯?，在提取過程中胰蛋白酶經(jīng)純化后其總蛋白質(zhì)質(zhì)量為137.4 g，回收率為36.52%；酶活力為3 980 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到2.26。

表3 胰蛋白酶分離純化過程參數(shù)Table 3 Summary of purification process for trypsin

李明生等[6]采用了CM-Sepharose-FF層析純化了胰蛋白酶，我們采用DEAE Sepharose FF層析純化進(jìn)行分離。從圖5可以看出，圖中總共有4條峰。經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)，圖中泳帶M為Marker，0為激活后未純化的粗品胰蛋白酶，1為層析圖譜中的Peak 1，H為Hyclone的胰蛋白酶，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)峰1為胰蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)量在23 000左右，其純度高于Hyclone胰蛋白酶。峰2、3為其他雜蛋白質(zhì)，峰4為經(jīng)100%B液洗脫后所得峰，經(jīng)酶活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該酶為糜蛋白酶（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖5 胰蛋白酶離子交換層析圖譜和電泳圖譜Fig.5 Elution curve of ion exchange chromatography and electrophoretic pattern on trypsin

2.4 胰蛋白酶在BHK-21和Vero細(xì)胞中的應(yīng)用

采用已純化的自制胰蛋白酶消化BHK-21和Vero兩種貼壁細(xì)胞，同時(shí)以Hyclone和Gibco兩種胰蛋白酶為對(duì)照。連續(xù)消化傳代細(xì)胞10代次，從圖6可以看出，BHK-21和Vero細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，自制胰蛋白酶與Hyclone和Gibco胰蛋白酶沒有明顯的差異。

圖6 BHK-21和Vero細(xì)胞形態(tài)圖Fig.6 BHK-21 and Vero cells morphology

BHK-21和Vero細(xì)胞按1.5×106/瓶濃度接種，每代細(xì)胞采用自制胰蛋白酶消化傳代，并記錄消化時(shí)間和細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)以Hyclone和Gibco兩種胰蛋白酶為對(duì)照，連續(xù)消化傳代10代，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，用自制、Hyclone和Gibco胰蛋白酶消化BHK-21細(xì)胞，消化時(shí)間分別為3.257、3.076、3.197 min，差異不顯著（p＞0.05），細(xì)胞濃度分別達(dá)到7.61×106、7.66×106、7.49×106個(gè)/瓶，差異不顯著（p＞0.05）；用自制、Hyclone和Gibco胰蛋白酶消化Vero細(xì)胞，消化時(shí)間分別為 3.397、3.261、3.291 min，差異不顯著（p＞0.05），細(xì)胞濃度分別達(dá)到 6.72×106、6.65×106、7.11×106個(gè)/瓶，差異不顯著（p＞0.05）。 說明自制胰蛋白酶對(duì)BHK-21和Vero細(xì)胞沒有顯著的影響。

圖7 BHK-21和Vero細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)密度和消化時(shí)間Fig.7 Cell proliferation concentration and digestion time for BHK-21 and Vero cells

3 結(jié)語

胰蛋白酶原的最佳激活條件為激活劑的濃度0.2 mol/L，pH 8.5，溫度 16 ℃，激活時(shí)間 1.5 h，在該條件下激活后胰蛋白酶的活力達(dá)到2 954 U/mg。激活后粗胰蛋白酶經(jīng)DEAE Sepharose FF純化后其酶活力為3 980 U/mg，酶活力的純化倍數(shù)達(dá)到2.26。

自制胰蛋白酶對(duì)BHK-21和Vero兩種細(xì)胞沒有明顯的影響，其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)濃度和消化時(shí)間與Hyclone和Gibco胰蛋白酶沒有明顯的差異，這為細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶的進(jìn)一步研究和國(guó)產(chǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。

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