基因編輯技術(shù)的新進(jìn)展及展望

李 莉， 任紅艷， 畢延震， 華文君， 華再東， 張立蘋， 鄭新民

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064)

基因編輯技術(shù)可以讓科學(xué)工作者對(duì)特定基因進(jìn)行編輯改造，如進(jìn)行突變、敲除，或進(jìn)行基因的定點(diǎn)整合等，為分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因功能研究、物種改良與改造提供了機(jī)遇和條件。基因編輯技術(shù)經(jīng)過(guò)初期的同源重組，歷經(jīng)鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)，發(fā)展到現(xiàn)在廣泛使用的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR)及其相關(guān)蛋白(Cas)技術(shù)，使得任意物種、任意細(xì)胞的基因編輯成為可能。因此，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用更為廣泛，其影響力也更為強(qiáng)勁，已經(jīng)在畜牧業(yè)中應(yīng)用于多種動(dòng)物的基因改造和改良[1]，甚至應(yīng)用于人類細(xì)胞基因的編輯和基因治療等。然而，目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9技術(shù)由于其固有的缺陷，使其更為精確的基因編輯和任意基因的編輯受到阻礙。因此，科學(xué)工作者需要尋找新的、更為可靠的基因編輯技術(shù)。本文就對(duì)基因編輯技術(shù)的最新進(jìn)展加以介紹，并對(duì)未來(lái)的基因編輯技術(shù)加以展望。

1 CRISPR/Cas技術(shù)的改進(jìn)與新應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，可對(duì)抗入侵的病毒。細(xì)菌CRISPR能識(shí)別入侵的病毒序列，引導(dǎo)Cas蛋白對(duì)病毒基因進(jìn)行切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3類，最常用的是二類的CRISPR/Cas9[2-3]?？茖W(xué)工作者對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改良，使它適用于各種生物細(xì)胞。CRISPR/Cas9僅利用一小段RNA(稱為gRNA)識(shí)別并引導(dǎo)Cas9對(duì)目標(biāo)基因組特定序列切割，經(jīng)過(guò)細(xì)胞自身的基因修復(fù)(包括同源重組和非同源末端連接)，最終產(chǎn)生插入、切除等突變。該技術(shù)簡(jiǎn)單易用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于從細(xì)菌到人的基因編輯[1，4-5]。美國(guó)哈佛大學(xué)科學(xué)家采用CRISPR/Cas9技術(shù)，破壞了豬細(xì)胞基因組中的62個(gè)潛在的有害PERV(豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒)位點(diǎn)序列，這極大地促進(jìn)了豬作為異體移植器官的應(yīng)用研究，使人們不再擔(dān)心豬病毒序列對(duì)人類的危害[6]。但是CRISPR/Cas9存在一些限制因素，如切割的基因識(shí)別3′末端部位必須含有NGG這種初始間隔區(qū)臨近序列(PAM)、存在脫靶現(xiàn)象即不在目標(biāo)序列進(jìn)行切割等[7-8]，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用?？茖W(xué)工作者就針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行了研究和改進(jìn)，并發(fā)展了該技術(shù)的一些新應(yīng)用。

為了減少CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，雙切口技術(shù)是一個(gè)進(jìn)步雙切開(kāi)技術(shù)，可以使Cas9在靶序列的兩端同時(shí)切割，使切割部位有所限制。Ran等發(fā)明了雙切口技術(shù)[8]。該技術(shù)是在目標(biāo)序列的上下各設(shè)計(jì)1個(gè)gRNA，成為1對(duì)gRNA。成對(duì)的gRNA引導(dǎo)Cas9產(chǎn)生雙切口，從而增強(qiáng)CRISPR/Cas9的切割效率、減少脫靶效應(yīng)。目前的CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)普遍采用雙切口設(shè)計(jì)。

雙切開(kāi)技術(shù)雖然提高了靶位點(diǎn)的編輯效率，但是依然無(wú)法完全解決CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶問(wèn)題。那么，就需要針對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行改良，如對(duì)切割酶的改進(jìn)、對(duì)引導(dǎo)序列的改進(jìn)等?？茖W(xué)家努力進(jìn)行Cas9的改良或者尋找新的切割蛋白，以改進(jìn)CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性和適用性。Kleinstiver等突變了原始的釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)，使其成為具有較高特異性的突變體，得到的D1135E SpCas9突變體可以改進(jìn)Cas9的特異性，同時(shí)還改變了其PAM序列要求，可以切割具有NAG和NGA PAM的序列[9-10]。進(jìn)一步對(duì)SpCas9進(jìn)行改良，獲得了eSpCas9和SpCas9-HF突變體。這些突變體能夠降低突變體蛋白與目標(biāo)DNA之間的非特異結(jié)合。與野生型比較，在單個(gè)gRNA的引導(dǎo)下，超過(guò)85%的SpCas9-HF1可以保持在目標(biāo)序列部位。采用標(biāo)準(zhǔn)的sgRNA靶定非重復(fù)序列，Cas9-HF1幾乎可以排除任何脫靶事件[10]。Cas9-HF1如果能夠被普遍應(yīng)用的話，就可以大大提高研究者對(duì)目標(biāo)基因的編輯能力，而且能夠降低脫靶效應(yīng)。然而，目前Cas9-HF1尚在部分實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究，并未大面積推廣。人們也要考慮Cas9-HF1是不是在不同物種的不同類型細(xì)胞中都有如此之高的工作效率，也許還要進(jìn)一步的改進(jìn)。

對(duì)Cas9的改造還有改變其切割能力等，例如使其成為DNA單鏈切割酶，或僅利用其作為結(jié)合目標(biāo)部位的蛋白而與其他DNA切割酶重組。一些研究者就使Cas9突變成為切口酶Cas9n[4，8，11]，這種酶僅在DNA上產(chǎn)生一個(gè)單鏈的切口，而不是雙鏈斷裂。這些突變體是RuvC或HNH突變體，在成對(duì)的gRNA引導(dǎo)下，通過(guò)成對(duì)的單鏈切口，產(chǎn)生同源重組或非同源的末端連接，產(chǎn)生基因的突變，其同源重組效率與原始的Cas9相同，但脫靶效應(yīng)降低了50～1 500倍，用4個(gè)gRNA，針對(duì)基因區(qū)域上下各1對(duì)，Cas9n在HEK 293FT細(xì)胞中可引起6 kb的基因去除[8，11]。也有科研人員使失去切割活性的Cas9(dCas9)與其他DNA切割酶如FokⅠ結(jié)合，構(gòu)成融合的重組酶dCas9-FokⅠ，稱為RNA引導(dǎo)的FokⅠ核酸酶(RFN)[12-14]。FokⅠ是非特異性的核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在鋅指核酸酶(ZFN)和TALEN中得到應(yīng)用[1]。這是利用dCas9在gRNA引導(dǎo)下與目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合，從而用FokⅠ進(jìn)行切割，該方法與Cas9n相比較，特異性稍強(qiáng)[13]。這只是改進(jìn)，但脫靶問(wèn)題依然存在。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9識(shí)別具有NGG的PAM位點(diǎn)。但在某些情況下，基因組特定部位缺乏該P(yáng)AM，就使得Cas9無(wú)法應(yīng)用。因此，需要新的Cas蛋白，使科研人員對(duì)任意基因組序列能夠進(jìn)行編輯。一種方法就是Cas9基因突變，另一種方法就是尋找新的替代蛋白。經(jīng)過(guò)基因工程改良，現(xiàn)在已經(jīng)有識(shí)別多種PAM的改進(jìn)型Cas9蛋白[15-17]，如 VRQR-SpCas9、VRER-SpCas9、EQR-SpCas9來(lái)源于原始的SpCas9，分別識(shí)別NGA、NGCG和NGAG位點(diǎn)。在不同細(xì)菌中存在的Cas9具有不同的識(shí)別位點(diǎn)特異性?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌的Cas9[15-16]，如嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9(StCas9)-CRISPR1識(shí)別N2AGAAW(W=A/T)，SthCas9-CRISPR3識(shí)別NGGNG；金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SaCas9識(shí)別N2GRRT(R=A/G)，SaCas9的突變體KKH-SaCas9識(shí)別N2NRRT(R=A/G)；腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)的NmCas9識(shí)別N4GMTT(M=A/C)；側(cè)孢芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)Cas9(BlatCas9)識(shí)別N4CND(D=A/G/T)；新兇手弗氏菌(Francisellanovicida)的FnCas9識(shí)別NGG，其RHA突變體識(shí)別YG(Y=C/T)；氨基酸球菌Acidaminococcussp. BV3L6和毛螺菌LachnospiraceaebacteriumND206的Cpf1(AsCpf1和LbCpf1)識(shí)別TTTN[17]。利用AsCpf1和LbCpf1已經(jīng)在人和小鼠細(xì)胞中進(jìn)行了基因編輯，并且已經(jīng)獲得了基因編輯的小鼠[18-19]，其脫靶率低于Cas9，但編輯效率也略低于Cas9。通過(guò)原有Cas9的改進(jìn)和新的Cas蛋白使得CRISPR技術(shù)中識(shí)別位點(diǎn)的限制得到部分改善，人們可以有一定的隨機(jī)性來(lái)選擇靶位點(diǎn)。但是，同一個(gè)Cas蛋白只能識(shí)別一個(gè)PAM位點(diǎn)，針對(duì)不同位點(diǎn)需要不同的Cas蛋白。這依然不能做到對(duì)任意基因序列的編輯，科學(xué)工作者還要不斷探索，尋求新的基因編輯工具。

除了改變Cas9蛋白外，改進(jìn)向?qū)NA(gRNA)的序列和結(jié)構(gòu)也是改善CRISPR/Cas系統(tǒng)的途徑[20]。目前，gRNA含有約20個(gè)堿基目標(biāo)序列的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA，可組成1個(gè)單鏈RNA(sgRNA)，易于設(shè)計(jì)與合成。不同的核酸酶需要不同的sgRNA[16，21]。sgRNA可以在體外由RNA聚合酶合成，也可以在U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，在細(xì)胞內(nèi)合成。不同的sgRNA引導(dǎo)的基因編輯效率不同，一些sgRNA甚至難以奏效。Liu等測(cè)試了218個(gè)sgRNA，但其中89個(gè)沒(méi)有作用。引起脫靶的原因包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、向?qū)NA的核酸組成及其長(zhǎng)度等[22]。Nowak等介紹了對(duì)sgRNA的一些修飾，包括對(duì)前后序列、莖環(huán)、間隔序列等的增加、減少和改變[21]。Xu等對(duì)sgRNA的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了物理學(xué)研究，認(rèn)為Cas9的切割與sgRNA的折疊有關(guān)，并且發(fā)展了一個(gè)新的預(yù)測(cè)sgRNA脫靶效應(yīng)的工具[23]。研究者可以利用該網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇特異性強(qiáng)、效率高的sgRNA，促進(jìn)基因編輯工作。

研究者還對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用手段或者方法進(jìn)行了改進(jìn)，以促進(jìn)該系統(tǒng)的編輯效率。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)時(shí)，最初的方法是Cas9和sgRNA進(jìn)行共注射。人們把Cas9質(zhì)?；蝮w外合成的mRNA或者重組的蛋白質(zhì)，與體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA或sgRNA質(zhì)粒一起注射或轉(zhuǎn)入細(xì)胞或者胚胎。但是，Ablain等設(shè)計(jì)了一個(gè)更為巧妙的質(zhì)粒[24]。在這個(gè)質(zhì)粒中，有U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA合成，有組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)，有廣泛表達(dá)的報(bào)告基因gfp。只要改變載體中的目標(biāo)基因的sgRNA序列及組織特異啟動(dòng)子序列，就可以在任何組織細(xì)胞中特異性地進(jìn)行基因編輯。Miller等報(bào)導(dǎo)了一種新材料，即兩性離子氨基酸脂類(ZALs)，可以同時(shí)輸送長(zhǎng)片段RNA，如Cas9 mRNA和sgRNA；ZAL的納米顆粒(ZNP)可以向細(xì)胞輸送低濃度的sgRNA(15 nm)而減少90%以上的蛋白質(zhì)表達(dá)；ZNP介導(dǎo)的低濃度(體外<600 pmol/L、體內(nèi) 1 mg/kg)的mRNA轉(zhuǎn)移，卻引起蛋白質(zhì)的大量表達(dá)；采用靜脈注射，利用ZNP介導(dǎo)Cas9 mRNA和sgLoxP，在floxed tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的肝、腎和肺中實(shí)現(xiàn)了報(bào)告基因tdTomato的表達(dá)[25]。這使得采用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因治療更為方便。

CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可以用于單基因的編輯和改變，還可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的修飾和編輯。Yan等報(bào)導(dǎo)了一個(gè)新的基因編輯策略，建立了一個(gè)質(zhì)粒，使多個(gè)基因的sgRNA和shRNA在U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[26]。細(xì)胞中的核糖核酸酶Ⅲ Drosha可以把sgRNA-shRNA剪切開(kāi)來(lái)，sgRNA引導(dǎo)Cas9進(jìn)行DNA雙鏈切割，shRNA干擾其mRNA。他們對(duì)3個(gè)基因同時(shí)編輯的效率是9%。引入DNA連接酶IV(LIG4)的shRNA后，以同源修復(fù)(HDR)為基礎(chǔ)的精確基因編輯效率提高了2倍。哈佛大學(xué)學(xué)者采用CRISPR編輯方法，在細(xì)胞中同時(shí)破壞了豬細(xì)胞基因組中的62個(gè)PERV(豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒)序列，這些位點(diǎn)對(duì)用豬進(jìn)行人體器官移植具有潛在的危害[6]。該技術(shù)的成功為用豬做人體器官移植的異源供體掃清了一個(gè)障礙，大大節(jié)省了進(jìn)行多個(gè)基因編輯時(shí)的時(shí)間和人工成本，提高了CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作效率。

除了基因編輯，CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA編輯、單核苷酸的改變(SNP)研究等，大大促進(jìn)了CRISPR/Cas的應(yīng)用范圍。

基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控就是使基因表達(dá)增強(qiáng)或降低。科學(xué)工作者使Cas9失去核酸酶活性dCas9，但可以識(shí)別和結(jié)合sgRNA。在gRNA的引導(dǎo)下，dCas9與基因結(jié)合，不切割DNA，但卻能阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，抑制基因表達(dá)?；蛘?，在dCas9上連接轉(zhuǎn)錄激活蛋白如VP64，當(dāng)識(shí)別并結(jié)合gRNA后，就會(huì)促進(jìn)RNA聚合酶與基因的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)基因表達(dá)[4]。

Cas9可以作為RNA編輯的工具。參照sgRNA-Cas9的基因組編輯，科學(xué)家設(shè)計(jì)了1個(gè)較短的DNA雙鏈，作為sgRNA結(jié)合的輔助物，而sgRNA的目標(biāo)序列與目標(biāo)RNA相匹配。同時(shí)把sgRNA、DNA短鏈和Cas9引入細(xì)胞，Cas9就可以在sgRNA引導(dǎo)下，切割單鏈RNA。O’Connell等用這種方法，在Hela細(xì)胞中進(jìn)行了GAPDH mRNA的剪切[27]。Shmakov等把發(fā)現(xiàn)的53個(gè)CRISPR-Cas蛋白分為3組，分別是C2c1、C2c2和C2c3[28]。其中，C2c2很獨(dú)特，其目標(biāo)不是雙鏈DNA，而是單鏈RNA，可以用于基因敲降。有研究利用纖毛菌(Leptotrichiashahii)的C2c2(LshC2c2)，在細(xì)菌中進(jìn)行報(bào)告基因RFP mRNA的敲降，證實(shí)了C2c2的RNA編輯能力和基因表達(dá)調(diào)控能力[29]。C2c2還含有另一個(gè)RNase活性，可以產(chǎn)生成熟的crRNAs。C2c2可以從一個(gè)單一的轉(zhuǎn)錄本里面，產(chǎn)生多個(gè)crRNAs，進(jìn)行RNA的編輯。那么，利用C2c2就可以進(jìn)行高通量的基因轉(zhuǎn)錄水平的篩選和功能研究。

利用CRISPR技術(shù)，還可以進(jìn)行單核苷酸的編輯。細(xì)胞中存在一些核苷脫氨酶，如胞苷脫氨酶等。胞苷脫氨酶包括活化誘導(dǎo)脫氨酶(AID，海鰻PmCDA1)、載脂蛋白B mRNA編輯酶(APOBEC)等，可以使胞嘧啶(C)脫氨成為尿嘧啶(U)，尿嘧啶在細(xì)胞DNA修復(fù)時(shí)就會(huì)變成胸腺嘧啶(T)；這樣基因序列就從C：G變?yōu)門：A[30-33]。作用于RNA的腺苷脫氨酶(ADARs)使腺苷(A)脫氨成為肌酐(I)，肌酐類似于鳥(niǎo)苷(G)與胞苷(C)配對(duì)；經(jīng)過(guò)1次基因組復(fù)制，就會(huì)使DNA序列從A：T變?yōu)镚：C[34]。Nishida等把失去核酸酶活性的Cas9與PmCDA1重組成融合蛋白，在sgRNA的引導(dǎo)下，使距離PAM 18個(gè)堿基位置上下的堿基發(fā)生了C到T的點(diǎn)突變[32]。Komor等重組了APOBEC1-dCas9，在人和小鼠細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了非結(jié)構(gòu)改變的C>T點(diǎn)突變[31]。Yang等把脫氨酶與轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子(TALE)或者鋅指蛋白(ZF)重組，同樣在人細(xì)胞或大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了C到T的點(diǎn)突變，人細(xì)胞中的突變率為2.5%；但是，他們發(fā)現(xiàn)在靶位點(diǎn)的上游150 bp有脫靶的脫氨作用，甚至于在全基因組發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性的C、T突變[33]?；蚪M中存在許多的SNP，不同的SNP具有不同的基因活性，甚至與遺傳病都有聯(lián)系。那么，利用這些脫氨酶與Cas蛋白的結(jié)合，就能夠促進(jìn)SNP的研究，進(jìn)而促進(jìn)遺傳病等的研究。但是，脫靶效應(yīng)卻大大阻礙了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，需要進(jìn)一步研究該技術(shù)，使其只能在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變，而不是全基因組的改變。

在科學(xué)工作者的努力下，CRISPR技術(shù)功能不斷被挖掘，其應(yīng)用也不斷擴(kuò)大。CRISPR技術(shù)甚至已經(jīng)應(yīng)用于人類胚胎和人體基因的編輯[35-37]。Liang等進(jìn)行了人類3原核受精卵的基因編輯，CRISPR/Cas9有效編輯了人內(nèi)源的β球蛋白基因(HBB)，但同源重組修復(fù)效率比較低，脫靶效應(yīng)明顯[35]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了一個(gè)人體基因編輯的研究計(jì)劃[36]。該計(jì)劃希望能夠用CRISPR來(lái)編輯人體的免疫細(xì)胞T細(xì)胞，將基因修飾后的T細(xì)胞灌注回病人體內(nèi)，進(jìn)而來(lái)治療人類癌癥、骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤。2017年，美、韓、中科學(xué)家合作，對(duì)人iPS細(xì)胞和人類胚胎進(jìn)行了MYBPC3基因修正工作[37]。CRISPR/Cas9方法在合子中的修正效率達(dá)到72%[37]。該報(bào)道未見(jiàn)明顯的脫靶效應(yīng)，但是依然存在NHEJ現(xiàn)象，該研究對(duì)脫靶效應(yīng)的分析也不是很全面、徹底。如果CRISPR/Cas技術(shù)完全克服了未知的脫靶效應(yīng)，對(duì)于人類遺傳病的治療當(dāng)然是非常好的。但是，脫靶效應(yīng)使得該技術(shù)不能應(yīng)用于臨床，因?yàn)椴豢深A(yù)期的脫靶效應(yīng)可能會(huì)引起其他基因的改變，從而產(chǎn)生未能控制的效果，那就是解決了一個(gè)基因的問(wèn)題而引起了其他基因的改變。從倫理學(xué)上來(lái)講，現(xiàn)在大家還沒(méi)有形成一個(gè)共識(shí)，許多人還不支持對(duì)人類胚胎進(jìn)行基因的改變。雖然對(duì)人類遺傳病的根治看見(jiàn)了曙光，但是由于倫理原因和脫靶效應(yīng)等技術(shù)原因，目前還不能進(jìn)入臨床應(yīng)用研究。人們可以期待在該技術(shù)成熟以及倫理共識(shí)達(dá)成以后，對(duì)人類生活的改變和疾病的治療。

2 NgAgo技術(shù)

一個(gè)新的基因編輯工具，DNA介導(dǎo)的NgAgo曾被發(fā)表[38]。目前，該論文已經(jīng)被撤稿[39]，但由于其引起的轟動(dòng)效應(yīng)，有必要在這里進(jìn)行介紹，使人們進(jìn)一步思考基因編輯工具的挖掘以及科研工作。正如撤稿聲明中所說(shuō)的，“發(fā)表論文不是研究工作的結(jié)束，而是研究工作的開(kāi)始”。NgAgo是一種耐熱古細(xì)菌Natronobacteriumgregoryi的Argonaute(Ago)蛋白的簡(jiǎn)稱。Makarova等報(bào)導(dǎo)了原核生物的Ago同源蛋白可以作為細(xì)菌防御外來(lái)入侵的基因工具[40]。原核Ago具有核酸酶活性，可以在RNA或DNA的引導(dǎo)下，切割外來(lái)的基因或質(zhì)粒。Olovnikov等發(fā)現(xiàn)球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)的Ago(RsAgo)在RNA引導(dǎo)下，可以干擾質(zhì)粒DNA[41]。Swarts等發(fā)現(xiàn)嗜熱棲熱菌[ThermusthermophilusAgo(TtAgo)]可以在5′磷酸化的單鏈DNA(ssDNA，稱為干涉DNA-siDNA)的引導(dǎo)下，切割單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)[42]；Swarts等還發(fā)現(xiàn)嗜熱古細(xì)菌Pyrococcusfuriosus的Ago(PfAgo)也只可以在siDNA的引導(dǎo)下，切割ssDNA和dsDNA[43]。但是，TtAgo和PfAgo只能在高溫下工作，TtAgo切割ssDNA的溫度≥20 ℃，切割質(zhì)粒DNA的溫度≥65 ℃。除特殊的耐熱細(xì)菌等生物外，一般的生物細(xì)胞的生理溫度都比較低，人細(xì)胞的生理溫度為37 ℃。因此，TtAgo和PfAgo不能應(yīng)用于一般生物細(xì)胞的基因編輯，不能成為廣泛使用的基因編輯工具。

論文中報(bào)道NgAgo可以在37 ℃下的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)；NgAgo可以與24個(gè)堿基的5′磷酸化的單鏈DNA(gDNA)結(jié)合，并在其引導(dǎo)下切割基因組雙鏈DNA，引起插入或切除等突變[38]。研究還宣稱，NgAgo-gDNA系統(tǒng)不需要PAM序列，允許引導(dǎo)-目標(biāo)的堿基錯(cuò)配，并且對(duì)高(G+C)含量的基因組序列都可以高效編輯，是一個(gè)新的基因編輯工具[38]。如果像該文所報(bào)道的那樣，NgAgo就可以完全取代CRISPR/Cas9技術(shù)，成為理想的基因編輯工具，使人們自由編輯任意基因片段。因此，該文引起了轟動(dòng)和廣泛關(guān)注。

全世界科學(xué)家爭(zhēng)相進(jìn)行重復(fù)研究，但許多實(shí)驗(yàn)室宣告失敗，無(wú)法重復(fù)該結(jié)果。隨后，該文引起質(zhì)疑與討論。不同的科學(xué)家團(tuán)隊(duì)先后在Protein and Cells[44]、Nature Biotechnology[45]和Plos One[46]發(fā)表論文，認(rèn)為NgAgo在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能進(jìn)行DNA編輯，認(rèn)為此研究不可重復(fù)。

Qi等在斑馬魚(yú)中進(jìn)行了試驗(yàn)[47]。他們把體外合成的NgAgo mRNA與針對(duì)目標(biāo)基因fabp11a的gDNA一起注射受精卵，結(jié)果引起斑馬魚(yú)眼睛不能正常發(fā)育。但是，fabp11a的基因組序列并沒(méi)有任何改變，而是fabp11a的mRNA水平下降，即NgAgo-gDNA干擾了基因的表達(dá)。他們還進(jìn)行了其他幾個(gè)基因如ta、kdrl、lama1和flt1的試驗(yàn)，結(jié)果都能引起基因表達(dá)的下降。這些結(jié)果說(shuō)明，NgAgo不能進(jìn)行基因組編輯，但可能是一個(gè)很方便的基因敲降工具。Sunghyeok等研究證明，NgAgo和其他原核生物Ago蛋白不同，不能切割DNA但能切割RNA[48]。NgAgo能在DNA引導(dǎo)下，作為核酸內(nèi)切酶切割RNA。NgAgo的向?qū)NA可以是5′羥基化的或5′磷酸化的寡脫氧核糖核苷酸片段(ODNs)。Sunghyeok等的研究解決了NgAgo進(jìn)行基因敲降的機(jī)制問(wèn)題，也解釋了其他學(xué)者能夠重復(fù)細(xì)胞中GFP表達(dá)量的減少而觀察不到基因插入或切除現(xiàn)象的問(wèn)題。

因此，NgAgo-gDNA可以作為基因敲降工具進(jìn)行使用。那么，對(duì)NgAgo的研究就結(jié)束了嗎？可能未必，也許對(duì)NgAgo、TtAgo和PfAgo的改進(jìn)可以使Ago蛋白真能實(shí)現(xiàn)在普通生物中的基因編輯功能，但這需要一個(gè)艱苦的探索過(guò)程和一段較長(zhǎng)的時(shí)間。該報(bào)道也提示科學(xué)工作者利用自然資源，進(jìn)行基因編輯工具的進(jìn)一步挖掘，向自然學(xué)習(xí)，進(jìn)而改造自然。

3 其他基因編輯技術(shù)

除了Ago蛋白外，眾多科學(xué)家都在尋找新的基因編輯工具。Xu等開(kāi)創(chuàng)性地把翹尾核酸內(nèi)切酶1(flap endonuclease-1，F(xiàn)EN-1)與TALEN中使用的Fok I的切割結(jié)構(gòu)域(Fn 1)結(jié)合成為重組核酸內(nèi)切酶[49]。FEN-1可以識(shí)別末端不匹配的翹尾結(jié)構(gòu)，F(xiàn)n 1可以對(duì)DNA進(jìn)行切割，他們稱這個(gè)重組酶為結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(structure-guided endonuclease，SGN)。SGN需要一個(gè)向?qū)NA(gDNA)與目標(biāo)DNA配對(duì)，但其3′末端不與目標(biāo)DNA配對(duì)，形成翹尾結(jié)構(gòu)。SGN可以識(shí)別gDNA的翹尾結(jié)構(gòu)，并由二聚體化的Fn1對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，因此SGN及gDNA需要成對(duì)使用。SGN對(duì)gDNA尾部堿基沒(méi)有要求，但需要20個(gè)堿基以上，才能在離翹尾9～10個(gè)堿基左右的位點(diǎn)進(jìn)行切割。體內(nèi)試驗(yàn)表明，SGN的靶標(biāo)DNA需要一個(gè)32～50 bp的間隔區(qū)。Xu等用SGN對(duì)斑馬魚(yú)znf703和cyp26b1進(jìn)行了編輯，其效率為1%(znf703)～10%(cyp26b1)，但卻移除了znf703基因的754 bp和下游的 11 bp，移除了cyp26b1基因的2 610 bp[49]?？梢?jiàn)，SGN的編輯效率較CRISPR/Cas9低，且編輯去除的序列長(zhǎng)度不受控制。工具是要能夠被控制的，不受控制的基因序列切除使其不能成為可靠信賴的基因編輯工具。因此，該技術(shù)還需要進(jìn)一步的研究和完善，發(fā)現(xiàn)其工作過(guò)程中的機(jī)制及可控制性。在該技術(shù)可控以后，才能成為新的廣泛使用的基因編輯工具。

Zheng等報(bào)導(dǎo)利用ADAR對(duì)基因組進(jìn)行編輯的技術(shù)[34]。人有2個(gè)ADAR，分別是ADAR1和ADAR2。ADAR蛋白含一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBDs)和C端的脫氨酶結(jié)構(gòu)域。ADAR可以在RNA二聚體時(shí)，將A轉(zhuǎn)變?yōu)镮。Zheng等發(fā)現(xiàn)ADAR在DNA/RNA雜合體時(shí)，可以使DNA的dA脫氨成為dI，從而實(shí)現(xiàn)dA到dG的轉(zhuǎn)變[34]。他們用ADAR1和ADAR2都實(shí)現(xiàn)了DNA/RNA雜合體中DNA的突變，然后，成功實(shí)現(xiàn)了24 nt gRNAs引導(dǎo)下的M13噬菌體單鏈DNA的突變。今后，有可能使用ADAR的脫氨酶結(jié)構(gòu)域或者全序列作為基因編輯工具，在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)gRNA引導(dǎo)下的dA到dG的定點(diǎn)突變。

Bentin等發(fā)現(xiàn)了肽核酸(peptide nucleic acid，簡(jiǎn)稱PNA)，可以侵入雙鏈DNA[50]。近幾年科研者也相繼發(fā)現(xiàn)了肽核酸可以作為基因編輯工具，Komiyama等發(fā)明了一個(gè)人工限制性DNA剪刀(artificial restriction DNA cutter，簡(jiǎn)稱ARCUT)[51]。ARCUT是化學(xué)合成的偽互補(bǔ)(pseudo-complementary)PNA(pcPNA)和Ce(IV)/EDTA復(fù)合物，可以引起DNA雙鏈斷裂(DSB)。Bahal等用納米顆粒把g替代的尾夾(g-substituted tail-clamp)PNA(gtcPNA)輸送到培養(yǎng)的細(xì)胞或小鼠中，引起了基因編輯[52]。

Suzuki等發(fā)現(xiàn)5′末端突出的復(fù)合物DNA(TD)可以引起目標(biāo)基因的改變，他們把一個(gè)已切開(kāi)或沒(méi)有切開(kāi)的質(zhì)粒和針對(duì)質(zhì)粒靶標(biāo)的TD，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的位置發(fā)生了改變，質(zhì)粒的切割增加了7倍的序列轉(zhuǎn)變效率[53]。這表明后期如果引入TD的同時(shí)引入核酸酶，可以增強(qiáng)基因編輯的效率。該研究為基因編輯技術(shù)的改進(jìn)提供了一個(gè)新的思路。

4 基因編輯技術(shù)的展望

基因編輯技術(shù)使得人們可以針對(duì)性地改變生物細(xì)胞的基因，從而改變細(xì)胞中該基因的表達(dá)。基因編輯技術(shù)有廣闊的應(yīng)用前景，可以應(yīng)用于基因功能研究、發(fā)育生物學(xué)研究、動(dòng)植物甚至于微生物的基因改造及分子育種、基因治療、癌癥治療等多個(gè)方面[54]。因此，基因編輯技術(shù)的研究成為了一個(gè)熱點(diǎn)生物學(xué)問(wèn)題。世界各國(guó)科學(xué)家爭(zhēng)相進(jìn)行新基因編輯工具的尋找或改造，以期獲得編輯效率高、特異性強(qiáng)、不脫靶、易用性好、序列要求低的基因編輯工具。隨著科學(xué)工作者的不斷努力，新的基因編輯工具和編輯手段將不斷涌現(xiàn)。科學(xué)家終將獲得理想的基因編輯工具。在這個(gè)不斷進(jìn)步的過(guò)程當(dāng)中，科學(xué)家要向自然學(xué)習(xí)，從微生物到高等生物的蛋白質(zhì)庫(kù)中尋找合適的工具蛋白；科學(xué)家也可以對(duì)找到的這些工具蛋白進(jìn)行改造，包括突變、組合等多種途徑；不同學(xué)科、不同國(guó)度的科學(xué)家也要通力合作，開(kāi)發(fā)新的工具或輔助工具。讓我們期待理想基因編輯工具到來(lái)的那一天。