廖 莎，李國玲，吳珍芳，李紫聰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

自1982年美國華盛頓大學(xué)Palmiter等［1］將大鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙锏玫奖日ｓw格大一倍的“超級老鼠”，以及在1983年研究出第一例轉(zhuǎn)基因作物煙草［2］以來，越來越多的科研人員開始進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的相關(guān)研究工作。經(jīng)歷30多年的發(fā)展，隨著克隆技術(shù)和基因編輯技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物的研究變得更為廣泛，“轉(zhuǎn)基因”一度成為研究熱詞。轉(zhuǎn)基因動植物的應(yīng)用主要包括品種改良、提高抗病能力、動物疾病模型、醫(yī)院器官移植、作為生物反應(yīng)器等。隨著醫(yī)療科技的發(fā)展，人們對重組蛋白藥物的接受度增高，同時(shí)人們對這類藥用蛋白的需求量也持續(xù)增加，傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的方法已經(jīng)不能滿足人們的需求量，必須尋求更高效的生產(chǎn)藥用蛋白的方法，而轉(zhuǎn)基因動植物的出現(xiàn)為此提供了一個(gè)契機(jī)?？茖W(xué)家提出利用轉(zhuǎn)基因動植物的某些器官組織來表達(dá)外源目的蛋白，通過構(gòu)建合適的載體，選擇適當(dāng)?shù)膯幼雍驼{(diào)控序列可產(chǎn)生高于正常表達(dá)水平的重組蛋白，并能在活體動植物上持續(xù)不斷地收集純化出來，從而獲得大量目的蛋白。相較傳統(tǒng)生物反應(yīng)器（微生物和細(xì)胞系統(tǒng)），利用轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白具有更廣闊的商業(yè)前景，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因動植物表達(dá)的外源蛋白活性高、質(zhì)量好，產(chǎn)量高、易提純，且這些轉(zhuǎn)基因動植物可以不斷擴(kuò)繁，源源不斷生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白；其次，轉(zhuǎn)基因動物的制備成本相對較低，而生產(chǎn)的藥用蛋白大多都很昂貴且需求量大，因此經(jīng)濟(jì)效益高，投資風(fēng)險(xiǎn)小。

至今，轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器研究已經(jīng)取得多項(xiàng)成果與突破，種類包括乳腺生物反應(yīng)器（Mammary gland bioreactor）在內(nèi)的7種動物生物反應(yīng)器以及20多種植物生物反應(yīng)器，從中獲得的藥用蛋白包括人乳鐵蛋白（Human lactoferrin，hLF）［3］、 人 血 紅 蛋 白（Human hemoglobin，hHb）［4］、凝乳酶［5］、溶菌酶［6］、人生長激素［7-8］、人表皮生長因子［9］、人凝血因子［10］、抗胰蛋白酶［11-12］、單克隆抗體［13-14］、作為疫苗的抗原蛋白等上百種人用或獸用蛋白。根據(jù)所需目的外源蛋白質(zhì)不同的特點(diǎn)，科學(xué)家們選擇了不同的生物反應(yīng)器［15］，從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織或器官要便于產(chǎn)物的獲得與應(yīng)用。目前，該領(lǐng)域的很多研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，部分產(chǎn)品已獲批應(yīng)用。

本文對轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器的研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，討論不同類型生物反應(yīng)器具有的優(yōu)勢及存在的問題，以期為動物和植物生物反應(yīng)器的深入研究提供參考。

1 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的研究及應(yīng)用

1.1 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器類型

1.1.1 乳腺生物反應(yīng)器 哺乳動物乳腺生物反應(yīng)器是目前應(yīng)用最廣泛、研究最深入，且生產(chǎn)外源蛋白最多的，也是目前國際上最早證明可以達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的動物生物反應(yīng)器。乳腺生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因動物的乳腺表達(dá)基因工程藥用蛋白。其原理是將外源蛋白基因連接到乳蛋白基因的調(diào)節(jié)元件下游，利用乳腺蛋白基因啟動子，使外源蛋白基因能夠在動物乳腺中特異性過表達(dá)，并分泌到乳汁中。早期，Gordon等［16］成功培育出在乳汁中表達(dá)具有天然活性的組織型纖溶酶原激活劑（Tissue-type plasminogen activator，tPA）的轉(zhuǎn)基因小鼠。但小鼠乳汁量少，主要作為模式動物進(jìn)行研究，要進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還得開發(fā)大型動物。至今，已有多種動物的乳腺生物反應(yīng)器取得了巨大突破，包括兔、羊、牛、豬等，其表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)量可觀。如1991年Wright等［11］利用轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)藥用蛋白——人抗胰蛋白酶，在綿羊乳汁中該酶表達(dá)量可高達(dá)35 g/L。而Echelard等［17］建立了表達(dá)人血清白蛋白的乳腺轉(zhuǎn)基因牛群，其在乳汁中的表達(dá)量高達(dá)40 g/L，在表達(dá)量和表達(dá)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)新突破。2015年Cui等［3］在轉(zhuǎn)基因豬乳中成功表達(dá)了人乳鐵蛋白（hLF）和人溶菌酶（ Human lysozyme，hLZ），表達(dá)量分別為6.502 g/L和1.102 mg/L，兩者可協(xié)同抗菌，在生產(chǎn)中可用于替代抗生素的作用。最近Chevreux等［18］在轉(zhuǎn)基因兔的乳汁中表達(dá)了一種新的重組人旁路因子VIIa （FVIIa）——LR769，可有效治療血友病。

相較于傳統(tǒng)生物反應(yīng)器（微生物和細(xì)胞），乳腺生物反應(yīng)器具有明顯優(yōu)勢：一是其合成蛋白的能力強(qiáng)，生產(chǎn)的許多人類蛋白活性高且穩(wěn)定；二是目的蛋白產(chǎn)量高而生產(chǎn)成本低，且易于收集，而微生物和細(xì)胞培養(yǎng)對條件要求高，需要大量昂貴的培養(yǎng)基持續(xù)供應(yīng)，產(chǎn)物收集比較麻煩；三是對轉(zhuǎn)基因動物自身傷害小，因乳腺分泌的特點(diǎn)，其分泌的產(chǎn)物不會進(jìn)入轉(zhuǎn)基因動物自身循環(huán)中，對其自身基本沒有影響；四是外源目的基因可以遺傳給下一代，獲得高水平表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因動物后，可通過人工授精、胚胎分割或體細(xì)胞克隆等方法對該轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行擴(kuò)繁，進(jìn)而持續(xù)從這些陽性轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲得目的蛋白，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，獲得巨大經(jīng)濟(jì)利潤。當(dāng)然，乳腺生物反應(yīng)器也存在局限，如只有轉(zhuǎn)基因雌性動物在泌乳期才能收集目的蛋白，具有周期性；某些珍貴藥用蛋白仍無法表達(dá)；乳蛋白總量高、種類多，對純化目的蛋白存在一定干擾等。因此，乳腺生物反應(yīng)器在向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的過程中也催發(fā)了其他生物反應(yīng)器的研究進(jìn)程。

1.1.2 血液生物反應(yīng)器 外源基因在血液中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物被稱為血液生物反應(yīng)器。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來，血細(xì)胞組分可通過裂解細(xì)胞獲得。由于血液循環(huán)系統(tǒng)與動物的生理活動密切相關(guān)，對于某些蛋白因子存在一定的生產(chǎn)限制，利用血液生物反應(yīng)器只能生產(chǎn)一些對轉(zhuǎn)基因動物健康影響不大的蛋白因子等。例如，Swanson等［4］利用轉(zhuǎn)基因豬血液系統(tǒng)成功表達(dá)了人血紅蛋白；李維納等［19］利用原核顯微注射法建立了血液中表達(dá)人α干擾素的轉(zhuǎn)基因老鼠；Massoud等［12］則利用轉(zhuǎn)基因兔血液獲得了重組人抗胰蛋白酶。這類蛋白因子都是血液中本身存在的，對轉(zhuǎn)基因動物的健康不會產(chǎn)生很大影響，有利于對目的蛋白的持續(xù)收集。其中大家畜的血液容量較大，更有利于生產(chǎn)。在血液中表達(dá)外源蛋白因子可能存在分離純化困難的問題，可通過敲除內(nèi)源基因等方式排除高同源性內(nèi)源蛋白的干擾，使轉(zhuǎn)基因動物將外源基因遺傳下去，擴(kuò)大群體，將有利于向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1.1.3 膀胱生物反應(yīng)器 外源基因在膀胱中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物被稱為膀胱生物反應(yīng)器，通過收集轉(zhuǎn)基因動物的尿液來獲得目的蛋白。膀胱生物反應(yīng)器的研究目前相對較少，但其作為生物反應(yīng)器所具有的優(yōu)勢不可忽略：一是尿液產(chǎn)量大、收集方便且不會傷害到轉(zhuǎn)基因動物；二是膀胱生物反應(yīng)器無周期和性別的限制，在任何時(shí)期，雌雄動物均可通過尿液收集目的蛋白；三是外源基因的表達(dá)產(chǎn)物基本不會進(jìn)入血液循環(huán)，對轉(zhuǎn)基因動物自身影響小；四是從尿中提取蛋白更容易，因?yàn)槟蛞褐泻械牡鞍追N類及其他雜質(zhì)相對較少易于純化。已有報(bào)道利用小鼠膀胱表達(dá)人生長因子，結(jié)果顯示該基因在膀胱中的表達(dá)表現(xiàn)出很高的專一性［20］，證明了膀胱作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白具有可行性。Zbikowska等［21］利用尿調(diào)節(jié)蛋白啟動子指導(dǎo)人重組促紅細(xì)胞生成素在轉(zhuǎn)基因鼠尿中表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到6 mg/L。然而遺憾的是，能確定在膀胱中特異表達(dá)的藥用蛋白種類并不多，還需要研究者們進(jìn)一步探究。

1.1.4 唾液腺生物反應(yīng)器 唾液腺生物反應(yīng)器是外源基因在唾液腺中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物，通過收集轉(zhuǎn)基因動物唾液獲得目的蛋白。同膀胱生物反應(yīng)器類似，唾液腺作為生物反應(yīng)器的報(bào)道相對較少，但是其具有沒有性別及生長周期的限制、易于收集純化等優(yōu)點(diǎn)，因此也是生產(chǎn)外源蛋白較好的生物反應(yīng)器。唾液腺可以特異性表達(dá)某些重要外源蛋白因子及酶類，如神經(jīng)生長因子、植酸酶等。1992年Mikkelsen等［10］利用小鼠PSP（Parotid secretory protein ）基因啟動子成功在轉(zhuǎn)基因小鼠唾液中特異性表達(dá)人凝血因子Ⅶ。最近曾芳等［22］已經(jīng)成功從轉(zhuǎn)基因小鼠的唾液中制備獲得人源神經(jīng)生長因子并證明了其生物活性。之前Golovan等［23］曾利用豬唾液腺成功表達(dá)了植酸酶，使飼料中磷的利用率得到提高，同時(shí)降低了豬糞便中的磷含量，減少了對環(huán)境的污染，該研究也表明可以用豬唾液腺獲取高產(chǎn)量藥用蛋白。前期研究的成功也為后續(xù)研究的可行性提供了有利證明。

1.1.5 家禽輸卵管生物反應(yīng)器 家禽輸卵管生物反應(yīng)器主要是讓目的蛋白在輸卵管中特異表達(dá)，并能在禽蛋中收集。家禽輸卵管能為一些外源蛋白提供正確的翻譯后修飾，且禽蛋產(chǎn)量高、周期短，蛋清成分也相對簡單，易于純化分離外源目的蛋白。目前主要研究的是雞輸卵管生物反應(yīng)器。外源基因表達(dá)產(chǎn)物在輸卵管特異表達(dá)后轉(zhuǎn)入蛋中，不會進(jìn)入到轉(zhuǎn)基因雞的循環(huán)系統(tǒng)中；還可通過制備SPF（Special pathogen free）雞來避免人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)，是比較理想的生物反應(yīng)器，具有巨大潛在商業(yè)價(jià)值。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的Cao等［6］構(gòu)建了慢病毒載體，顯微注射入雞胚X期胚盤下腔，成功獲得了人溶菌酶表達(dá)量高達(dá)57.66 μg/mL的轉(zhuǎn)基因雞。Park等［9］成功獲得在輸卵管表達(dá)人表皮生長因子的轉(zhuǎn)基因雞。最近Kwon等［24］也成功獲得在輸卵管特異表達(dá)人類促紅細(xì)胞生成素（hEPO）的轉(zhuǎn)基因雞。雞輸卵管生物反應(yīng)器的研究雖已取得較大進(jìn)展，但還未與定點(diǎn)整合、穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因技術(shù)很好地結(jié)合起來，其中發(fā)展相對較為成熟的逆轉(zhuǎn)錄病毒法也還存在一定安全風(fēng)險(xiǎn)和效率低下等問題，要想實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，制備轉(zhuǎn)基因家禽的技術(shù)還有待進(jìn)一步研究和優(yōu)化。

1.1.6 其他類型動物生物反應(yīng)器 其他類型的動物生物反應(yīng)器還有精囊腺和家蠶等。對于某些動物（如豬）而言，精液是量相對較大的體液，利用精囊腺也可以特異表達(dá)某些外源蛋白。Dyck等［8］證明了小鼠雄性附屬性腺特異性啟動子P12基因可用于生產(chǎn)在精囊上皮細(xì)胞中表達(dá)人生長激素的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的精液中的人生長激素濃度可達(dá)0.5 mg/mL。宋成義等［25］成功以豬精漿蛋白Ⅱ基因啟動外源目的蛋白或多肽在精囊腺中特異性表達(dá)并分泌到精液中，通過收集精液獲取目的蛋白。因表達(dá)的目的產(chǎn)物不會進(jìn)入轉(zhuǎn)基因動物的血液循環(huán)等，對轉(zhuǎn)基因動物的健康影響不大，因此精囊腺作為生物反應(yīng)器具有巨大的潛在利用價(jià)值。但目前研究相對較少，表達(dá)的外源蛋白也有限，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化較為困難。

轉(zhuǎn)基因家蠶生物反應(yīng)器是在家蠶絲腺中表達(dá)外源基因，在蠶繭中收集目的蛋白。主要利用家蠶的桿狀病毒（BmNPV）表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法進(jìn)行操作來表達(dá)外源蛋白。該方法能高效整合外源基因，并在家蠶體內(nèi)穩(wěn)定高水平表達(dá)。家蠶生長周期短，經(jīng)馴養(yǎng)、選育已難以逃逸到自然界，其在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強(qiáng)的能力，合成的蛋白可隨蠶絲蛋白一起分泌到體外。Song等［26］利用轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺制備的類胰島素生長因子（Human insulin-like growth factor-Ⅰ，hIGF-Ⅰ）有效降低I型糖尿病小鼠的血糖水平。Wang等［27］成功制備了能在蠶繭中高水平表達(dá)重組人酸性成纖維生長因子（Recombinant human acidic fibroblast growth factor，r-haFGF）的轉(zhuǎn)基因蠶，且證明了其產(chǎn)物的生物活性。利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白也將會是一種有效途徑，相關(guān)研究已開展臨床試驗(yàn)。

1.2 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器應(yīng)用現(xiàn)狀

人們對于各類藥用蛋白的需求日益增加，促使生物反應(yīng)器制備藥用蛋白開始向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)的動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥用蛋白已達(dá)上百種，部分轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器制得的藥用蛋白已獲批生產(chǎn)上市。

1.2.1 已獲批上市的動物生物反應(yīng)器 目前，已知獲批上市的轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器主要有兩個(gè)。一個(gè)是世界上第一個(gè)利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物——重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）。2006年該藥首次獲得了歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會的上市批準(zhǔn)，隨后在2009年獲得了美國食品與藥品管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）的上市批準(zhǔn)。該藥是GTC Biotherapeutics生物公司利用轉(zhuǎn)基因山羊的乳腺作為生物反應(yīng)器表達(dá)獲取的，其主要成分重組人抗凝血酶Ⅲ具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。他們現(xiàn)在僅用幾十只轉(zhuǎn)基因山羊就能生產(chǎn)出全世界1年需求的抗凝血酶Ⅲ。該藥品的上市掀起制藥業(yè)的一場革命，開辟生物制藥業(yè)的新紀(jì)元。轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器制藥將逐漸取代低效的細(xì)菌發(fā)酵制藥和高成本的哺乳動物細(xì)胞制藥，成為最主要的基因工程制藥技術(shù)。

另一個(gè)是荷蘭Pharming公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因兔乳中生產(chǎn)的重組人C1抑制劑（Recombinant human C1 esterase inhibitor protein，rhC1INH，商品名：RUCONEST），該轉(zhuǎn)基因藥用蛋白于2010年被EMA批準(zhǔn)上市，2014年被美國FDA批準(zhǔn)上市。RUCONEST主要適應(yīng)癥包括治療成年人及青少年遺傳性血管性水腫以及功能延遲恢復(fù)缺血性再灌注損傷。另外該藥也正在進(jìn)行針對治療2～13歲的兒童遺傳性血管水腫和急性發(fā)作血管性水腫的Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。

另外，Alexion Pharmaceuticals公司利用雞輸卵管作生物反應(yīng)器生產(chǎn)的用于治療溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥（Lysosomal acid lipase deficiency， LAL-D）的藥物Kanuma，目前已被FDA、歐盟以及日本批準(zhǔn)上市。Kanuma是一種重組人溶酶體酸性脂肪酶（Recombinant human lysosomal acid lipase，rhLAL）蛋白，在轉(zhuǎn)基因雞蛋的蛋白中提取制備。這是除了乳腺生物反應(yīng)器以外新獲批上市的動物生物反應(yīng)器，預(yù)示著未來也許將有更多動物生物反應(yīng)器獲批生產(chǎn)應(yīng)用。

1.2.2 已批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)階段的動物生物反應(yīng)器 國外多家公司利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)的多種藥用蛋白已經(jīng)取得了前期試驗(yàn)的成功，進(jìn)入了臨床研發(fā)階段，其中幾家上市公司尤為突出。

GTC公司（后被LFB公司收購）除了已獲批的人抗凝血酶外，還有利用羊乳腺生產(chǎn)的甲種胎兒球蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP，MM-093）進(jìn)行了對自身免疫疾病的臨床Ⅱ期試驗(yàn)。另外，生產(chǎn)的用于治療肺纖維囊腫的抗胰蛋白酶（AAT）、治療燒傷和血量擴(kuò)積的血清白蛋白、單克隆抗體CD20和CD137（4-1BB）以及瘧疾疫苗均已基本完成臨床前期階段；利用兔乳生產(chǎn)的人凝血因子Ⅶα已進(jìn)入了臨床Ⅲ期試驗(yàn)。

荷蘭Pharming公司除了已獲批上市的RUCONEST以外，還有利用奶牛乳腺作生物反應(yīng)器生產(chǎn)的乳鐵蛋白，目前已基本完成臨床前期試驗(yàn)階段，主要應(yīng)用于營養(yǎng)制劑；利用轉(zhuǎn)基因兔和轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的膠原蛋白等也進(jìn)入了臨床前期試驗(yàn)階段。

英國PPL公司利用綿羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的抗胰蛋白酶已完成臨床Ⅲ期試驗(yàn)，生產(chǎn)的血纖維蛋白原進(jìn)行臨床Ⅲ期試驗(yàn)，生產(chǎn)的蛋白C進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。PharmAthene公司利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的丁酰膽堿酯酶（Protexia—butyrylcholinesterase）在治療有機(jī)磷中毒上已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)，在治療老年癡呆上已進(jìn)入臨床前期試驗(yàn)。BioSidus公司利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的生長激素已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。ProGenetics公司利用豬乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人凝血因子Ⅸ完成臨床前期試驗(yàn)。

而在國內(nèi)，獲批試驗(yàn)的生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物極少，大部分研究還處在臨床前的探索階段。主要由于一些哺乳動物研究周期相對較長，存在技術(shù)上的挑戰(zhàn)，國內(nèi)審核也較為謹(jǐn)慎，因此產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展緩慢。但在一些研發(fā)周期較短且研究技術(shù)成熟的動物上也取得了一些產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展。例如，張耀洲等［28］完成了利用家蠶蛹生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hGM-CSF）口服給藥的臨床前安全性評價(jià)；2010年浙江大學(xué)的張文平等［29］完成了該研究的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了在國內(nèi)外首次以家蠶作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人用生物制品的突破。

動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)勢以及帶來的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，不斷推動動物生物反應(yīng)器制藥向前發(fā)展，國內(nèi)外各大生物科技公司及相關(guān)科研機(jī)構(gòu)將繼續(xù)對轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白進(jìn)行新的研究與試驗(yàn)，未來將會有更多動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組藥用蛋白獲批應(yīng)用。

2 轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器的研究及應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器概述

植物作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以表達(dá)具有生物活性的人類或動物蛋白，因此在生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域也一直是研究熱點(diǎn)。植物生物反應(yīng)器廣義上指以植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)或整株植物為工廠大量生產(chǎn)具有重要功能的蛋白質(zhì)，如人或動物用疫苗、抗體和重要的氨基酸等。與其他生物反應(yīng)器（微生物生物反應(yīng)器和動物生物反應(yīng)器）相比，植物細(xì)胞具有全能性，能夠再生植株且易于成活，用作生物反應(yīng)器具有成本更低、周期更短、安全性好、利于規(guī)模化生產(chǎn)以及表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動物細(xì)胞一樣的免疫原性和生物活性等優(yōu)點(diǎn)，且不存在有關(guān)轉(zhuǎn)基因動物倫理道德的問題。早在20世紀(jì)80年代末，人們在研究動物生物反應(yīng)器的同時(shí)也將目光放在了植物生物反應(yīng)器上。1986年Barta等［30］在煙草和向日葵中將激素與農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶進(jìn)行融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了首次使用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)藥用蛋白；1989年Hiatt等［13］第一次使用煙草表達(dá)抗體；1997年Curtiss等［31］利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)鏈球菌變異株SpA蛋白（一種表面蛋白抗原），這是第一例利用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗。之后陸續(xù)有研究報(bào)道了各種轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗、抗體、激素因子等外源產(chǎn)物，至今已有大約20多種植物被用作生物反應(yīng)器，產(chǎn)物種類近百種。根據(jù)產(chǎn)物需求的不同，選擇哪一種植物作為生物反應(yīng)器是研究者們首先要考慮的問題，目前農(nóng)作物是應(yīng)用比較多的一類植物生物反應(yīng)器。

2.2 植物生物反應(yīng)器應(yīng)用現(xiàn)狀

2.2.1 生產(chǎn)疫苗 目前植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗是一個(gè)比較熱門的研究方向。傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)和純化過程較為復(fù)雜和昂貴，在運(yùn)輸和儲存過程中必須冷藏，這進(jìn)一步增加了疫苗生產(chǎn)的下游成本。用轉(zhuǎn)基因植物作生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗具有可當(dāng)?shù)胤N植、常溫儲藏的天然優(yōu)勢，將降低疫苗制作的下游成本。煙草是較早開始研究的轉(zhuǎn)基因植物，常作為研發(fā)疫苗等外源蛋白表達(dá)的模式植物。利用煙草作生物反應(yīng)器生產(chǎn)目的蛋白的研究最為廣泛，用它表達(dá)的疫苗種類多達(dá)20種以上，包括如抗登革熱病毒［32］、霍亂毒素［33］、狂犬病病毒［34］、鼠疫桿菌［35］等。除了煙草，還有如擬南芥等植物作為植物生物反應(yīng)器開發(fā)疫苗的模式植物，用以表達(dá)的疫苗有豬瘟病毒［36］、豬繁殖與呼吸綜合征病毒［37］、人輪狀病毒［38］疫苗等。

與不能直接食用的植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗相比，可食用植物生產(chǎn)疫苗更具有優(yōu)勢和應(yīng)用前景。利用植物可食用部分表達(dá)疫苗抗原蛋白，通過直接口服的方式獲得抗原蛋白，使機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)，稱之為“口服疫苗”。經(jīng)研究證明，“口服疫苗”食用后可同時(shí)引起粘膜免疫反應(yīng)與血清免疫反應(yīng)，在消化道內(nèi)植物細(xì)胞壁能夠保護(hù)疫苗抗原不被消化酶降解，直到腸道微生物降解植物細(xì)胞壁后，抗原被釋放出來，引發(fā)免疫反應(yīng)［39］。與傳統(tǒng)注射疫苗免疫相比，“口服疫苗”具有更多優(yōu)勢，我們可以通過吃蔬菜、水果等植物性食品就可以獲得免疫抗體，養(yǎng)殖的動物也可以通過飼喂的方式進(jìn)行防疫工作，節(jié)省了注射疫苗的成本和勞力等。該新型簡單有效的免疫接種方式一出現(xiàn)就成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。已報(bào)道轉(zhuǎn)化成功的口服疫苗植物有番茄［40］、馬鈴薯［41］、萵苣［42］、胡蘿卜［43］、花生［44］、玉米［45］、菠菜［46］、白三葉草（畜禽飼喂）和苜蓿［47］等。對于人而言，考慮到有些植物不能直接生食（如馬鈴薯），而加熱可能破壞免疫原蛋白，研究口服疫苗更趨向于利用可直接生食的植物，如番茄、蘋果、花生、香蕉和胡蘿卜等。對于家畜的飼用疫苗，可選用苜蓿、大豆和玉米等作為受體植物，使抗原蛋白積累于種子、葉子等天然蛋白貯藏器官中或整株植物體中。最近，Bertini等［48］用菠菜和紅甜菜作生物反應(yīng)器制備谷氨酸脫羧酶（GAD65），用于預(yù)防自身免疫疾?、裥吞悄虿?，證明紅甜菜效果更佳。諸多研究成果推動了“口服疫苗”臨床應(yīng)用的發(fā)展。

目前，已有十多種疫苗獲批應(yīng)用或進(jìn)行臨床試驗(yàn)。如美國陶氏益農(nóng)（Dow AgroSciences）公司利用煙草生產(chǎn)新城疫病毒的疫苗已被美國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用，該疫苗是第一個(gè)獲得批準(zhǔn)的用于預(yù)防禽類的新城疫病毒的獸用植物疫苗。由美國Bayer Innovation公司研發(fā)的用煙草制備的治療非霍奇金淋巴瘤癌癥疫苗已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)。Medicago公司利用煙草、馬鈴薯、番茄、玉米、萵苣、菠菜等植物研發(fā)的H5N1疫苗已完成臨床Ⅱ期試驗(yàn)［49］。由美國Arizona State大學(xué)研發(fā)的利用馬鈴薯制備的乙肝疫苗抗原已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)，利用馬鈴薯和番茄制備的Norwalk病毒衣殼蛋白進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。Thomas Jefferson大學(xué)利用萵苣和菠菜分別研發(fā)的乙肝疫苗抗原和包含狂犬病抗原表面的融合蛋白已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。Guardian biosciences公司利用油菜籽研發(fā)的抗球蟲病的家禽疫苗進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)等。利用植物生產(chǎn)疫苗正越來越受到關(guān)注，就目前取得的成果來看，植物來源的疫苗有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2.2 生產(chǎn)抗體 為更好地利用植物生物反應(yīng)器解決藥物生產(chǎn)量的不足及快速免疫問題，科學(xué)家采用的另一個(gè)策略是利用植物表達(dá)特定抗體。將編碼全抗體或抗體片段的基因?qū)胫参?，即可在植物中表達(dá)出具有功能性識別抗原及具有結(jié)合特性的全抗體或部分抗體片段；植物細(xì)胞不但可以對表達(dá)的重組抗體蛋白進(jìn)行正確的組裝和后期加工，其表達(dá)產(chǎn)物能保持良好的生物學(xué)特性，而且植物表達(dá)的抗體以二聚體形式存在，表達(dá)產(chǎn)物的親和力高，有助于全面發(fā)揮抗體的功能。2000年St?ger等［50］利用谷類（水稻、小麥）成功表達(dá)了針對癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen ，CEA）的單鏈Fv抗體，表達(dá)量達(dá)30μg/g，實(shí)現(xiàn)了從煙草等模式植物系統(tǒng)到谷物類農(nóng)作物的轉(zhuǎn)變。2005年Hull等［14］利用煙草成功制備了治療炭疽的單克隆抗體。近年來也有許多科學(xué)家利用植物制備了具有生物活性的抗體。如Phoolcharoen等［51］在煙草中瞬時(shí)表達(dá)狂犬病中和單鏈抗體和狂犬病病毒肽融合蛋白，該蛋白可穿過纖維素血腦屏障去中和狂犬病毒，可為狂犬病提供更有效的緊急預(yù)防。Julve等［52］利用煙草成功制備重組蛇毒多克隆抗體，可用于制備低成本抗蛇毒血清抗體。在臨床應(yīng)用研究方面，美國PB（Planet Biotechnology）公司利用煙草研發(fā)的單克隆抗體（CaroRxTM），主要應(yīng)用于阻止導(dǎo)致蛀牙的細(xì)菌對牙齒的粘附，有預(yù)防齲齒的作用［53］，目前已被歐盟批準(zhǔn)應(yīng)用。CIGB公司用煙草研發(fā)的用于B型肝炎疫苗試劑的純化的重組單克隆抗體已被古巴批準(zhǔn)上市。NeoRx/Monsanto公司利用玉米研制的癌癥抗體進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)；Bayer Innovation公司利用煙草研制的治療非霍奇金淋巴瘤的IgG抗體已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)；Pharma-plantaconsortium公司利用煙草研發(fā)的預(yù)防艾滋病的抗體2G12已獲批進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段［54］；Biolex公司利用浮萍作生物反應(yīng)器研發(fā)的Anti-CD20單克隆抗體用于治療非霍奇金淋巴瘤，目前已準(zhǔn)入臨床前期試驗(yàn)；Thomas Jefferson大學(xué)利用生菜研發(fā)的B型乙肝表面抗體開展臨床Ⅰ期試驗(yàn)。美國Mapp公司利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)了3種抗埃博拉病毒的人鼠嵌合單克隆抗體mAbs進(jìn)行“雞尾酒”療法，該試驗(yàn)性抗體藥物名為ZMapp，2014年8月《Nature》報(bào)道了該藥治愈了18只感染埃博拉病毒的恒河猴［55］，為抗埃博拉藥物研發(fā)帶來了新希望。

總之，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)抗體已取得許多成效，對未來制備低成本、高產(chǎn)量的特異性抗體提供了新思路、新途徑，更多治療性抗體有待研究人員進(jìn)一步研究。

2.2.3 生產(chǎn)其他藥用蛋白 利用植物作為生物反應(yīng)器，除了用于生產(chǎn)了那些傳統(tǒng)方法難以獲得的疫苗抗體外，還表達(dá)了其他類型的藥用蛋白，如各種酶制劑［56］、激素［7］、血蛋白［57］、生理營養(yǎng)因子［58］等。首先實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的植物源藥用蛋白是以色列藥品研發(fā)公司Protalix開發(fā)的在胡蘿卜細(xì)胞中表達(dá)的葡糖腦苷脂酶，于2012年被美國FDA批準(zhǔn)上市，主要用于治療β-葡萄糖腦苷脂酶減少或缺乏引起的一種遺傳代謝病高雪氏?。℅aucher’s disease），其價(jià)格要比天然來源的藥物更便宜。此外，已獲批上市的還有ProdiGene公司和Kentucky BioProcessing公司分別利用玉米和煙草研發(fā)的抑肽酶，以及ProdiGene公司利用玉米研發(fā)的抗生物素蛋白（Avidin）和β-葡糖醛酸酶（GUS），Ventria Bioscience公司利用玉米和水稻研發(fā)的重組人乳鐵蛋白（Lacromin），加拿大SemBioSys公司利用紅花（safflower）研發(fā)的蝦飼料添加劑Immunosphere，ORF Genetics公司利用大麥研發(fā)的人生長因子ISOkine、DERMOkine，Meristem Therapeutics公司利用玉米研發(fā)的治療囊性纖維化的胃脂肪酶，Cobento AS公司利用擬南芥研發(fā)的人內(nèi)因子（用于治療維生素12缺乏）等均已獲批上市銷售。另外也有多家公司研發(fā)的其他轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的藥用蛋白獲批臨床試驗(yàn)，如SemBioSys公司已于2008年開始用植物（紅花種子）制胰島素進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，目前已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)；還有Protalix公司利用胡蘿卜細(xì)胞研發(fā)的乙酰膽堿酯酶已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)等。除了這些已獲批臨床試驗(yàn)的植物源人用蛋白，還有許多其他相關(guān)研究在開展臨床試驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作。與動物生物反應(yīng)器相比，植物生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展似乎推進(jìn)得更快。

3 展望

近幾十年來，基因工程藥物產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。全球生物技術(shù)公司總數(shù)已近5 000余家，上市公司有600余家，銷售總額近400億美元，其中生物技術(shù)藥物占總銷售額的70%。就目前已上市的轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的產(chǎn)品銷售額來看，因需求增加，預(yù)計(jì)銷售額將持續(xù)增加。雖然轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器取得了許多巨大的成果，但是仍然有許多問題需要面對和解決。首先，對于轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器而言，存在理論和技術(shù)尚有不完善之處：一是非定點(diǎn)整合技術(shù)（如piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)）存在目的基因整合位點(diǎn)的不確定性，不能完全保證在預(yù)期位點(diǎn)，有可能出現(xiàn)片段缺失、調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定等問題，而新型定點(diǎn)打靶基因編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）技術(shù)［59］、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcriptional activator like effector nuclease，TALEN）技術(shù)［60］、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術(shù)［61］也有打靶效率較低、脫靶的問題；二是轉(zhuǎn)基因動物的克隆效率低，尤其是較大的哺乳動物，低下的體細(xì)胞克隆效率極大地阻礙了轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)，要獲得更多轉(zhuǎn)基因動物必然會增加時(shí)間和資金的投入成本；三是安全性問題，插入外源基因首先是存在轉(zhuǎn)基因動物逃逸繼而污染野生型基因的風(fēng)險(xiǎn)，其次是轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器產(chǎn)物可能存在免疫原性問題以及人畜共患病等風(fēng)險(xiǎn)；四是動物生物反應(yīng)器產(chǎn)物的收集與純化技術(shù)的問題，既要保證收集純化到足量的目的產(chǎn)物，又要確保對轉(zhuǎn)基因動物不會有太大影響，要同時(shí)滿足這些要求對動物生物反應(yīng)器的選擇是個(gè)挑戰(zhàn)。

對于轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器而言，存在的主要問題有：一是表達(dá)產(chǎn)物的量普遍偏低［62］，增加了下游加工的成本，很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化水平，同時(shí)在生產(chǎn)疫苗應(yīng)用方面，表達(dá)量低下可能導(dǎo)致免疫耐受問題；二是免疫原性問題，因?yàn)橹参锏奶腔c動物的有差異，某些植物源性的藥用蛋白可能會使人產(chǎn)生過敏反應(yīng)［63］；三是植物表達(dá)系統(tǒng)針對性強(qiáng)，由于不同植物和不同組織的生理差異較大，因此單一的表達(dá)系統(tǒng)只適合生產(chǎn)幾種甚至一種目標(biāo)產(chǎn)品。在應(yīng)用過程中不同植物生物反應(yīng)器存在一定差異，如何選擇最適表達(dá)系統(tǒng)是成功生產(chǎn)植物生物反應(yīng)器藥用蛋白的重要一環(huán)；四是有安全性問題，轉(zhuǎn)基因植物要防止被動物誤食或帶出實(shí)驗(yàn)室進(jìn)而污染外界野生型植物基因。

目前被真正批準(zhǔn)生產(chǎn)應(yīng)用的動植物生物反應(yīng)器并不多，而限制動植物生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的原因主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)品一直存在爭議，公眾的輿論讓政府審批也很保守，轉(zhuǎn)基因藥品的產(chǎn)業(yè)化與批準(zhǔn)上市涉及多個(gè)監(jiān)管部門，特別是我國相關(guān)領(lǐng)域監(jiān)管空白，法規(guī)政策缺乏，轉(zhuǎn)基因藥品產(chǎn)業(yè)化更是落后。另外未將藥品審評與動物審評主管部門集中在一起，導(dǎo)致相應(yīng)的工作難以協(xié)調(diào)。但隨著日益發(fā)展的科技，相信科學(xué)家們能一步一步解決理論與技術(shù)上存在的問題，不斷完善轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的制備方法，提高轉(zhuǎn)基因藥用蛋白的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白等產(chǎn)品具有光明前景，相信能為企業(yè)、為國家贏得更大利潤的同時(shí)，也為患者謀得福音。