朱來(lái)華,王 艷,季新成,周仲芳,顧志軍,劉金龍,竇樹(shù)龍,顧炳泉
(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266002;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200035;3.國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,北京 100088;4.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東廣州 510623;5.無(wú)錫出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇無(wú)錫 214101;6.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇南通 226004)
馬傳染性貧血(Equine infectious anemia,EIA)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)引起馬屬動(dòng)物的一種急性烈性傳染病。EIA的傳播途徑是多方面的,主要是通過(guò)吸血昆蟲(chóng)(虻、蚊、蠓等)的叮咬而機(jī)械性傳染,也可經(jīng)消化道和交配傳染,還可經(jīng)病毒污染的醫(yī)療器械散播傳染[1]。EIA在全球大多數(shù)國(guó)家呈地方性流行;我國(guó)EIA的陽(yáng)性檢出率逐年下降,有望在2020年消滅EIA。
EIA在美國(guó)呈散發(fā)性流行,在各州均有零星發(fā)生。為了控制EIA,美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United States department of agriculture,USDA)動(dòng)植物衛(wèi)生檢驗(yàn) 署(Animal and plant health inspection service,APHIS)獸醫(yī)局(Veterinary services,VS)參考了美國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生協(xié)會(huì)(Animal health association)、美國(guó)馬委員會(huì)(American horse council)、美國(guó)馬獸醫(yī)協(xié)會(huì)(American association of equine practitioners)的建議,制定了EIA監(jiān)測(cè)與防控程序,并在全美國(guó)實(shí)施[2]。
USDA對(duì)EIA實(shí)施被動(dòng)監(jiān)測(cè)程序,規(guī)定了監(jiān)測(cè)頻率、實(shí)驗(yàn)室、檢測(cè)方法與試劑、檢測(cè)人員及送樣人員要求。
USDA統(tǒng)一要求每年至少檢測(cè)1次,在高風(fēng)險(xiǎn)州(如EIA地方性流行地區(qū))要求每6個(gè)月檢測(cè)1次。強(qiáng)制性要求在馬匹參加展覽或競(jìng)賽等事項(xiàng)、跨州調(diào)運(yùn)、變更馬主、進(jìn)入拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng)、配種前,必須攜帶符合UADA要求的陰性檢測(cè)報(bào)告。USDA規(guī)定,送樣人員可以是州或聯(lián)邦的動(dòng)物衛(wèi)生官員或USDA/APHIS/VS認(rèn)可的獸醫(yī)。
EIA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可以是官方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室或私立實(shí)驗(yàn)室,但必須經(jīng)過(guò)USDA/APHIS/VS認(rèn)可,并通過(guò)美國(guó)國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(National veterinary services laboratories,NVSL)組織的年度能力驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員必須接受NVSL培訓(xùn)并通過(guò)能力驗(yàn)證試驗(yàn)。EIA診斷的實(shí)驗(yàn)室方法和試劑需要經(jīng)USDA批準(zhǔn)登記,其檢測(cè)方法主要包括ELISA、AGID及免疫印跡試驗(yàn)。
官方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室包括NVSL和肯塔基大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室以及聯(lián)邦/州實(shí)驗(yàn)室。NVSL是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)EIA參考實(shí)驗(yàn)室,也是USDA的參考和確診實(shí)驗(yàn)室,主要提供標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑、診斷試驗(yàn)培訓(xùn)、能力驗(yàn)證、實(shí)施科學(xué)研發(fā)工作以提高診斷技術(shù)??纤髮W(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室是美國(guó)的國(guó)家級(jí)EIA參考實(shí)驗(yàn)室,負(fù)責(zé)科研和咨詢(xún)。私立實(shí)驗(yàn)室也可以進(jìn)行EIA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷,但必須經(jīng)USDA/APHIS/VS認(rèn)可與批準(zhǔn)。無(wú)論是官方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室還是私立檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室,都需按照NVSL提供的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序,使用USDA注冊(cè)登記的標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行檢測(cè),并按照規(guī)定的渠道報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)室必須使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,每年參加并通過(guò)NVSL組織的能力驗(yàn)證,并接受NVSL至少2年1次的檢查審核。
1.2.1 官方實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員 至少有1人接受NVSL培訓(xùn)并通過(guò)能力驗(yàn)證試驗(yàn),掌握EIA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法,并能對(duì)實(shí)驗(yàn)室其他技術(shù)人員進(jìn)行再培訓(xùn)。
1.2.2 私立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員 在開(kāi)展檢測(cè)活動(dòng)前,接受NVSL檢查審核,所有技術(shù)人員接受NVSL培訓(xùn)并通過(guò)能力驗(yàn)證試驗(yàn),掌握EIA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法。
實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法(ELISA、AGID和免疫印跡試驗(yàn))需要經(jīng)USDA/APHIS/VS批準(zhǔn)登記,才能應(yīng)用于EIA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷。
1.3.1 ELISA USDA批準(zhǔn)了4種用于EIA診斷的ELISA試劑盒,1種為競(jìng)爭(zhēng)性ELISA,另外3種為非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和2種非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)p26核心蛋白抗原產(chǎn)生的抗體。另1種非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)抗體為p26核心蛋白和gp45病毒跨膜蛋白產(chǎn)生的抗體。ELISA反應(yīng)快速、靈敏,很少出現(xiàn)假陰性,但可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。假陽(yáng)性結(jié)果可以通過(guò)AGID或其他參考實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)確認(rèn)[3-5]。
1.3.2 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID) AGID針對(duì)EIAV p26抗原(主要核心蛋白),與血液中存在的EIAV具有高度相關(guān)性,是國(guó)際上廣泛接受的EIA實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法,是EIA陽(yáng)性結(jié)果確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)室方法,因此被稱(chēng)為EIA診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。AGID很少出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,即使出現(xiàn)也是由于技術(shù)人員錯(cuò)誤操作引起的,可通過(guò)反復(fù)檢測(cè)來(lái)修正。假陰性結(jié)果出現(xiàn)可能是由于抗體滴度過(guò)低,或通常是由于對(duì)結(jié)果觀察的錯(cuò)誤解讀引起[5-6]。
1.3.3 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)室方法 免疫印跡試驗(yàn)(Immunoblot test),或稱(chēng)蛋白轉(zhuǎn)印試驗(yàn)(Western blot test),應(yīng)用EIAV的3種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(囊膜蛋白gp90、跨膜蛋白gp45、主要核衣殼蛋白p26),比ELISA、AGID具有更高的敏感性和特異性。但因技術(shù)復(fù)雜、操作繁瑣、費(fèi)用昂貴,加之免疫印跡試驗(yàn)不是認(rèn)可的官方實(shí)驗(yàn)室方法。經(jīng)USDA/APHIS/VS批準(zhǔn),只能在NVSL和肯塔基大學(xué)進(jìn)行,可以用于確認(rèn)模棱兩可的結(jié)果[7]。
EIA實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果必須按USDA統(tǒng)一格式的官方實(shí)驗(yàn)室表格(Official laboratory form)進(jìn)行提交,如VS表格10-11:EIA實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(The VS Form 10-11:Equine Infectious Anemia Laboratory Test),由認(rèn)可獸醫(yī)簽署,認(rèn)可獸醫(yī)還可以要求馬主或馬主代理人共同簽名確認(rèn),偽造、變?cè)毂砀駥儆谛淌路缸铮梢蕴幰粤P款或拘役。
馬匹在參加展覽或競(jìng)賽等事項(xiàng)、跨州移動(dòng)、變更馬主、進(jìn)入拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng)、配種前以及從外部農(nóng)場(chǎng)引入、從國(guó)外進(jìn)口前,必須獲得認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室出具的EIA陰性檢測(cè)報(bào)告。
1.5.1 參加展覽或競(jìng)賽等事項(xiàng)的馬 馬在參加展覽或競(jìng)賽等事項(xiàng)前,必須在當(dāng)?shù)毓芾聿块T(mén)規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行EIA檢測(cè),結(jié)果須為陰性。賽事官員查看有關(guān)文件,確保參加賽事的所有馬的EIA檢測(cè)結(jié)果為陰性。
1.5.2 跨州移動(dòng)的馬 馬在移動(dòng)前12個(gè)月內(nèi)EIA檢測(cè)結(jié)果為陰性,且隨運(yùn)輸工具攜帶準(zhǔn)許移動(dòng)的官方許可證。沒(méi)有陰性檢測(cè)報(bào)告或移動(dòng)許可證的馬,不得進(jìn)行跨州移動(dòng)。
1.5.3 變更馬主的馬 通過(guò)銷(xiāo)售、交換或捐贈(zèng)而改變馬主的馬,在變更前12個(gè)月內(nèi),進(jìn)行EIA檢測(cè),結(jié)果為陰性。在高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的馬,建議新馬主在獲得馬60 d后重新檢測(cè)。所有馬主的變更必須伴有認(rèn)可獸醫(yī)簽發(fā)的證書(shū)。
1.5.4 進(jìn)入拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng)的馬 所有拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng),不管規(guī)模大小,必須獲得州政府的注冊(cè)登記,并保留交易記錄便于追溯。馬在拍賣(mài)或銷(xiāo)售前,進(jìn)行EIA檢測(cè),結(jié)果為陰性。拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng)必須雇傭認(rèn)可獸醫(yī),參與銷(xiāo)售活動(dòng),檢查證明文件的有效性,并對(duì)沒(méi)有陰性檢測(cè)報(bào)告的馬采集血液樣品,送官方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。
1.5.5 進(jìn)入美國(guó)境內(nèi)的馬 不管是臨時(shí)進(jìn)境參加展覽、表演或比賽,還是永久進(jìn)境,在入境美國(guó)前都需要進(jìn)行EIA檢測(cè),結(jié)果需為陰性。永久進(jìn)境的馬在入境后還需進(jìn)行隔離檢疫,并接受實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),結(jié)果需為陰性。
1.5.6 配種前的種馬 馬在配種前1年內(nèi),需接受至少1次EIA檢測(cè),結(jié)果需為陰性。
由于任何年齡階段馬都是EIA易感動(dòng)物,所以都必須進(jìn)行EIA檢測(cè)。幼齡小馬在斷奶時(shí)(小于6月齡),進(jìn)行第一次檢測(cè),然后經(jīng)適當(dāng)?shù)母綦x檢疫(超過(guò)60 d)后,再次檢測(cè)。如果母馬為EIA陽(yáng)性,小馬從初乳獲得EIA被動(dòng)免疫抗體的時(shí)間可能超過(guò)6個(gè)月。在這種情況下,馬駒至少隔離60 d,在隔離結(jié)束后和混群前,檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果母馬為陰性,幼齡小馬,可不檢測(cè)。
USDA規(guī)定的防控程序包括常規(guī)檢測(cè),陽(yáng)性馬及時(shí)處置,同群馬反復(fù)檢測(cè)以及加強(qiáng)生物安全措施。陽(yáng)性馬的處置措施包括陽(yáng)性馬隔離檢疫、永久標(biāo)識(shí)及限制移動(dòng),陽(yáng)性馬只能返回原農(nóng)場(chǎng)、送往科研機(jī)構(gòu)或屠宰場(chǎng)。
馬的州際移動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一為12個(gè)月。根據(jù)當(dāng)?shù)氐娘L(fēng)險(xiǎn)情況,建議對(duì)EIA進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。各個(gè)州可以實(shí)施更嚴(yán)格的防控程序。參加展覽或競(jìng)賽等事項(xiàng)的馬、州際移動(dòng)的馬、變更馬主的馬、進(jìn)入拍賣(mài)或銷(xiāo)售市場(chǎng)的馬以及從外部農(nóng)場(chǎng)引入的馬、從國(guó)外進(jìn)口的馬,需要采集樣品送檢官方實(shí)驗(yàn)室。
一旦確定為陽(yáng)性馬,可以實(shí)施安樂(lè)死、屠宰或隔離檢疫。
2.2.1 隔離檢疫 隔離場(chǎng)所接受官方人員的定期監(jiān)管,防止違反隔離檢疫的有關(guān)規(guī)定。如果官方試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性馬,馬主在得知陽(yáng)性結(jié)果24 h內(nèi)立即隔離陽(yáng)性馬,防止與其它馬的進(jìn)一步接觸。在陽(yáng)性馬所在地約180 m內(nèi),與其接觸的同群馬,也實(shí)施單獨(dú)隔離。隔離區(qū)域與其它未接觸馬的距離不少于180 m。Barros等認(rèn)為,虻科昆蟲(chóng)(如馬虻、鹿虻、牛虻等)的機(jī)械傳播距離不超過(guò)50 m,而建議180 m應(yīng)是有效的安全距離[8]。
2.2.2 反復(fù)檢測(cè)并移除陽(yáng)性馬 在得知陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果24 h內(nèi),移除陽(yáng)性馬,并對(duì)其它同群馬進(jìn)行反復(fù)檢測(cè),間隔30~60 d,或更高的頻率,直到所有與其接觸的馬為陰性。其它同群馬陰性狀態(tài)保持至少60 d,才可解除隔離。
2.2.3 移動(dòng)限制 所有陽(yáng)性馬和同群接觸馬,在檢測(cè)結(jié)果確定后24 h內(nèi)進(jìn)行隔離,限制其移動(dòng)。只有在獲得官方移動(dòng)許可證(APHIS、州獸醫(yī)或認(rèn)可獸醫(yī)簽署)后,受限制的馬才能進(jìn)行州際移動(dòng)。到達(dá)目的地后,繼續(xù)保持陽(yáng)性馬隔離狀態(tài),防止病毒傳播,直到自然死亡、屠宰或安樂(lè)死。陽(yáng)性馬只能移動(dòng)到在聯(lián)邦注冊(cè)的屠宰場(chǎng)、聯(lián)邦批準(zhǔn)的診斷或科研場(chǎng)所及原農(nóng)場(chǎng)。同群的接觸馬,因特殊用途,可以進(jìn)行移動(dòng),但接觸馬必須以15 d的間隔反復(fù)檢測(cè),直到最后脫離接觸后至少60 d一直為陰性,才能進(jìn)行移動(dòng)。
2.2.4 陽(yáng)性馬的標(biāo)識(shí) 由APHIS、州官員代表或認(rèn)可獸醫(yī)對(duì)EIA檢測(cè)陽(yáng)性的馬進(jìn)行永久標(biāo)識(shí),如熱鐵烙印、化學(xué)烙印、冷凍標(biāo)識(shí)。永久標(biāo)識(shí)在陽(yáng)性馬頸部左側(cè),至少5 cm厚。如果是唇部刺青,大小至少為2.54 cm×1.91 cm。如果陽(yáng)性馬直接移動(dòng)到屠宰場(chǎng),可不實(shí)施官方標(biāo)識(shí)。跨州移動(dòng)的馬,必須攜帶APHIS、州官員代表或認(rèn)可獸醫(yī)簽署的移動(dòng)許可證,且必須在起運(yùn)5 d內(nèi)達(dá)到目的地,到達(dá)后立即屠宰。
2.2.5 陽(yáng)性馬的最終目的地 美國(guó)沒(méi)有強(qiáng)制撲殺陽(yáng)性馬的法律規(guī)定,陽(yáng)性馬最終目的地包括返回原農(nóng)場(chǎng)、科研機(jī)構(gòu)或屠宰場(chǎng)。一旦確定為陽(yáng)性馬,可以在原農(nóng)場(chǎng)實(shí)施安樂(lè)死或隔離飼養(yǎng)。原農(nóng)場(chǎng)是指轉(zhuǎn)運(yùn)前所在的農(nóng)場(chǎng)或養(yǎng)殖場(chǎng)所(出生或停留30 d或以上)。如果實(shí)施屠宰,必須在聯(lián)邦或州注冊(cè)的屠宰場(chǎng)屠宰。
嚴(yán)格控制外部人員進(jìn)入。馬用物品、設(shè)備、設(shè)施進(jìn)行清洗、消毒;醫(yī)用物品,如注射器、針頭一次性使用。糞尿、墊料等經(jīng)堆積密封發(fā)酵至少1個(gè)月,以殺滅病毒、媒介昆蟲(chóng)等。對(duì)馬或養(yǎng)殖場(chǎng)噴灑驅(qū)蟲(chóng)劑或殺蟲(chóng)劑,防止蚊、虻等吸血昆蟲(chóng)侵襲馬匹,減少馬暴露于媒介昆蟲(chóng)的機(jī)會(huì)。搞好馬廄及其周?chē)沫h(huán)境衛(wèi)生,清除馬活動(dòng)場(chǎng)所的污水,刈短雜草,減少昆蟲(chóng)孳生和藏匿,對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)及其活動(dòng)場(chǎng)所噴灑驅(qū)蟲(chóng)劑或殺蟲(chóng)劑[9-10]。
在全面分析美國(guó)EIA監(jiān)測(cè)與防控措施及其防控效果的基礎(chǔ)上,借鑒其成功的經(jīng)驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化我國(guó)EIA防控措施,實(shí)現(xiàn)我國(guó)在2020年消滅EIA的目標(biāo)。
抓好監(jiān)測(cè)凈化,加大監(jiān)測(cè)頻率,擴(kuò)大監(jiān)測(cè)范圍和監(jiān)測(cè)數(shù)量。馬在跨省調(diào)動(dòng)、銷(xiāo)售、參加展覽或比賽、配種、引群前,必須獲得認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室出具的EIA陰性檢測(cè)報(bào)告。
對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、檢測(cè)人員、檢測(cè)方法及其試劑進(jìn)行認(rèn)可登記,通過(guò)能力驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等措施保證其檢測(cè)質(zhì)量;強(qiáng)化檢測(cè)技術(shù)的培訓(xùn),確保實(shí)驗(yàn)室具備EIA檢測(cè)的技術(shù)能力。
對(duì)臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為陽(yáng)性動(dòng)物,要嚴(yán)格采取撲殺、無(wú)害化處理等措施,消滅傳染源。馬一旦感染EIAV,就終生帶毒,成為潛在的傳染源,美國(guó)不強(qiáng)制撲殺陽(yáng)性動(dòng)物是EIA在美國(guó)呈散發(fā)性流行的主要原因。
確認(rèn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果后,立即將陽(yáng)性馬移除并撲殺銷(xiāo)毀,并對(duì)同群馬進(jìn)行反復(fù)檢測(cè),間隔30~60 d或更高的頻率,直到所有接觸馬檢測(cè)為陰性。其它同群馬陰性狀態(tài)保持至少60 d,才可以解除隔離措施。
[1] CHEEVERS W M,MCGUIRE T C. Equine infectious anaemia virus:immunopathogenesis and persistence[J].Review of infectious diseases,1985,7(1):83-88.
[2] united ststes department of agriculture. Animal and Plant Health Inspection Service,USDA.Equine infectious anemia uniform methods and rules[EB/OL]. (2007-01-10)[2017-12-10]. http∶//www.aphis.usda.gov/animal_health/animal_diseases/eia/.
[3] SHANE B S,ISSEL C J,MONTELARO R C. Enzymelinked immunosorbent assay for detection of equine infectious anemia virus p26 antigen and antibody[J].Journal of clinical microbiology,1984,19(3):351-355.
[4] SUZUKI T,UEDA S,SAMEJINA T. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of equine infectious anaemia[J]. Veterinary microbiology,1982,7(4):307-316.
[5] PEARSON J E,GIPSON C A. Standardization of equine infectious anemia immunodiffusion and CELISA tests and their application to control of the disease in the United States[J]. Journal of equine veterinary science,1988,8(1):60-61.
[6] COGGINS L,NORCROSS N L,NUSBAUM S R. Diagnosis of equine infectious anaemia by immunodiffusion test[J].American journal of veterinary research,1972,33(1):11-18.
[7] ROSSMANITH W,HORVATH E. A western blot test for the serological diagnosis of equine infectious anemia[J].Journal of veterinary medicine,1989,36(2):49-56.
[8] BARROS A T M,F(xiàn)OIL L D. The influence of distance on movement of tabanids(Diptera:Tabanidae) between horses[J]. Veterinary parasitology,2007,144(3):380-384.
[9] BRANGAN P,BAILEY D C,LARKIN J F,et al.Management of the national programme to eradicate equine infectious anaemia from Ireland during 2006:a review[J]. Equine veterinary journal,2008,40(7):702-704.
[10] KNOWLES R C. An overview of equine infectious anemia control and regulation in the United States[J]. Journal of American veterinary medical association,1984,184(3):289-292.