李雨穎， 章科娜， 蔡錦威， 林江濤， 邵喜英

(1衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 衢州 324000； 2浙江省腫瘤醫(yī)院， 浙江 杭州 310022； 3浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 4衢州市柯城區(qū)人民醫(yī)院， 浙江 衢州 324000； 5浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 浙江 杭州 310058)

卵巢癌是目前致死率最高的惡性婦科腫瘤。我國(guó)卵巢癌的新發(fā)病例每年約13.15萬，是發(fā)達(dá)國(guó)家的6倍。由于卵巢的特殊解剖結(jié)構(gòu)與生理功能，有70%的患者就診時(shí)已屬晚期[1]，并且，就診患者中至少有75%已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或盆腔外轉(zhuǎn)移[2]。所以闡明卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲機(jī)制無疑能提高卵巢癌患者的生存期。目前對(duì)卵巢癌的治療方式以手術(shù)為主，藥物化療為輔。但是化療藥具有明顯的毒副作用，這就限制了用藥時(shí)長(zhǎng)和劑量，使體內(nèi)腫瘤細(xì)胞無法清除干凈，從而引起臨床上治療失敗和預(yù)后不良。中藥抗腫瘤具有高效、低毒和不易耐藥等特點(diǎn)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

川楝素(toosendanin，TSN)是從傳統(tǒng)中藥楝屬植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物[3]，具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，是一種極具潛力的抗癌藥物[4]。川楝素能抑制肝癌細(xì)胞系Hep3B和SMMC-7721的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并伴隨Bax和Fas蛋白表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降，該作用涉及死亡受體途徑和線粒體途徑的參與[5-6]。Wang等[7]認(rèn)為川楝素能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480凋亡，這與抑制AKT/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。我們前期研究已證實(shí)，川楝素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，但其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用尚未報(bào)道。因此，本研究旨在明確川楝素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人卵巢癌細(xì)胞系CAVO-3和SKVO-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

2 主要試劑

川楝素(分子式為 C30H38O11，分子量 574.60，純度≥99%) 購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；紫杉醇(taxinol，TAX)購(gòu)自Sigma；RIPA裂解液、抗GAPDH單克隆抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM和RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶及胎牛血清購(gòu)自Gibco；熒光標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔Ⅱ抗、抗核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) p65、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snail單克隆抗體購(gòu)自Abcam；NF-κB抑制劑BAY11-7082購(gòu)自BioVision。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAVO-3和SKVO-3細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為90% DMEM(RPMI-1640)+ 10% 胎牛血清，加入1×104U/L青、鏈霉素，在5% CO2、37 ℃密閉條件下培養(yǎng)。一般2 d換液，4 d進(jìn)行傳代。

3.2細(xì)胞存活率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAVO-3和SKVO-3細(xì)胞按一定密度接種至96孔培養(yǎng)板中，按分組分別加入不同濃度的TSN和TAX，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后給藥，在加藥后的12、24、48、72和96 h后，各孔均加入10 μL CCK-8試劑，混勻后孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，以細(xì)胞培養(yǎng)12 h時(shí)所測(cè)得的對(duì)照組A值平均值為100%，計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組平均值/A對(duì)照組(12 h)平均值×100%。

3.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAVO-3細(xì)胞按一定密度接種到6孔板中，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用1 mL槍頭在培養(yǎng)皿中沿直徑劃痕，劃成一條直線(劃痕時(shí)槍頭垂直于板孔底部)；再劃第二條，垂直于第一條劃痕，形成十字交叉。然后用PBS清洗板孔2次。換液，分別按分組加入TSN(500 nmol/L)和或BAY11-7082(20 μmol/L)，TSN+BAY11-7802組先加入BAY11-7802處理2 h后再加入TSN。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，再用PBS清洗細(xì)胞2次。然后用4%多聚甲醛固定30 min。在顯微鏡下拍照記錄。再用ImageJ軟件測(cè)定劃痕距離。

3.4Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)用CAVO-3細(xì)胞預(yù)先饑餓24 h。在24孔板中放入Transwell小室。用無血清培養(yǎng)基稀釋人工基底膜，在小室中加入100 μL人工基底膜，37 ℃條件下過夜使膠凝固。在下室中加入750 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，再把Transwell小室放進(jìn)24孔板中，在Transwell小室中加入200 μL事先準(zhǔn)備的細(xì)胞懸液。按分組分別加入TSN(500 nmol/L)和/或BAY11-7082(20 μmol/L)，37 ℃培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次。加入4%多聚甲醛固定2 min，PBS清洗2次。再用吉姆薩染色15 min，PBS清洗2次。最后用棉簽刮掉上室內(nèi)的細(xì)胞。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)，取平均值。以穿過小室的細(xì)胞數(shù)量作為評(píng)價(jià)侵襲能力的指標(biāo)。

3.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞分別加入相應(yīng)藥物進(jìn)行孵育(TSN濃度為500 nmol/L，BAY11-7082濃度為20 μmol/L)。誘導(dǎo)24 h后，用Western blot法進(jìn)行蛋白檢測(cè)。先裂解細(xì)胞，4 ℃離心，取上清液，收集待測(cè)蛋白樣本。用BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量處理，具體操作按說明書進(jìn)行。制膠(提前24 h準(zhǔn)備好)，每孔20 μL上樣，用70 V、110 V電壓進(jìn)行電泳，80 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，10%的BSA封閉2 h，洗膜，再用相應(yīng) I 抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，再在避光環(huán)境下用相應(yīng)熒光 II 抗室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次。Odyssey紅外激光雙色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃膜，ImageJ軟件測(cè)定條帶光密度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 川楝素對(duì)細(xì)胞存活率的影響

TSN對(duì)CAVO-3和SKVO-3細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制效應(yīng)。在各時(shí)點(diǎn)，與陰性對(duì)照組相比，TSN濃度越大，其抑制作用越明顯。不同濃度TSN處理后，細(xì)胞存活率在12、24、48、72和96 h逐漸下降(P<0.05)。陰性對(duì)照TAX組細(xì)胞活力于48 h后才開始下降，用500 nmol/L TSN處理24 h時(shí)，細(xì)胞的存活率即開始下降，因此取該點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見表1、2。

表1 CAVO-3細(xì)胞存活率

*P<0.05vscontrol group.

表2 SKVO-3細(xì)胞存活率

*P<0.05vscontrol group.

2 川楝素對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲作用的影響

TSN處理組細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，加入NF-κB抑制劑BAY11-7082處理則逆轉(zhuǎn)了TSN的效應(yīng)，TSN+BAY11-7082組細(xì)胞劃痕愈合率較TSN組顯著升高(P<0.05)，見圖1。

TSN處理組侵襲的CAVO-3細(xì)胞從上表面轉(zhuǎn)移到下表面的數(shù)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，加入NF-κB抑制劑BAY11-7082處理也逆轉(zhuǎn)了TSN的該效應(yīng)，TSN+BAY11-7082組侵襲細(xì)胞的數(shù)量較TSN組顯著增加(P<0.05)，見圖2。

3 川楝素抑制卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的相關(guān)分子機(jī)制

TSN處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞中NF-κB p65顯著升高，上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)也顯著升高(P<0.05)，而間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin和vimentin表達(dá)則顯著下降，Snail蛋白表達(dá)也顯著下降(P<0.05)，見圖3、4。

為明確NF-κB與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail是否有相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)使用了NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，BAY11-7082逆轉(zhuǎn)了TSN的效應(yīng)，與TSN組相比，TSN+BAY11-7082組的E-cadherin表達(dá)顯著下降(P<0.05)，而N-cadherin、vimentin和Snail蛋白表達(dá)則顯著增加(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 1. The result of cell scratch wound healing assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsTSN group.

圖1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Figure 2. The result of Transwell assay (×400). Mean±SD.n=5.*P<0.05vsTSN group.

圖2Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

遷移和侵襲是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一，也是癌癥致死的重要原因。腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲是一個(gè)多因素、多階段和多步驟發(fā)生的復(fù)雜過程。涉及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解、腫瘤細(xì)胞黏附性下降和新生血管生成等因素。其中，EMT發(fā)揮了決定性作用。EMT的調(diào)控受到多種轉(zhuǎn)錄抑制因子和生長(zhǎng)因子的影響。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，來維持組織結(jié)構(gòu)的完整性[8]。研究表明，E-cadherin表達(dá)缺失與某些腫瘤的發(fā)生相伴行，如乳腺癌、結(jié)腸癌及上皮鱗狀細(xì)胞癌等。并且，減少E-cadherin表達(dá)會(huì)增大腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的風(fēng)險(xiǎn)[9]。N-cadherin和vimentin等間充質(zhì)蛋白會(huì)伴隨E-cadherin表達(dá)的下降而呈現(xiàn)高表達(dá)，從而共同誘導(dǎo)EMT過程[10-11]。本研究結(jié)果表明TSN組CAVO-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，且E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin和vimentin表達(dá)下降。說明川楝素逆轉(zhuǎn)了CAVO-3細(xì)胞的EMT，從而抑制其遷移侵襲的發(fā)生。

Figure 3. The effect of TSN on the protein expression of NF-κB p65 in CAVO-3 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3TSN對(duì)CAVO-3細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響

EMT過程的調(diào)控也涉及多種轉(zhuǎn)錄抑制因子，如Snail、Twist、ZEB1/ZEB2、KLF8和Slug等。它們通過抑制E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)EMT，從而提高細(xì)胞的遷移侵襲能力[11]。研究認(rèn)為在各類腫瘤中，Snail可抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin、細(xì)胞角蛋白等的表達(dá)[12]，也可間接上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、vimentin等和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[13]。本研究也表明Snail在川楝素處理后表達(dá)明顯下調(diào)。此外，NF-κB是一類轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的信號(hào)通路在血管生成、抑制凋亡和增殖方面都起到關(guān)鍵作用。NF-κB在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加[14]。卵巢癌細(xì)胞通過激活NF-κB，來抑制凋亡通路和抵抗外界不利環(huán)境[15]。在本研究中，川楝素組細(xì)胞內(nèi)的NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)。用NF-κB通路抑制劑預(yù)處理后，逆轉(zhuǎn)了川楝素的實(shí)驗(yàn)效應(yīng)，其促進(jìn)了Snail蛋白表達(dá)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)了EMT過程，E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin和vimentin表達(dá)增加。此外，NF-kB抑制劑處理后也使細(xì)胞劃痕愈合率增加，細(xì)胞侵襲數(shù)量增多。

Figure 4. The effect of TSN on the protein expression of E-cadherin, N-cadherin, vimentin and Snail in the CAVO-3 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsTSN group.

圖4TSN對(duì)CAVO-3細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，川楝素能抑制人卵巢癌細(xì)胞的遷移侵襲能力，其機(jī)制與抑制EMT過程有關(guān)，并由NF-κB/Snail信號(hào)通路所介導(dǎo)。

[1] Yun SJ, Kim WJ. Role of the epithelial-mesenchymal transition in bladder cancer: from prognosis to therapeutic target[J]. Korean J Urol, 2013, 54(10):645-650.

[2] Ponnusamy MP, Seshacharyulu P, Lakshmanan I, et al. Emerging role of mucins in epithelial to mesenchymal transition[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2013, 13(9):945-956.

[3] Zhong ZC, Xie JX, Chen SF, et al. The chemical structure of toosendanin[J]. J Chem, 1975, 33(1):397-406.

[4] Zhang B, Wang ZF, Tang MZ, et al. Growth inhibition and apoptosis-induced effect on human cancer cells of toosendanin, a triterpenoid derivative from Chinese traditional medicine[J]. Invest New Drugs, 2005, 23(6):547-553.

[5] Liu XL, Wang H, Zhang L, et al. Anticancer effects of crude extract fromMeliatoosendanSieb.et Zucc on hepatocellular carcinomainvitroandinvivo[J]. Chin J Integr Med, 2016, 22(5):362-369.

[6] 王 鵬， 王 進(jìn)， 姜 慧， 等. 川楝素通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 31(2):218-222.

[7] Wang G, Feng CC, Chu SJ, et al. Toosendanin inhibits growth and induces apoptosis in colorectal cancer cells through suppression of AKT/GSK-3β/β-catenin pathway[J]. Int J Oncol, 2015, 47(5):1767-1774.

[8] Sachdeva M, Mo YY. Micro RNA-145 suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1[J]. Cancer Res, 2010, 70(1):378-387.

[9] Yang E, Hu XF, Xing PX. Advances of MUC1 as a target for breast cancer immunotherapy[J]. Histol Histopathol， 2007， 22(8)：905-922.

[10] Ohno T, Aihara R, Kamiyama Y, et al. Prognostic signi-ficance of combined expression of MUC1 and adhesion mo-lecules in advaneed gastric cancer[J]. Eur J Cancer, 2006, 42(2):256-263.

[11] 張燦燦， 尉 蔚， 林雪艷， 等. 上皮性卵巢癌中PARP-1的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(3):425-431.

[12] Karicheva O, Rodriguez-Vargas JM, Wadier N, et al. PARP3 controls TGFβ and ROS driven epithelial-to-me-senchymal transition and stemness by stimulating a TG2-Snail-E-cadherin axis[J]. Oncotarget, 2016, 7(39):64109-64123.

[13] Cheng JC, Chang HM, Xiong S, et al. Sprouty2 inhibits amphiregulin-induced down-regulation of E-cadherin and cell invasion in human ovarian cancer cells[J]. Oncotarget, 2016, 7(49):81645-81660.

[14] Zhu YW, Yan JK, Li JJ, et al. Knockdown of radixin suppresses gastric cancer metastasisinvitroby up-regulation of E-cadherin via NF-κB/Snail pathway[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(6):2509-2521.

[15] Karyampudi L, Lamichhane P, Krempski J, et al. PD-1 blunts the function of ovarian tumor-infiltrating dendritic cells by inactivating NF-κB[J]. Cancer Res, 2016, 76(2):239-250.