廣西人群IL-22基因多態(tài)性分布特征及其與血脂的關(guān)系*

王 榮， 覃海媚， 黃華佗， 陸玉蘭， 藍(lán) 艷， 韋貴將， 郭 靜， 韋葉生△

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2皮膚科， 3右江民族醫(yī)學(xué)院， 廣西 百色 533000)

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-22是IL-10家族成員，又被稱為IL-10相關(guān)T細(xì)胞源性可誘導(dǎo)因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)，被Dumoutier等[1]發(fā)現(xiàn)于2000年。IL-22主要由活化T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等合成，分布于全身多處組織器官，具有廣泛的免疫學(xué)功能，尤其在調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)時(shí)起關(guān)鍵作用[2]。近年來，IL-22基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系越來越受到重視，而不同遺傳背景的人群在同一疾病中的易感性存在差異。目前，已有報(bào)道和IL-22屬于同一家族的IL-10基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性腦卒中等疾病密切相關(guān)[3-5]。然而，有關(guān)IL-22基因多態(tài)性和血脂密切相關(guān)疾病間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。因此，我們探討廣西人群中IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G位點(diǎn)多態(tài)性分布特征及與其他人群的差異，并進(jìn)一步分析不同基因型人群的血脂水平差異，為我國人群的基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫構(gòu)建提供資料，也可為廣西人群高血脂預(yù)防及與這些位點(diǎn)相關(guān)疾病的深入探討奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

隨機(jī)選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心280例健康者，排除有心臟病、中風(fēng)及血脂異常等病史，其中包括男性103例，女性177例，年齡18～78歲，研究個(gè)體均世居廣西地區(qū)，無血緣關(guān)系。研究方案通過我院倫理委員會(huì)審批，受試者均知情并簽署同意書。

2 方法

2.1樣本DNA的提取 抽取各研究對象靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝。按DP318型血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)說明書提取樣本DNA，-20 ℃保存。

2.2引物的合成 參照GenBank中IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G的核苷酸序列，使用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs2227485C/T位點(diǎn)上游引物序列為5’-GCCCGGAGGGTATTTTACAGACA-3’，下游引物為序列5’-TGGTAGGAAAATGAGTCCG- TGACC-3’，延伸引物為序列5’-TTTTTTTTTTTTT- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTGACCAA-AATGCTTACTCAG-3’；rs2227491A/G位點(diǎn)上游引物序列為5’-TCTGCAGGTGGAA GGGAAACAG-3’，下游引物為序列5’-GACGTTCGTCTCATTGGGGAGA-3’，延伸引物為5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTGTAAGCTACAGTTGTG-ACGAAC-3’。

2.3基因分型 PCR反應(yīng)體系總共20 μL，包括 1.0 μL樣本DNA、2.0 μL緩沖液、2.0 μL dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μL，剩余體積添加滅菌雙蒸水。使用熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(HotStarTaq DNA polymerase； Qiagen)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase， SAP；Promega)和核酸外切酶I (exonuclease I， EXOI； Epicentre)純化后用SNP基因分型試劑盒SNaPshot Multiplex kit (ABI)進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物采用SAP純化后在ABI 3730XL全自動(dòng)DNA測序儀上樣，并用GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems)分析。DNA測序法驗(yàn)證上述分型結(jié)果。

2.4血脂指標(biāo)檢測 研究對象均禁食12 h，次日清晨空腹，坐位采集靜脈血3 mL，離心后獲取血清。分別使用血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(very-low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)的試劑盒在HITACHI 7600型生化分析儀上測定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)。直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率?；蚨鄳B(tài)性分布差異的比較采用χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗(yàn)證樣本人群是否有代表性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 rs2227485C/T位點(diǎn)和rs2227491A/G位點(diǎn)基因分型

經(jīng)檢驗(yàn)，這2個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明選取的人群有代表性。 rs2227485C/T和rs2227491A/G的PCR擴(kuò)增長度分別為166 bp和159 bp。分型結(jié)果顯示，rs2227485C/T位點(diǎn)有CC、CT和TT 3種基因型；rs2227491A/G位點(diǎn)有AA、AG和GG 3種基因型。測序結(jié)果充分證實(shí)了分型結(jié)果，見圖1、2。

Figure 1. The sequencing map ofIL-22 gene rs2227485C/T site. ①～③ indicated CC, TT and CT genotypes, respectively.

圖1IL-22基因rs2227485C/T位點(diǎn)測序圖

Figure 2. The sequencing map ofIL-22 gene rs2227491A/G site. ①～③ indicated AA, AG and GG genotypes, respectively.

圖2IL-22基因rs2227491A/G位點(diǎn)測序圖

2 廣西人群中IL-22基因2位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布

rs2227485C/T位點(diǎn)CC、CT和TT基因型及C和T等位基因頻率分布在男女2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；rs2227491A/G位點(diǎn)AA、AG和GG基因型及A和G等位基因頻率分布在男女2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 廣西人群IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布

3 各位點(diǎn)與其它種群的基因多態(tài)性比較

分析顯示，廣西人群rs2227485C/T位點(diǎn)各基因型和等位基因的分布頻率與意大利(TSI)、北京(HCB)、日本(JPT)和墨西哥(MEX)人群比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；廣西人群rs2227491A/G位點(diǎn)基因型分布頻率與意大利、日本和墨西哥人群之間對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與北京人群相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，其等位基因分布頻率與意大利、北京、日本和墨西哥人群相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3。

4 IL-22基因2個(gè)位點(diǎn)基因型與血脂水平的關(guān)系

經(jīng)檢驗(yàn)，IL-22基因2個(gè)位點(diǎn)中3種基因型與研究對象間年齡及性別的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。rs2227485C/T位點(diǎn)3種基因型間各項(xiàng)血脂指標(biāo)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；rs2227491A/G位點(diǎn)3種基因型間HDL-C和LDL-C的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，與GG組比較，AG和AA組中HDL-C水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與AA組比較，AG和GG組中LDL-C水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、5。

表2廣西人群IL-22基因rs2227485C/T位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率與其它種族的比較

Table 2. Comparison of genotype and allele frequencies ofIL-22 gene rs2227485C/T site in Guangxi people with other ethnic populations

GroupnGenotypefrequencyPAllelefrequencyPCCCTTTCTGuangxipeople28048(17.1%)138(49.3%)94(33.6%)234(41.8%)326(58.2%)HapMap-TSI17642(23.9%)96(54.5%)38(21.6%)0.015180(51.1%)172(48.9%)0.006HapMap-HCB8618(20.9%)52(60.5%)16(18.6%)0.03088(51.2%)84(48.8%)0.030HapMap-JPT17056(32.9%)78(45.9%)36(21.2%)<0.001190(55.9%)150(44.1%)<0.001HapMap-MEX10030(30.0%)52(52.0%)18(18.0%)0.002112(55.3%)88(44.7%)<0.001

表3廣西人群IL-22基因rs2227491A/G位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率與其它種族的比較

Table 3. Comparison of genotype and allele frequencies ofIL-22 gene rs2227491A/G site in Guangxi people with other ethnic populations

GroupnGenotypefrequencyPAllelefrequencyPAAAGGGAGGuangxipeople28045(16.1%)148(52.8%)87(31.1%)238(42.5%)322(57.5%)HapMap-TSI17642(23.9%)94(53.4%)40(22.7%)0.046178(42.9%)174(57.1%)0.017HapMap-HCB8618(20.9%)52(60.5%)16(18.6%)0.07388(51.2%)84(48.8%)0.046HapMap-JPT17056(32.9%)78(45.9%)36(21.2%)<0.001190(55.9%)150(44.1%)<0.001HapMap-MEX10026(26.0%)54(54.0%)20(20.0%)0.029106(53.0%)94(47.0%)0.010

表4 IL-22基因rs2227485C/T位點(diǎn)基因型的血脂指標(biāo)比較

表5 IL-22基因rs2227491A/G位點(diǎn)基因型的血脂指標(biāo)比較

*P<0.05vsAA;#P<0.05vsGG.

討 論

IL-22基因位于第12號(hào)染色體長臂上(12q15)，處在IL-26和IFNG位點(diǎn)上游大約52 bp和99 bp處，含6個(gè)外顯子及5個(gè)內(nèi)含子，長度為6 kb，編碼含179個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[6]。人類IL-22與IL-10的相似度為22.8%，與大鼠IL-22的相似度為80.8%[7]。血脂異常是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致內(nèi)皮損傷是其發(fā)生發(fā)展的重要因素。IL-22下游信號(hào)由JAK-STAT及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)[8]。JAK-STAT信號(hào)通路已被明確證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷和凋亡有關(guān)，并參與Fas、IL-8及IL-6這些凋亡因子的基因調(diào)控，而MAPK通路更是與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、遷移與增殖密切相關(guān)，且參與很多炎癥因子的基因調(diào)控，這提示IL-22可能參與機(jī)體的病理性免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而加劇AS進(jìn)程。Rattik等[9]對敲除IL-22基因小鼠喂食高膽固醇14周后發(fā)現(xiàn)，這組小鼠的主動(dòng)脈根部形成的AS斑塊面積和對照組相比明顯減少，且斑塊的膠原蛋白水平明顯下降，而平滑肌細(xì)胞中的α-actin蛋白表達(dá)升高。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，IL-22基因rs2227485C/T位點(diǎn)在廣西人群中，其多態(tài)性分布頻率與意大利人、北京人、日本人和墨西哥人比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-22基因rs2227491A/G位點(diǎn)多態(tài)性與這4個(gè)人群相比也有差異。這可能是由于廣西位于我國西南邊界，長期和外界環(huán)境相對隔絕，遺傳背景單純[10]。進(jìn)一步分析這些位點(diǎn)與血脂指標(biāo)關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)rs2227491A/G位點(diǎn)3種基因型間HDL-C和LDL-C的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HDL-C水平在A等位基因攜帶者(AG/AA)與GG基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LDL-C水平在G等位基因攜帶者(AG/GG)與AA基因型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示我們研究廣西人群中IL-22基因多態(tài)性和血脂相關(guān)疾病時(shí)，可以優(yōu)先考慮rs2227491A/G位點(diǎn)。rs2227485C/T和rs2227491A/G位點(diǎn)位于IL-22基因內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子上的突變可能會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控基因的表達(dá)，以此參與各種疾病的病理生理過程[11-12]。然而，尚無學(xué)者研究IL-22基因多態(tài)性與血脂相關(guān)疾病的關(guān)系。

綜上所述，我們對廣西人群IL-22基因rs2227485C/T位點(diǎn)和rs2227491A/G位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行探討，并比較了其在不同人群之間的分布差異，豐富了IL-22基因多態(tài)性在我國人群的遺傳學(xué)資料。分析其多態(tài)性與血脂間的關(guān)系可為疾病的研究提供數(shù)據(jù)支持。當(dāng)然，我們的研究還存在不足：樣本量較小，來源單一，僅探討了多態(tài)性和常規(guī)血脂指標(biāo)的關(guān)系。因此，進(jìn)一步探討IL-22基因多態(tài)性與血脂相關(guān)疾病的關(guān)系將是今后的一個(gè)方向。

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