李銀蘋(píng)， 張學(xué)銘， 汪開(kāi)誠(chéng)， 應(yīng) 磊， 汪 洋， 王萬(wàn)鐵， 金可可

(溫州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，研究表明，高血糖導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞凋亡參與糖尿病腎病的發(fā)生和進(jìn)展。糖尿病腎病的基本病理改變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)增生，基膜增厚，晚期出現(xiàn)彌漫性腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎衰竭。腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell)是重要的靶細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，易發(fā)生高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和損傷，在糖尿病腎病的發(fā)展中起重要作用[1-4]。近年的研究表明，氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng)是糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制之一[5-6]，可引發(fā)腎小球系膜細(xì)胞凋亡[7]，使用抗氧化劑可有效改善糖尿病動(dòng)物的腎臟損傷，防止腎臟纖維化[8-9]。

自2007年，Ohsawa等[10]在《Nature Medicine》報(bào)道氫在機(jī)體內(nèi)具有選擇性抗氧化治療作用以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)氫在缺血-再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化和代謝綜合征等多種疾病過(guò)程中發(fā)揮抗氧化作用[11-13]，證實(shí)氫分子能特異性中和自由基中毒性最強(qiáng)的·OH和ONOO-而產(chǎn)生明顯的抗氧化反應(yīng)，同時(shí)氫分子亦可增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶的活性[14]，并抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[15]。但目前氫分子對(duì)糖尿病腎病的干預(yù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察氫分子對(duì)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)信號(hào)通路的影響，并探討可能的機(jī)制，以期為糖尿病腎病的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠腎小球系膜細(xì)胞SV40-MES13購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)低糖[5.5 mmol/L葡萄糖(glucose)]DMEM培養(yǎng)基，5% CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照(normal control,C)組用低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；甘露醇(mannitol,G)組用低糖加甘露醇(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)DMEM培養(yǎng)基；高糖(high glucose,H)組用高糖(25 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；高糖+富氫水(high glucose+hydrogen-rich water,HH)組用富氫水配制高糖干粉DMEM(25 mmol/L葡萄糖干粉DMEM+富氫水)培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中，高糖+富氫水組每6 h換液1次且培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，其余3組每24 h換液 1 次，8～14代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、FBS和高糖干粉DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco；富氫水購(gòu)自北京活力氫源飲品有限公司(氫氣濃度大于0.8 mmol/L，氫氣與水穩(wěn)定結(jié)合，開(kāi)罐4 h氫氣濃度仍大于0.4 mmol/L)；二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)、RIPA裂解液、SOD活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天；兔抗鼠Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO-1]單克隆抗體均購(gòu)自Abcam；兔抗鼠Bax、Bcl-2和caspase-3單克隆抗體均購(gòu)自 Cell Signaling Technology；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo。所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

3 主要方法

3.1Western blot 法 造模48 h后，各組加入500 μL裂解液(含5 μL PMSF)， 冰上裂解細(xì)胞20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品，行SDS-PAGE，濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min，TBST漂洗3次后，分別加 I 抗[Nrf2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO-1(1∶10 000)]，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后加 II 抗室溫孵育 1 h，再次 TBST 洗滌，滴加ECL發(fā)光液暗室曝光后，采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶吸光度與內(nèi)參照β-actin條帶吸光度的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

3.2RT-PCR法測(cè)定mRNA的表達(dá) 采用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞HO-1和NQO-1 mRNA的表達(dá)，Trizol法提取總RNA并測(cè)定RNA濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物序列如表1。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 50 ℃(HO-1和β-actin)/ 52 ℃(NQO-1)30 s， 72 ℃ 1 min， 32個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的基因條帶灰度值與內(nèi)參照β-actin基因條帶灰度值的比值反映目的基因的表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物序列

3.3SOD活性的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，冰浴勻漿，4℃離心，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.4超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 用含5 μmol/L DHE的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃孵育細(xì)胞30 min， 進(jìn)行熒光探針裝載，PBS洗滌2次，熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，采用ImageJ 軟件進(jìn)行半定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 20.0 軟件分析，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者兩兩比較行 SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者行 Dunnett’s 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與C組比較，H組中Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而HH組上述蛋白與C組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與H組比較，HH組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。這提示高糖狀態(tài)下，氫分子可提高抗凋亡蛋白和降低促凋亡蛋白的水平。

Figure 1. The effects of hydrogen molecule on the protein levels of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖1氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2 氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞ROS及SOD活性的影響

與C組比較，H組的紅色熒光明顯增強(qiáng)，提示H組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平較C組增高；與H組比較，HH組的紅色熒光明顯減弱，提示HH組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平較H組明顯降低，見(jiàn)圖2。這表明氫分子可有效降低高糖誘導(dǎo)的ROS水平。

Figure 2. The effects of hydrogen molecule on ROS production in glomerular mesangial cells cultured with high glucose (DHE method, ×200). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsH group.

圖2氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞活性氧表達(dá)的影響

H組的SOD活性較C組明顯降低(P<0.05)，而HH組的SOD活性與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，且HH組的SOD活性明顯高于H組(P<0.05)，見(jiàn)圖3，提示氫分子可有效提高高糖狀態(tài)下抗氧化酶的活性。

3 氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路的影響

與C組比較，H組Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)降低，HO-1和NQO-1的mRNA表達(dá)也降低(P<

Figure 3. The effects of hydrogen molecule on the activity of SOD in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖3氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞SOD活性的影響

0.05)；HH組的Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)及HO-1和NQO-1的mRNA表達(dá)均明顯高于H組(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

討 論

DN是糖尿病常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。目前認(rèn)為， 細(xì)胞凋亡在 DN 的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[16]。 研究發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞凋亡參與DN的發(fā)病[17]。本實(shí)驗(yàn)表明，高糖可明顯誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，抑制其抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的重要誘因，高血糖可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧，并超過(guò)機(jī)體的清除能力，使氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA 過(guò)氧化及線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Sugiyama等[7]在電子顯微鏡下也觀察到ROS可明顯誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡，提示采取措施抑制高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是改善DN的重要策略。我們發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧并伴有SOD活性的降低，且促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)相應(yīng)增加，抗凋亡蛋白表達(dá)相應(yīng)減少。采用富氫水干預(yù)后，可明顯降低其活性氧水平，并顯著提高抗氧化酶SOD活性，同時(shí)伴有抗凋亡蛋白表達(dá)增加和促凋亡蛋白表達(dá)減少，提示氫分子通過(guò)其選擇性的抗氧化作用，對(duì)高糖狀態(tài)下的腎小球系膜細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡的保護(hù)作用。

Nrf2信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在糖尿病氧化損傷中起關(guān)鍵的抑制作用[18]。Nrf2 廣泛存在于心、肺、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官內(nèi)，是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路Nrf2-ARE通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白。生理狀態(tài)下，Nrf2在細(xì)胞漿中與它的抑制蛋白Keap1結(jié)合，保持低活性狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激或親電子混合物時(shí)，Nrf2從Keap1上游離出來(lái)，轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，與ARE結(jié)合，從而促使下游的HO-1和NQO1等的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化的作用[2]。研究報(bào)道，Nrf2激活劑可減輕糖尿病所致腎臟的氧化損傷和炎癥反應(yīng)[18-19]，而Nrf2-KO糖尿病小鼠較對(duì)照鼠表現(xiàn)為更大量的腎臟ROS產(chǎn)物和嚴(yán)重的DNA氧化損傷[20]；Nrf2及其下游蛋白NQO1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)的激活能夠顯著改善STZ誘導(dǎo)的野生型糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，高糖(25 mmol/L葡萄糖)組Nrf2蛋白以及HO-1和NQO-1 mRNA及蛋白表達(dá)降低，與Bai等[21]在糖尿病心肌病的研究結(jié)果一致，但Li等[22]在高糖組用30 mmol/L葡萄糖造模卻得到了相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)原因可能與糖濃度不同有關(guān)。高糖組ROS水平明顯升高，提示高糖組處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，而高糖狀態(tài)加富氫水干預(yù)后，可以顯著提高Nrf2蛋白以及下游HO-1和NQO-1的mRNA及蛋白表達(dá)，且ROS水平相應(yīng)降低，提示氫分子對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用。因此，本研究初步認(rèn)為，氫分子作為一種新型的 Nrf2 激活劑，可能通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá)，激活下游抗氧化蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，從而在高糖狀態(tài)下對(duì)腎小球系膜細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用。

Figure 4. The effects of hydrogen molecule on the protein levels of Nrf2， HO-1 and NQO-1 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖4氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. The effects of hydrogen molecule on the mRNA expression of HO-1 and NQO-1 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖5氫分子對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞HO-1和NQO-1mRNA表達(dá)的影響

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