陳兆輝+李媛媛+韓娟+王赟+任彥鵬+陳桐 唐旭+倪良

摘要設計合成了一種基于香豆素衍生物的水溶性熒光探針7二乙氨基3甲醛香豆素，并通過1NMR，13CNMR和MS確認其結(jié)構(gòu)。探針具有良好的熒光發(fā)射性能，熒光最大發(fā)射峰位于71 nm； 向其中加入e3+后，熒光強度隨著e3+濃度的增加而逐漸減弱。探針L的熒光發(fā)射強度與e3+的濃度在002～6000 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，可對e3+進行定性與定量檢測，檢出限為22 nmol/L （S/N=3），對e3+的選擇性良好，不受其它常見金屬離子的干擾。此外，探針對e3+的檢測具有可逆性。本探針具有很好的水溶性，在生理p環(huán)境中檢測效果較好成功用于人體淋巴腫瘤細胞Ramos中e3+熒光成像。

關鍵詞熒光探針； 鐵離子； 水溶性； 細胞成像

[K][Q（32，X，DY-W][CD15]

20170226收稿； 20171123接受

本文系國家自然科學基金項目（No 2157612）、江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（No 2016K51）和鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃——社會發(fā)展項目（Nos S201501，S2016019）資助

Email： luckwanting@163com； hanjuan@ujseducn

1引 言

在各種微量元素中，鐵元素是人體生理活動中不可或缺的元素，參與DNA和RNA的合成以及維持細胞內(nèi)滲透壓和酸堿平衡等過程[1～]。生物機體內(nèi)e3+缺失會引發(fā)多種生理活動紊亂，導致各種疾病的發(fā)生[5]。研究表明，多種疾病，如心臟病、糖尿病甚至某些腫瘤， 與生物體內(nèi)攝入過量的鐵有關[6]。因此，建立高選擇性和高靈敏度的鐵離子檢測方法有重要的理論和實際應用意義。

目前，e3+的檢測方法主要有原子吸收分光光度法（AAS）[7]、紫外分光光度法[8]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICPAES）[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）[10]、電化學分析法[11]和熒光滴定法等[12]。熒光滴定法因具有選擇性高、靈敏、成本低和易于操作等優(yōu)點而備受關注[13～15]。但目前用于檢測e3+的熒光探針分析方法較少，常見的熒光基團包括卟啉熒光素[16]、羅丹明[17]、香豆素[18]、萘酰亞胺類[19]等，其中香豆素基團憑借其獨有的苯并芘喃酮結(jié)構(gòu)，具有熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大等特性，是一種理想的熒光配體。Li等[20]基于香豆素基團合成了用于2O （1∶1， V/V）環(huán)境中識別檢測e3+的熒光探針，隨著e3+的加入，探針的熒光強度逐漸增強。Wang等[21]基于香豆素基團合成了一種熒光探針用于乙醇水（95：5， V/V）體系中e3+的識別檢測，熒光強度與e3+濃度（33～167 μmol/L）呈線性相關，檢出限為033 μmol/L。該測試液主要為乙醇，探針的水溶性較差，且在進行細胞實驗時高濃度的乙醇會對細胞產(chǎn)生毒性，此外靈敏度也較低。En等[22]基于香豆素基團合成了一種熒光探針，用于e3+的識別檢測，線性范圍為10～1000 μmol/L，檢出限為03 μmol/L，該探針的檢測靈敏度還有待提高，且在生理p下其熒光效果較差，不利于其在生物方面的應用。

本研究合成了基于香豆素染料的熒光探針L， 此探針具有良好的熒光發(fā)射性能， 且e3+的加入會導致探針熒光淬滅?；诖?， 此探針可用于e3+的靈敏檢測，選擇性良好。此探針具有良好的水溶性，用于人淋巴腫瘤細胞Ramos中e3+的檢測，結(jié)果令人滿意。

2實驗部分

21儀器和試劑

hermo LXQ液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國hermo公司）； AVANCE Ⅱ00 Mz核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司）； Cary Eclipse熒光分光光度計（澳大利亞瓦里安有限公司）； UV250紫外可見分光光度計（日本島津公司）； DM2500倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

（二乙氨基）水楊醛、丙二酸二乙酯、N，N二甲基甲酰胺（DM）、冰醋酸（美國Aldrich公司）； 人體淋巴腫瘤細胞Ramos由江蘇大學食品與生物工程學院提供； 其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）； 實驗用水為二次蒸餾水。

22合成方法

探針的合成方法如圖1所示。

2217二乙氨基香豆素（1）的合成參照文獻[22]方法進行合成。將193 g（10 mmol）（二乙氨基）水楊醛、32 g丙二酸二乙酯（20 mmol）、1 mL哌啶加入30 mL乙醇中，回流攪拌6 h； 減壓蒸餾除去乙醇。向混合物中加入20 mL冰醋酸和20 mL濃鹽酸，75℃回流攪拌6 h。反應完成后，混合溶液冷卻至室溫，再加入100 mL冰水。隨后逐滴加入0%NaO溶液調(diào)節(jié)至p 5，產(chǎn)生大量的白色沉淀，用玻璃棒不斷攪拌直至不再有新的沉淀生成。抽濾，蒸餾水洗滌后干燥，然后用甲苯重結(jié)晶，得到化合物1（17 g，8 mmol），收率為801%。

2227二乙氨基3甲醛香豆素（L）的合成在氮氣保護下，向新蒸餾的DM（2 mL）中滴加POCl3（2 mL），在20～50℃下攪拌30 min，得到紅色溶液。將化合物1（150 g，691 mmol，溶解在10 mL DM中）逐滴加入到上述溶液中，得到紅色懸浮液，60℃下攪拌12 h，然后冷卻至室溫，加入100 mL冰水中。然后加入20% NaO溶液，獲得大量沉淀。粗產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇過濾、水洗、干燥和重結(jié)晶，得到化合物L （120 g，89 mmol），收率為708%。1 NMR （00 Mz， CDCl3） δ=1235 （s， 1）， 862 （s， 1）， 7 （d， = 90， 1）， 669 （d， = 22， 1）， 651 （s， 1）， 39 （q， =70， ）， 126 （t， =71， 6） 13C NMR （101 Mz， CDCl3） δ （ppm）： 16555， 166， 1580， 15380， 15023， 13196， 11096， 10853， 1056， 9681， 7738， 7706， 767， 536， 1239。質(zhì)譜檢測ESIMS m/z （[M+]+）： Calcd 262； found： 261。endprint

23紫外吸收及熒光滴定儲備液的制備

采用各金屬離子的高氯酸配制15種金屬離子（Pb2+、Ni2+、Mg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、e2+、n2+、K+、Li+、Na+、Al3+、e3+、Cr3+） 儲備液（10 mmol/L），光譜測量前用二次蒸餾水稀釋至10 μmol/L。在本研究所有熒光滴定實驗中，激發(fā)波長均為00 nm，發(fā)射區(qū)間為05～600 nm。

2細胞實驗

將培養(yǎng)在DMEM（含5%胎牛血清）中的人體淋巴腫瘤細胞Ramos按照15×10個/孔的密度接種到6孔板中， 37℃，5%CO2和95%空氣環(huán)境中孵育過夜。將探針L（10 μmol/L）加入到細胞孔板中，孵育05 h，移去培養(yǎng)液并用EPES緩沖液洗滌3次，以除去未進入細胞中的探針。隨后向各孔中分別加入含e3+（0、 50和100 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育2 h后，移去培養(yǎng)液，用EPES緩沖液洗滌3次。最后加入05 mL培養(yǎng)液，通過萊卡DM2500倒置熒光顯微鏡進行成像和拍照。

3結(jié)果與討論

31探針檢測條件的優(yōu)化

首先對檢測條件進行了優(yōu)化，考察了不同溶劑（四氫呋喃、水溶液和乙醇）和p值條件下，探針對金屬離子的選擇性識別能力。熒光光譜顯示，用檸檬酸NaOCl 緩沖液調(diào)節(jié)部分測試液至p 20～65，用EPES調(diào)節(jié)部分測試液至p 65～90，考察了體系p值對Le3+熒光強度的影響。如圖2所示，當體系p=20～90時，加入e3+前后體系熒光強度幾乎不變，而未加入e3+的探針L其熒光強度在p=0～50時急劇增加，在p>7時熒光強度開始減小，因此探針檢測e3+最適宜的p范圍為5～7。

32探針L對e3+的選擇識別能力

探針L（10 μmol/L）分別與100 μmol/L 的Pb2+、Ni2+、Mg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、e2+、n2+、K+、Li+、Na+、Al3+、e3+和Cr3+混合后，得到相應的紫外可見吸收光譜圖（圖3）和熒光光譜圖（圖）。由圖3A可知，在200～350 nm波長范圍內(nèi)，加入e3+后，探針水溶液中吸光度明顯增大，而其它金屬離子除了Cu2+和Cr3+造成一定程度的紅移外，均對探針溶液的吸光度影響不大（圖3B）。不同金屬離子對探針L的熒光光譜影響如圖所示，探針L熒光發(fā)射峰位于71 nm處。當加入e3+后，會導致其熒光猝滅（圖A），而加入其它金屬離子對探針L的熒光強度影響不大（圖B）。上述結(jié)果說明，探針L對e3+具有良好的選擇性。

圖e3+（100 μmol/L）（A）及其它金屬離子（100 μmol/L）Pb2+、 Ni2+、 Mg2+、 Cd2+、 Co2+、 Cu2+、 Mn2+、 e2+、 n2+、 K+、 Li+、 Na+、 Al3+、 Cr3+的加入（B）對探針L（10 μmol/L）熒光強度的影響

igluorescence spectra of probe L （10 μmol/L） in the presence of e3+ （100 μmol/L） （A） and other metal ions （100 μmol/L） Pb2+， Ni2+， Mg2+， Cd2+， Co2+， Cu2+， Mn2+， e2+， n2+， K+， Li+， Na+， Al3+， Cr3+ （b） in aqueous system

33e3+濃度對探針L的熒光強度影響

圖5為加入不同濃度e3+后，探針L的熒光強度的變化。隨著e3+濃度增大， 71 nm處熒光強度降低。由圖6可知，e3+濃度為002～60 μmol/L時，探針L的熒光發(fā)射強度與e3+濃度呈良好的線性關系， I=32256-86Ce3+，R2=09963， 檢出限為22 nmol/L（3σblank/k[23]）。將此探針L與其它檢測e3+探針比較（表1），本研究合成的探針L具有檢出限低，靈敏度高等特點。

探針與e3+結(jié)合的ob曲線如圖7所示，當探針的含量達到50%時， 27 nm處的熒光強度達到最大，表明探針與e3+的結(jié)合比為1∶1。

依據(jù)化學計量比為1∶1型主客體配合物，參考文獻[2]計算可得探針L與e3+形成的配合物的結(jié)合常數(shù)K為1276×103 L/mol。由圖8可知，1/（0-）與1/[e3+]呈線性關系（R2=0999），進一步證明了探針L與e3+形成1∶1型配合物。由于探針L只有醛基中的氧和酮基中的氧可形成兩個化合物配位鍵，因此，推測其可能的結(jié)合方式如圖9所示， e3+參與了電子/能量轉(zhuǎn)移過程，使香豆素有機熒光團產(chǎn)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移過程，導致熒光猝滅[25]。

35探針與e3+結(jié)合的可逆性研究

Le3+與2PO

Symbolm@@ 進行熒光滴定實驗。當10 倍濃度（eq） e3+加到探針L中，發(fā)生熒光猝滅。隨后，將30倍濃度2POSymbolm@@ （300 μmol/L）時體系的熒光強度。

ig10（a） luorescence titration spectra of Le3+ （10 μmol/L） upon the addition of 30 equiv of 2PSymbolm@@ （b） luorescence intensity of L （10 μmol/L） and system upon the alternative addition of e3+ （100 μmol/L） and 2PO

Symbolm@@ （300 μmol/L）

顯降低（圖10B），表明探針L與e3+是可逆結(jié)合，可望重復使用。

36細胞成像實驗

將探針L用于Ramos細胞成像實驗，結(jié)果如圖11所示，僅用探針培養(yǎng)的細胞熒光較強（圖11B），而繼續(xù)加入e3+的細胞顯示出明顯的熒光猝滅（圖11C）。此外，用100 μmol/L e3+處理過的細胞顯示出比用50 μmol/L e3+處理過的細胞更強的猝滅效應（圖11D）。endprint

此外，用細胞計數(shù)試劑盒8（CCK8）實驗測定不同濃度的探針添加到細胞培養(yǎng)液2 h后的細胞活力。由圖12可知，以未經(jīng)過探針處理的細胞的存活率為100%，當探針濃度達到10 μmol/L時，細胞的存活率在98%以上，表明探針L具有高度的生物相容性。

結(jié) 論

本研究合成了一種水溶性良好的香豆素類熒光探針，并將其用于e3+的定性與定量檢測。此探針本身發(fā)射藍色熒光，e3+對探針的熒光有猝滅作用，加入e3+后探針的熒光隨著e3+的濃度增加而減弱。在e3+濃度為002～60 μmol/L時，探針L的熒光發(fā)射強度與e3+的濃度呈良好的線性關系，檢出限為22 nmol/L，探針對e3+的選擇性良好，且二者的結(jié)合具有良好的可逆性。將探針用于人體淋巴腫瘤細胞Ramos中e3+的成像，具有良好的生物相容性。

References

1LIU ing， LI DongWei， WU XiaoQiang， IANG ei Chinese ournal of Luminescence， 2017， 38（2）： 226-231

劉 靜， 李東偉， 武小強， 江 飛 發(fā)光學報， 2017， 38（2）： 226-231

2Duan ， hang C， Qiao Y， Liu ， Wang D， Wu M， Wang K， Lv X X， Kong M M， Wang alanta， 2017， 170： 306-313

3Dujols V， ord ， Czarnik A W Am Chem Soc， 1997， 119（31）： 7386-7387

Li C Y， Kong X ， Li Y ， ou C X， Liu D， hu W G Dyes Pigments， 2013， 99（3）： 903-907

5Kim N， Lee M ， Kim ， Kim S， Yoon Chem Soc Rev， 2008， 37（8）： 165-172

6Meng Q， Shi Y， Wang C， ia ， Gao X， hang R， Wang Y， hang Org Biomol Chem， 2015， 13（10）： 2918-2926

7Nishiyabu R， Kubo Y， ames D， ossey S Chem Commun， 2011， 7（）： 1106-1123

8Wang X， Guo ， hu S， ian ， hu W Chem Commun， 201， 50（88）： 13525-13528

9Li K， Xiang Y， Wang X， Li ， u R， ong A， ang B Am Chem Soc， 201， 136（）： 163-169

10an L， Qin C， Li R， Wang B D， Yang YSens Actuator B， 201， 203： 550-556

11Yang Y K， Yook K ， ae Am Chem Soc， 2005， 127（8）： 16760-16761

12an ， An B D， Wang Y， Bao X， Ni L， Li C， Wang L， Xie X Q Sens Actuators B， 2017， 250： 36-5

13Ko S K， Yang Y K， ae ， Shin I Am Chem Soc， 2006， 128（3）： 1150-1155

1ammud ， ElDakdouki M ， Sonji N， Sonji G， Bouhadir K Curr Anal Chem， 2015， 11（）： 279-290

15Xu X Y， Yan B ACS Appl Mater Interfaces， 201， 7（1）： 721-729

16Xu ， u C， Cao C S， hao B Inorg Chem， 2015， 5（10）： 585-587

17Singh G， Singh ， Singh ， Mangat S S Lumin， 2015， 165： 123-129

18Saleem M， Kang S K， Lee K Lumin， 2015， 162： 1-2

19Mukhopadhyay S， Gupta R K， Biswas A， Kumar A， Dubey M， undal M S， Pandey D S Dalton ， 2015， （16）： 7118-7122

20Li ， hou Y， Yin K， Yu hu， Li Y， Ren Dyes Pigments， 201， 105： 7-11

21Wang R， Wan Q， eng ， Bai Y Chem Res Chinese U， 201， 30（）： 560-565

22En D， Guo Y， Chen B ， Dong B， Peng M RSC adv， 201， （1）： 28-253

23Li S， Li Y， Cao ， hu ， an L， Li XAnal Chem， 201， 86（20）： 10201-10207

2Roy N， Nath S， Dutta A， Mondal P， Paul P C， Singh S RSC Adv， 2016， 6（68）： 63837-6387

25hao B， Liu ， ang Y， Wang L， Song B， Deng Q etrahedron Lett， 2016， 57（39）： 17-23

AbstractA watersoluble fluorescent probe （7diethyl amino3formaldehyde coumarin） for e3+ detection was designed and synthesized， and its structure was confirmed by 1NMR， 13CNMR and MS spectra his probe showed high emission intensity at 71 nm With the continuous addition of e3+， the emission intensities at 71 nm decreased gradually， and showed an excellent linearity with e3+ in the range of 002-60 μmol/L， and the regression equation was I=32256-86Ce3+ his probe was able to detect e3+ qualitatively and quantitatively with the detection limit as low as 22 nmol/L Besides， this probe showed high sensitivity to e3+ over other metal ions he detection process was reversible， which could be recycled for the e3+ detection In terms of good optical properties and the strong fluorescence in physiological p， the probe was successfully applied in imaging e3+ of living Ramos cells

Keywordsluorescent probe； erric ion； Water solubility； Cell imagingendprint