, , , , , * (. 中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 00050; . 遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院, 沈陽(yáng) 005)

在日常監(jiān)管中,食品理化檢驗(yàn)主要包括質(zhì)量檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn),其中質(zhì)量檢驗(yàn)主要針對(duì)的是食品中品質(zhì)指標(biāo)、污染物指標(biāo)和帶入或者工藝衍生的風(fēng)險(xiǎn)性指標(biāo);安全檢驗(yàn)主要針對(duì)的是食品中可能存在的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)、超范圍添加成分和非食用物質(zhì)等方面的內(nèi)容。兩類檢驗(yàn)均存在檢測(cè)指標(biāo)分布不均一、檢測(cè)濃度范圍寬泛、檢測(cè)對(duì)象多樣、目標(biāo)物質(zhì)存在基體多樣性等特點(diǎn)。通常食品檢測(cè)的不確定度來(lái)源主要包含樣品預(yù)處理、樣品制備及樣品檢測(cè)等3個(gè)方面[1-3],其中樣品預(yù)處理及樣品制備也可以統(tǒng)一為樣品處理。研究[4-8]表明,食品分析中樣品處理和檢測(cè)分別帶入的不確定度占比中,樣品處理通常占有75%以上的份額,而樣品的檢測(cè)則只占有10%～20%的份額。隨著檢測(cè)設(shè)備的靈敏度和檢測(cè)能力的提高,來(lái)源于樣品檢測(cè)的不確定度逐步減小,影響食品檢測(cè)的主要不確定度來(lái)源為樣品處理。

樣品的制備技術(shù)[5-11]主要有液液萃取、液固萃取、固相萃取、定量轉(zhuǎn)化、消解等等,一般對(duì)于微量或者痕量成分,常采用富集或者濃縮的方式以提高其檢出效率,在檢測(cè)過(guò)程中存在物質(zhì)或者溶劑轉(zhuǎn)移和替換等步驟,帶來(lái)的檢測(cè)目標(biāo)損失包括吸附、分配、轉(zhuǎn)移、反應(yīng)等方面的損失[12-15]。在現(xiàn)代樣品分析中,有研究[16-22]提出減少處理步驟和同一提取凈化體系等方式,以減少相關(guān)損失,提高回收率。本工作建立一種快速樣品制備方法,對(duì)樣品進(jìn)行超細(xì)粉碎處理,添加溶劑進(jìn)行提取,加入惰性陶瓷砂,以超細(xì)粉碎離心器進(jìn)行離心粉碎后離心,將上清液轉(zhuǎn)移入裝有少量C18的進(jìn)樣瓶外管中,混勻后,套入附有濾膜內(nèi)管,直接過(guò)濾上機(jī)檢測(cè)。方法以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味料中的5種罌粟堿殼成分為例,通過(guò)與常規(guī)樣品處理方法進(jìn)行比較,來(lái)驗(yàn)證方法的有效性。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Waters XEVO TQ-S三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配超高效液相色譜儀;Milli-Q型超純水儀;CF16RXⅡ型離心機(jī);自制小型超細(xì)粉碎離心機(jī)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L-1,分別稱取鹽酸罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和磷酸可待因?qū)φ掌愤m量,用0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的甲醇溶液溶解并稀釋配制而成。使用時(shí),配制成罌粟堿、那可丁和蒂巴因的質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,嗎啡和磷酸可待因質(zhì)量濃度為250 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

嗎啡-D3、可待因-D3內(nèi)標(biāo)溶液:5.0 mg·L-1,介質(zhì)為甲醇。

鹽酸罌粟堿、嗎啡、那可丁、磷酸可待因、蒂巴因?qū)φ掌贰?/p>

乙腈、甲醇為色譜純;甲酸為質(zhì)譜純;鹽酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、甲酸銨、硫酸鎂為分析純;N-丙基乙二胺(PSA,粒度50～80 μm)、C18(粒度40～80 μm)填料。

1．2 儀器工作條件

1) 色譜條件 Waters BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μL;流量0.2 mL·min-1;流動(dòng)相A為乙腈,B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min時(shí),A為95%;0.5～2.5 min時(shí),A由95%降至70%;2.6～4.0 min時(shí),A為40%;4.0～6.0 min時(shí),A為95%。

2) 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓3.5 kV;離子源溫度150 ℃,去溶劑氣溫度400 ℃;去溶劑氣流量800 L·h-1;錐孔氣流量30 L·h-1;碰撞氣為氬氣,碰撞氣壓0.376 Pa。各物質(zhì)的定性、定量離子及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 常規(guī)樣品前處理方法

稱取試樣2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液150 μL,再加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL,超聲處理30 min,加入乙腈15 mL,渦旋振蕩1 min,加入無(wú)水硫酸鎂6 g和無(wú)水乙酸鈉1.5 g的混合粉末,迅速振搖,渦旋振蕩1 min,以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液待凈化。

稱取(50±5) mg的PSA、(100±5) mg的無(wú)水硫酸鎂、(100±5) mg的C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,移取上清液1.5 mL至此離心管中,渦旋混合1 min,以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心2 min,移取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1．3．2 快速樣品制備方法

稱取試樣2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液150 μL,加入含0.1%甲酸的乙腈5 mL,加入惰性陶瓷砂0.2 g,以超細(xì)離心粉碎器進(jìn)行離心粉碎5 min,轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1。取出,以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液1.2 mL于已裝入0.1 g左右C18填料的進(jìn)樣瓶外管中,混勻后,插入帶有濾膜的內(nèi)插管,蓋好進(jìn)樣瓶蓋,放入進(jìn)樣器,待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2．1 快速制備樣品方法的建立

為更好地比較快速樣品制備方法,選擇的常規(guī)樣品處理方法為改良的QuEChERS技術(shù),也屬于近年來(lái)較為流行用于快速前處理的方式。

快速樣品制備包括樣品的超細(xì)粉碎、提取、離心和過(guò)濾等幾個(gè)步驟,與常規(guī)方法不同的是,樣品提取經(jīng)過(guò)與惰性陶瓷的碰撞摩擦,增加了樣品的粉碎和接觸程度。液體和固體樣品均采用相同的方式進(jìn)行,其中液體樣品由于經(jīng)過(guò)該步驟增加了相關(guān)物質(zhì)的接觸,同時(shí)由于摩擦升高溫度,提高了提取效率。該制備方法采用的超細(xì)粉碎離心機(jī),見(jiàn)圖1,后期采用的進(jìn)樣瓶參見(jiàn)圖2。

圖1 超細(xì)粉碎離心機(jī)的構(gòu)造簡(jiǎn)圖Fig. 1 Structure diagram of the superfine crushing centrifuge

圖2 樣品瓶構(gòu)造簡(jiǎn)圖Fig. 2 Structure diagram of the vial

圖1所示的超細(xì)粉碎離心機(jī)主要對(duì)離心機(jī)內(nèi)壁、離心轉(zhuǎn)子構(gòu)造進(jìn)行了設(shè)計(jì):內(nèi)壁采用聚四氟乙烯內(nèi)面,均勻塑造成波浪式表面;離子轉(zhuǎn)子采用的桿型設(shè)計(jì),套入離心管,離心時(shí),管外端可以接觸到離心機(jī)內(nèi)壁,在振蕩下,產(chǎn)生樣品和內(nèi)置陶瓷砂的摩擦以粉碎樣品。圖2所示的樣品瓶主要按照現(xiàn)有1.5 mL或者2 mL進(jìn)樣瓶進(jìn)行了設(shè)計(jì),包括內(nèi)外兩個(gè)部分:外部套管可移入提取后的樣品溶液,管內(nèi)可預(yù)先放置少量C18填料,用于樣品溶液的凈化,待溶液和少量填料混勻后,插入內(nèi)管,內(nèi)管的下部有0.22 μm尼龍濾膜,可以過(guò)濾溶液,插入后進(jìn)入內(nèi)管的溶液可以直接上機(jī)測(cè)定。

2．2 工作曲線、檢出限與測(cè)定下限

稱取陰性樣品2.000 g,加入內(nèi)標(biāo)溶液150 μL,再加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法配制5種罌粟堿殼的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列并進(jìn)行測(cè)定,以罌粟堿、那可丁和蒂巴因的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,以外標(biāo)法定量;以嗎啡和可待因的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),嗎啡和可待因的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線,以內(nèi)標(biāo)法定量。2種樣品制備方法得到的線性范圍和線性回歸方程見(jiàn)表2。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2種樣品制備方法得到的線性參數(shù)、檢出限及測(cè)定下限Tab. 2 Linearity parameters, detection limits and the lower limits of determination of the two methods for sample preparation

由表2可知:本法所得線性回歸方程的斜率明顯高于常規(guī)方法,同時(shí)回歸曲線的截距相當(dāng);比較測(cè)定下限和檢出限可知,本法比常規(guī)方法的靈敏度高。

2．3 精密度與回收試驗(yàn)

在低、中、高等3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)回收率在75%以上。精密度包括日間和日內(nèi)精密度,5種物質(zhì)在6次平行測(cè)定下,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5%～10%。說(shuō)明本法可以滿足食品檢測(cè)的要求。

2．4 樣品分析

對(duì)市售的5批固體調(diào)味料和5批液體調(diào)味料進(jìn)行檢測(cè),按照常規(guī)樣品制備方法,固體調(diào)味料中檢出1批次的陽(yáng)性樣品(罌粟堿),液體調(diào)味料中均為陰性樣品。而通過(guò)快速樣品制備方法后,5批固體樣品中檢出2批次陽(yáng)性樣品(罌粟堿、嗎啡),液體樣品中檢出1批次陽(yáng)性樣品(嗎啡)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析,液體樣品的檢出主要是由于方法整體靈敏度的提高,而固體樣品中另外一批次樣品(嗎啡)的檢出,是由于在常規(guī)制備方法中固體樣品的粉碎程度不夠,沒(méi)有得到很好的提取。在進(jìn)一步粉碎和超聲提取后沿用常規(guī)制備的方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)可以檢出,但是測(cè)定值比快速樣品制備方法低,說(shuō)明快速制備方法具有更好的適用性,減少了假陰性的檢測(cè)結(jié)果。

本工作提出了超細(xì)粉碎提取、簡(jiǎn)單凈化的樣品前處理方法,可以用于部分食品樣品中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的檢測(cè)。方法進(jìn)一步減少了樣品的處理步驟和試劑的添加,減少了步驟中的轉(zhuǎn)移吸附損失,可以為食品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的靈敏檢測(cè)提供途徑。

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