蔣小涵， 肖 瑛， 王圓圓， 張瑩瑩， 石明雋， 郭 兵

(貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 貴州省高校重大疾病發(fā)病機制研究及藥物防治特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

Twist屬于高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)結構的轉錄因子家族，在動物和人的胚胎發(fā)育、誘導細胞遷移以及組織塑形中起重要作用。近期研究證實，Twist參與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，是EMT重要誘導因子之一[1]，而EMT是各種器官發(fā)生纖維化的中心事件。已有文獻報道，在病毒感染的肺纖維化[2]、單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎臟纖維化模型[3]和高糖刺激的人腹膜間質纖維化[4]中Twist都高表達，由此推測Twist在纖維化病變中發(fā)揮重要作用。但是在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)腎纖維化中，Twist表達水平及其調控鮮有報道。

辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)又名伏立諾他(vorinostat)，是第2代的組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)，可抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的活性[5]。目前，HDACi治療器官纖維化越來越受到關注。已有研究表明，在肝纖維化、腎纖維化和肺纖維化中，HDACi都能明顯減輕纖維化程度[6-7]。前期研究在百草枯中毒致大鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；种苿㏒AHA能夠降低纖維化的肺組織和細胞中HDAC1的蛋白水平和活性，從而發(fā)揮抗纖維化效應[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1過表達會被某些EMT轉錄因子募集，影響EMT的進程，從而導致疾病的產生[9-10]。

本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)復制的大鼠糖尿病(diabetes mellitus，DM)模型為研究對象，檢測SAHA對糖尿病腎病大鼠腎纖維化病變的影響、Twist在糖尿病大鼠腎組織中的作用和SAHA治療后Twist的變化，并對其相關機制進行初步探討，為臨床治療糖尿病腎病提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 健康清潔級雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重(160±20)g，購于北京華阜康生物科技有限公司，許可證號為[SCXK(京)2009-0004]。

1.2實驗試劑 STZ(Sigma)；SAHA(BioChemPartner)；兔抗Twist多克隆抗體和鼠抗Ⅳ型膠原(collgen type Ⅳ，Col-Ⅳ)多克隆抗體(Sigma)；兔抗HDAC1多克隆抗體，鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(北京博奧森公司)；小鼠抗大鼠β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG 和辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG(武漢普美克生物技術有限公司)；血糖儀和血糖試紙(強生有限公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore);免疫組織化學SP兩步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RIPA強裂解液和 BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；總RNA 提取試劑盒以及Twist和β-actin 引物(上海生工生物技術工程服務有限公司)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)； 2× SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)。

2 方法

2.1動物模型建立及分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照(normal control，NC)組、DM組和SAHA組，每組12只。造模前先禁食6～8 h，然后乙醚麻醉，DM組和SAHA組一次性尾靜脈注射溶于0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的STZ，劑量為55 mg/kg， NC組大鼠尾靜脈注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液，72 h后測造模組大鼠的空腹血糖，以血糖值≥16.7 mmol/L且尿糖陽性為造模成功。在造模8周后，SAHA組用0.3%羧甲基纖維素溶解的SAHA(25 mg·kg-1·d-1)灌胃，持續(xù)8周。

2.2標本收集 飼養(yǎng)16周后處死大鼠。處死前1 d用代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，收集的尿液取部分離心后，取上清，-20 ℃保存；處死前禁食6～8 h，麻醉前稱重，股動脈取血，靜置后離心取上清，-20 ℃保存；開腹后，用針尖扎向左心室注射0.9%的生理鹽水進行腎臟灌洗，并將右心耳戳破，直至雙側腎變蒼白后，取雙側腎臟，小心去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重并記錄，用來評估腎臟指數(shù)(kidney index，KI)，KI(mg/g)=腎重(mg)/體重(g)；所取腎臟標本一部分放于-80 ℃保存，以備腎組織蛋白和RNA檢測用，另一部分用4%中性甲醛固定以備形態(tài)學檢測用。

2.3生化指標檢測 血糖(blood glucose，BG)用氧化酶法檢測，尿蛋白(urine protein，UP)用雙縮脲法檢測，尿總蛋白量為24 h尿量與尿蛋白濃度的乘積。

2.4腎組織病理學的檢測 4%中性甲醛固定的腎組織，先用乙醇將腎組織塊脫水，經石蠟包埋、固定，然后切片(3 μm)，切片用于HE和Masson染色。光鏡觀察腎組織形態(tài)學變化。

2.5免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟，微波修復抗原，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，加兔抗Twist多克隆抗體(1∶150)孵育4 ℃過夜，第2天取出后30 min復溫，然后滴加山羊抗兔的II抗孵育30 min，DAB 染色，蘇木素復染，脫水，晾干后中性樹膠封片，鏡下觀察并拍攝圖像。

2.6Western blot 法檢測蛋白水平 取0.2 g的腎皮質放入勻漿器，并加入1 mL的蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)于冰上進行研磨，12 000 r/min低溫離心取上清，BCA法測蛋白濃度，制成蛋白樣品。經6%～15%的SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜上，在5%的脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h，洗膜后分別加入抗β-actin(1∶4 000)、Twist(1∶1 000)、E-cadherin (1∶300)、HDAC1(1∶300)、α-SMA(1∶300)和Col-Ⅳ(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，II 抗室溫孵育1 h。洗膜后，加入ECL發(fā)光液1～2 min后，置入Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行曝光。曝光后的條帶用Image Lab 圖像分析軟件進行分析。用管家基因β-actin 蛋白條帶作內參照，目的蛋白的灰度值與內參對比分析結果。

2.7Real-time PCR檢測Twist的mRNA 表達 TRI-zol法提取總RNA，使用Thermo試劑盒進行逆轉錄成cDNA。按照SuperReal 熒光定量預混試劑盒的20 μL體系加樣，放入Bio-Rad CFX96熒光定量PCR分析系統(tǒng)進行檢測，以β-actin為內參照，目的基因的相對含量以2-ΔΔCt表示。引物及退火溫度見表1。

表1PCR引物序列及擴增條件

Table 1. The sequences of the primers and the PCR conditions used in real-time PCR

NameThesequencesoftheprimer(5’→3’)Annealingtemperature(℃)TwistF:ACCCTCACACCTCTGCAT-TC56R:CAGTTTGATC-CCAGCGTTTTβ-actinF:GCCAACACAGTGCTGTCT56R:AGGAGCAATGATCTT-GATCTT

F: forward; R: reverse.

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理和統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)分布和方差齊性后組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠的一般情況變化與生化指標

與NC組大鼠對比，DM組大鼠的血糖、24 h尿蛋白和腎臟指數(shù)均增高；但與DM組對比，僅SAHA組腎臟指數(shù)降低有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其尿蛋白雖有降低，但差異無統(tǒng)計學顯著性，血糖改變不明顯，見表2。

表2各組大鼠腎臟指數(shù)、血糖和24h尿蛋白量的變化

Table 2. The levels of kidney index (KI), blood glucose (BG) and 24 h urine protein (24 h UP) in different groups (Mean±SD.n=12)

GroupKI(mg/g)BG(mmol/L)24hUP(mg)NC5.73±0.218.89±0.8733.48±11.71DM15.37±1.07*17.81±0.94*913.08±311.42*SAHA13.08±0.10#17.59±1.23505.74±185.82

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

2 各組大鼠腎組織的病理學變化

HE染色結果顯示，NC組大鼠的腎小球輪廓清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎癥細胞浸潤；DM組可見大部分腎小管上皮細胞崩解有空泡變性，腎小管管腔明顯擴張，偶見基底膜增厚，間質區(qū)有炎癥細胞浸潤；經過SAHA治療后，腎小球和腎小管病變有所改變，間質炎癥細胞浸潤也減少。Masson染色結果顯示，NC組大鼠腎小球基底膜及系膜區(qū)未見膠原沉積，腎小管間質區(qū)未見膠原增多；DM組大鼠可見腎小管管腔明顯擴大，腎小球、腎小管基底膜區(qū)，腎小球系膜區(qū)以及腎小管間質區(qū)可見大量膠原纖維沉積即為藍色條索狀物質；經過SAHA治療后，整個視野藍色條索狀物質有所減少，見圖1。

Figure 1. The histological changes of the renal tissues of the rats in different groups (HE and Masson staining, × 400).

圖1各組大鼠腎組織的形態(tài)學觀察

3 各組大鼠腎組織中HDAC1、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表達

Western blot實驗結果顯示，與NC組相比，DM組大鼠腎組織中的E-cadherin蛋白的表達明顯降低，而HDAC1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表達增加(P<0.05)；經過SAHA治療的大鼠，其E-cadherin蛋白的表達較DM組大鼠有所增加，HDAC1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表達明顯低于DM組大鼠(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The protein expression of HDAC1, E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅳ in different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

圖2各組大鼠腎組織中HDAC1、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表達量比較

4 各組大鼠腎組織中 Twist的表達

免疫組化結果顯示，DM組大鼠腎組織中Twist的表達量明顯增多且分布在腎小管；SAHA給藥治療后，Twist在腎小管中的分布有所減少，見圖3。Western blot結果顯示，Twist蛋白表達水平在DM組中的表達均比NC組中多(P<0.05)；經過SAHA給藥干預后，Twist蛋白表達較DM組明顯降低(P<0.05)。Real-time PCR結果顯示，Twist的mRNA在DM組中的表達均比NC組中高(P<0.05)；經過SAHA給藥治療后，Twist的mRNA表達較DM組明顯降低(P<0.05)，見圖4。

5 糖尿病大鼠腎組織中Twist、HDAC1、E-cadhe-rin、α-SMA和Collgen-Ⅳ蛋白表達量的相關性分析

相關性分析顯示，在糖尿病大鼠腎組織中，Twist與HDAC1的蛋白表達量呈正相關，相關系數(shù)為0.6848(P<0.05)；與此同時，Twist蛋白表達量與E-cadherin呈負相關，與α-SMA呈正相關，與Col-Ⅳ呈正相關，相關系數(shù)分別為-0.7212、0.9152和0.8909(P<0.01)； HDAC1蛋白與E-cadherin呈負相關，與α-SMA呈正相關，與Col-Ⅳ呈正相關，相關系數(shù)分別為-0.7455、0.6970和0.6848(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. The expression of Twist in the renal tissues of different groups detected by immunohistochemical staining (×200).

圖3免疫組化染色觀察各組大鼠腎組織中Twist的表達變化

Figure 4. The expression of Twist in renal tissues at mRNA and protein levels in different group. A: the protein expression of Twist in renal tissues； B: the mRNA expression of Twist in renal tissues. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

圖4各組大鼠腎組織中TwistmRNA和蛋白的表達

Figure 5. Correlation analysis of Twist, HDAC1, E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅳ protein expression in renal tissues of DM group.

圖5糖尿病大鼠腎組織中Twist、HDAC1、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表達量的相關性分析

討 論

DN發(fā)展為慢性腎功能衰竭的最終通路是腎小球硬化及腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)。腎小管間質纖維化是DN的主要病理特征，越來越多的證據表明，在TIF進程中腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化發(fā)揮著關鍵作用[11]。本課題組和其他學者[12-13]均發(fā)現(xiàn)，DM大鼠隨著病程的進展，腎小管上皮細胞E-cadherin顯著減少而α-SMA大量表達，并伴隨FN和膠原纖維等ECM的沉積，表明糖尿病進展過程中腎小管間質發(fā)生了EMT，促進了腎功能的惡化，故抑制或逆轉EMT的發(fā)展對于延緩DN等慢性腎臟疾病具有重要的意義。

Twist基因作為一種癌基因目前備受關注。脊椎動物中，Twist基因存在2種，分別是Twsit1(即Twist)和Twsit2(即Dermo-1)，它們編碼的蛋白有共同的bHLH結合區(qū)域，兩者編碼的C端有共同的編碼序列，但是N端，Twsit2比Twsit1少一個富有氨基酸的區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，Twist基因在多種實體腫瘤中高表達，是多種腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移的關鍵調控因子[14]。在這一過程中，Twist能夠促使上皮細胞向間充質細胞轉分化，促使腫瘤細胞游走，促進了EMT的過程[15]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Twist與某些器官纖維化有關，且能促進EMT的進展。He等[4]用高糖刺激人腹膜間質細胞，發(fā)現(xiàn)細胞的表型發(fā)生改變，同時觀察到Twist基因大量表達，Twist可與其下游的YB-1基因相互作用，然后激活靶基因的E-box，促進EMT的發(fā)生，導致細胞發(fā)生纖維化。相反，如果沉默Twist基因，纖維化病變有所逆轉。Kida等[3]在UUO腎纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生率與Twist表達量呈正相關。在慢性低氧誘導的腎纖維過程中，Twist表達增多就會抑制E-cadherin的表達并且可以調控α-SMA的表達；當敲低Twist，缺氧所導致的EMT會發(fā)生逆轉[16]。但是有關Twist在DN腎小管間質纖維化中的作用以及其調控機制還不清楚。本研究結果顯示，在糖尿病大鼠16周的腎組織中觀察到了Twist的表達較同期正常對照組明顯增多，且伴隨著α-SMA和Col-Ⅳ的表達增加，E-cadherin的表達減少，提示在糖尿病腎小管間質纖維化發(fā)生發(fā)展中，Twist可能參與了EMT轉變和ECM沉積的過程。

在纖維化疾病中，HDAC1的活性增強，提示蛋白質的乙?；?去乙?；胶饪赡鼙淮蚱?。HDAC1屬于HDAC中的I類，既可以催化組蛋白發(fā)生去乙?；磻?，使核心組蛋白分子N端被乙酰化修飾的賴氨酸殘基去乙?；瑥亩谷旧|處于緊密的超螺旋結構，抑制基因的表達[17]；也可以催化某些非組蛋白發(fā)生去乙?；磻?，改變其蛋白的翻譯后修飾水平，從而改變蛋白質的生理功能或穩(wěn)定性[18-19]。有研究表明，HDAC1參與調控EMT，能夠抑制ZO-1和E-cadherin的啟動子活性[20]。本研究中高糖引起了腎小管上皮細胞發(fā)生了EMT轉變，在此過程中，觀察到HDAC1蛋白在糖尿病組中的表達均比正常組中多，且與E-cadherin蛋白的表達呈顯著負相關，表明HDAC1可能通過抑制E-cadherin基因啟動子活性參與高糖誘導的EMT過程。

有研究報道，HDACs是Twist的上游蛋白，它們可相互作用對靶蛋白進行調節(jié)[21-22]。過表達的Twist會影響成骨細胞的分化，它通過募集HDAC1和Smad4，形成抑制復合物，對BMP信號通路有抑制作用；當加入HDACi后，Twist影響成骨細胞的分化有改善，提示二者之間存在某種關系[23]。于是本實驗對二者的表達變化進行了相關性分析，發(fā)現(xiàn)二者之間呈正相關。SAHA是一種非選擇性HDACi，能夠抑制HDAC1、2、3和6的活性[8]，已由FDA批準用于臨床。在食管鱗狀細胞癌中，調控EMT的Twist表達上調；運用HDACi后，EMT發(fā)生逆轉且Twist明顯下調[9]。在膽道癌研究上，發(fā)現(xiàn)SAHA可以通過降低與CDH1(E-cadherin)有關聯(lián)的轉錄因子Twist、Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2和Smad4的親和力，抑制了Smad4的核轉位，這樣可以使CDH1表達增多，則EMT表達發(fā)生逆轉[10]。為了進一步驗證，我們使用SAHA對STZ誘導的糖尿病大鼠腎纖維化進行干預，發(fā)現(xiàn)SAHA給藥治療的大鼠，HDAC1蛋白表達量明顯降低，Twist蛋白和mRNA的表達量也顯著減少，二者蛋白的變化存在顯著正相關，而且伴隨EMT的逆轉，ECM沉積也有所減少，大鼠的腎纖維化程度有所改善。提示SAHA有可能通過抑制HDAC1的功能，使轉錄因子Twist募集HDAC1減少，這樣形成的抑制復合物減少，進而抑制組蛋白去乙?；笶-cadherin的轉錄起始不會被抑制，最終有利于EMT的逆轉。但是確切的機制還需要在體外高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞敲低HDAC1或Twist進行深入的研究。

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