綜述 審校

隨著對(duì)惡性腫瘤認(rèn)識(shí)的不斷深入，臨床醫(yī)生逐漸發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤診斷時(shí)組織活檢存在弊端，包括組織活檢時(shí)的有創(chuàng)性，在患者預(yù)后監(jiān)測(cè)時(shí)無法重復(fù)取材等問題，使患者無法獲得可持續(xù)性的精準(zhǔn)醫(yī)療。而目前大家所關(guān)注和熱衷的液體活檢，則克服了組織活檢的缺點(diǎn)，為惡性腫瘤的診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供了新的思路。液體活檢包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)和外泌體檢測(cè)。而腫瘤源性外泌體作為腫瘤”母體”細(xì)胞分泌的囊泡樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)所包含的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等信息，在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和化療耐藥等方面發(fā)揮著重要作用［1-6］。本文將外泌體的特性、生物學(xué)作用及在惡性腫瘤包括上皮來源和間葉組織來源惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和應(yīng)用前景進(jìn)行相關(guān)綜述，為腫瘤源性外泌體在骨肉瘤和尤文肉瘤中的應(yīng)用提供參考和思路。

1 外泌體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和提取純化

胞外囊泡是一種小體積的膜狀囊泡，按照產(chǎn)生機(jī)制和直徑的不同，可以分為三類：微囊泡（microparticles/microvesicles）、外泌體（exosomes）和凋亡小體（apoptotic bodies）。外泌體為多形性的囊泡樣小體，可由各類細(xì)胞分泌，發(fā)源于細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)中的晚期內(nèi)體（late endosome或多囊泡內(nèi)體）；直徑30～100 nm；由雙層磷脂分子包裹，形態(tài)呈扁形或球形小體，有些為杯狀；其在體液中的存在形式以球形結(jié)構(gòu)為主，通?？稍谡崽敲芏忍荻热芤褐忻芏?.13～1.19 g/mL獲得富集。外泌體膜表面有一些蛋白，囊泡內(nèi)部包含蛋白、RNA及細(xì)胞因子等物質(zhì)。細(xì)胞通過胞膜內(nèi)吞作用，首先形成早期胞內(nèi)體（early endosome），在胞內(nèi)進(jìn)一步成熟形成晚期胞內(nèi)體（late endosome）和多泡體（multivesicular bodies），通過出芽（budding）作用形成外泌體。外泌體的提取和純化的方法主要包括差速離心聯(lián)合蔗糖密度梯度離心法、超濾密度梯度離心、免疫磁珠提取法和ExoQuick Precipitation提取法，主要依據(jù)外泌體理化特性進(jìn)行分離和提純。

2 腫瘤源性外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用

外泌體同靶細(xì)胞相互作用的機(jī)制包括：1）通過外泌體表面攜帶的功能性蛋白分子與靶細(xì)胞相互作用，并啟動(dòng)功能性信號(hào)傳導(dǎo)過程；2）外泌體同靶細(xì)胞膜相互融合，將其所運(yùn)輸?shù)墓δ苄苑肿印白⑷搿卑屑?xì)胞內(nèi)；3）靶細(xì)胞表面的蛋白受體在同外泌體接觸后，可啟動(dòng)其內(nèi)吞作用，將外泌體所攜帶的生物信息整合入靶細(xì)胞基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和翻譯的各個(gè)層面［7-19］。

腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫捕獲的過程中，其免疫抑制機(jī)制發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞可通過多種免疫抑制分子來削弱機(jī)體的免疫識(shí)別和應(yīng)答過程。有研究［11］顯示腫瘤性外泌體富含多種免疫抑制分子，其中包括FasL、IL-10、TGF-β1和PGE2等細(xì)胞分子。從該角度而言，外泌體可看作是腫瘤細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處播散轉(zhuǎn)移的重要幫兇。

對(duì)于腫瘤細(xì)胞外泌體在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮怎樣的作用，其如何扮演腫瘤細(xì)胞幫兇的角色主要受腫瘤微環(huán)境調(diào)控機(jī)制和所攜帶的蛋白分子的影響。腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的探究是腫瘤學(xué)研究的重要目標(biāo)之一。早年英國醫(yī)生Stephen Paget闡述的腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子與土壤理論”，主張轉(zhuǎn)移需要腫瘤細(xì)胞的傳播即“種子”和受納器官的理想環(huán)境即“肥沃土壤”。而“種子與土壤理論”中的“種子”很可能就是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體。該研究報(bào)道，外泌體膜表達(dá)整合素α6β1和α6β4的乳腺癌細(xì)胞外泌體可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞靶向性轉(zhuǎn)移到肺部，而表達(dá)αvβ5的外泌體會(huì)導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移到肝臟，分別為乳腺癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前提供適宜的微環(huán)境，從而有利于腫瘤細(xì)胞的后續(xù)轉(zhuǎn)移和增殖。目前大量研究證明，腫瘤細(xì)胞可以釋放外泌體，為其侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。作為體液活檢新興的檢測(cè)對(duì)象，其可在血漿、血清、尿液、腹水等體液中檢測(cè)其存在，并有多項(xiàng)研究證明其在體液中的存在水平同腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Melo等［20］報(bào)道基于外泌體標(biāo)志物所建立的非侵入性的胰腺癌的診斷方法，此方法主要依靠檢測(cè)錨定在血液中外泌體質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）來實(shí)現(xiàn)診斷效果。

有研究證實(shí)，吉非替尼聯(lián)合化療治療對(duì)進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌總體生存率改善不明顯。Li等［21］研究結(jié)果顯示，從吉非替尼干預(yù)后的非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞系提取的外泌體可以產(chǎn)生抵抗吉非替尼的抗腫瘤活性，而從化療藥物干預(yù)后的PC9細(xì)胞系提取的外泌體并無此特性，其說明經(jīng)吉非替尼干預(yù)后的非小細(xì)胞肺癌產(chǎn)生的外泌體，可以通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞的自噬來改變其對(duì)順鉑的敏感性。同時(shí)大量研究證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌患者血清或血漿中外泌體水平和其所包含的蛋白組、micro-RNA組表達(dá)特點(diǎn)可以用于患者的診斷和預(yù)后判斷。Kharmate等［22］通過掃描電鏡和外泌體特異性標(biāo)志物等手段對(duì)前列腺癌患者血清、細(xì)胞系上清液進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，上述材料中均可以檢測(cè)到前列腺癌細(xì)胞分泌的外泌體的存在；并且外泌體中同腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的表皮生長因子受體（EGFR）水平明顯升高，證明前列腺癌細(xì)胞分泌的外泌體同其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)。Zhang等［7］比較了204例接受硼替佐米治療的多發(fā)性骨髓瘤患者后發(fā)現(xiàn)，患者血清中外泌體microRNA表達(dá)的差異同硼替佐米治療敏感性相關(guān)。當(dāng)外泌體中miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p表達(dá)下調(diào)時(shí)，多發(fā)性骨髓瘤患者易對(duì)硼替佐米產(chǎn)生耐藥性。由此可見，體液中存在的腫瘤細(xì)胞外泌體因攜帶其“母體”腫瘤細(xì)胞的部分功能性蛋白及基因，并作為腫瘤“液態(tài)活檢”的一種新途徑，受到腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。腫瘤源性外泌體對(duì)原發(fā)部位腫瘤微環(huán)境的影響主要包括：腫瘤源性外泌體可以穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞表面突出小泡（cellular protrusions），其可通過沉積間質(zhì)來源的纖維連接蛋白等物質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)遷移；外泌體釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶可直接參與腫瘤微環(huán)境中的胞外基質(zhì)重塑，有助于腫瘤細(xì)胞在組織中遷移；腫瘤源性外泌體可以促進(jìn)前體腫瘤支持細(xì)胞分化成熟，腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來源的外泌體相互作用，可增加腫瘤細(xì)胞耐藥性。對(duì)轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境調(diào)控主要包括：腫瘤源性外泌體可增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)移部位胞外基質(zhì)重塑及骨髓來源細(xì)胞的再動(dòng)員。

3 外泌體檢測(cè)在骨腫瘤中的研究進(jìn)展

對(duì)于間葉組織來源的骨肉瘤而言，由于腫瘤異質(zhì)性明顯同時(shí)又缺乏經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物，因此以細(xì)胞經(jīng)典標(biāo)志物為手段的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)在間葉組織來源惡性腫瘤例如骨肉瘤和尤文肉瘤等的預(yù)后監(jiān)測(cè)中的作用受到顯著制約。

骨肉瘤源性外泌體中含有豐富的可溶性蛋白、RNA和microRNA等，同骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等功能密切相關(guān)。Jerez等［23］對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG63、SAOS-2和U2OS進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，結(jié)果顯示上述細(xì)胞系分泌的外泌體中含有豐富的同骨肉瘤血管生成、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白成分，從而進(jìn)一步證實(shí)骨肉瘤細(xì)胞源性外泌體同其他上皮來源惡性腫瘤分泌的外泌體作用相似，均對(duì)其“母體”細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有重要的協(xié)助作用。同時(shí)有研究［24］顯示，143B細(xì)胞系細(xì)胞懸液中外泌體含量明顯高于侵襲性相對(duì)較弱的HOS細(xì)胞系，并且143B細(xì)胞系來源的外泌體中包含有豐富的破骨相關(guān)的蛋白表達(dá)，如MMP-1、MMP-13、RANKL、TGF-β、CD-9。RANKL（receptor activator for nuclear factor-λB ligand，核因子λB受體活化因子配體）的表達(dá)在骨轉(zhuǎn)移癌和骨巨細(xì)胞瘤中的表達(dá)具有重要的意義，RANKL特異性的單克隆抗體迪諾單抗直接同成骨細(xì)胞表面的RANKL結(jié)合，從而抑制RANKL和破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，從而抑制破骨前體細(xì)胞的形成和活化，進(jìn)而抑制骨轉(zhuǎn)移癌和骨巨細(xì)胞瘤的溶骨過程。同時(shí)Branstetter等［25］報(bào)道顯示，56例骨肉瘤樣本中RANKL陽性表達(dá)率為68%，其中很大一部分表達(dá)強(qiáng)度較低，僅16例樣本為明顯表達(dá)。也有報(bào)道［26］骨肉瘤樣本RANKL陽性表達(dá)率僅9%。由此可見，骨肉瘤細(xì)胞RANKL表達(dá)情況十分不穩(wěn)定，因此骨肉瘤細(xì)胞系來源的外泌體中RANKL的表達(dá)究竟有何意義，如何利用此特性來抑制骨肉瘤的進(jìn)展，仍是值得我們研究和思考的問題。骨肉瘤源性外泌體可以通過降低CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性和促進(jìn)免疫抑制相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、αfetoprotein、熱休克蛋白的表達(dá)來影響機(jī)體免疫功能，從而實(shí)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞的免疫逃逸［27］。同惡性腫瘤標(biāo)本相比，腫瘤源性外泌體較易從體液（包括血清、血漿和尿液）中獲得，因此其可能在骨肉瘤的診斷及預(yù)后研究中具有重要的意義［28］。有研究［29］顯示，血清中miR-25-3p水平可以作為骨肉瘤患者預(yù)后較為有價(jià)值的診斷指標(biāo)，同術(shù)后患者是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性。該研究中比較了14例骨肉瘤、14例非骨肉瘤和8例健康志愿者血清中miR-25-3p的水平，骨肉瘤患者miR-25-3p水平明顯高于后兩者。同時(shí)在骨肉瘤細(xì)胞系SaOS2、HOS、U2OS和143B的細(xì)胞懸液中分離提取得到的骨肉瘤源性外泌體中，同樣檢測(cè)到較高水平的miR-25-3p的表達(dá)。雖然該研究中標(biāo)本是來源于患者血清并非直接來源于患者血清中的外泌體，但其研究者認(rèn)為循環(huán)血液中的microRNA是主要存在磷脂膜樣結(jié)構(gòu)中，其中包括外泌體、胞外囊泡和凋亡小體中。尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）在轉(zhuǎn)移型骨肉瘤細(xì)胞系（KHOS，KRIB，143B）表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移型骨肉瘤細(xì)胞系（HOS，MG63，G292），同時(shí)KHOS細(xì)胞系胞質(zhì)中uPA水平明顯低于細(xì)胞懸液中KHOS細(xì)胞系源性外泌體中表達(dá)的水平，說明骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移表型的轉(zhuǎn)化同尿激酶型纖溶酶原激活物/尿激酶型纖溶酶原激活物受體有關(guān)，并且在骨肉瘤表型轉(zhuǎn)化和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移過程中，其可能通過外泌體介導(dǎo)的旁分泌和自分泌方式發(fā)揮作用［30］。

外泌體除了在骨肉瘤中發(fā)揮著重要作用以外，在尤文肉瘤的發(fā)生發(fā)展中也可能有著重要作用。Miller等［31］首次在Ewing肉瘤細(xì)胞系中證明外泌體的存在，并且外泌體中同時(shí)檢測(cè)到Ewing肉瘤較為特異的融合基因EWS-FLI1的表達(dá)。

4 外泌體研究的應(yīng)用前景

外泌體膜表面所攜帶的蛋白分子來源于腫瘤細(xì)胞膜表面，因此不同腫瘤細(xì)胞所釋放的外泌體往往攜帶不同的表面蛋白，將腫瘤患者體液中的外泌體進(jìn)行分離后，利用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量檢測(cè)手段，明確體液中腫瘤性外泌體和正常人群之間的差異表達(dá)及特征性蛋白，對(duì)于疾病的診斷及預(yù)后的評(píng)估具有良好的臨床價(jià)值和意義。與此同時(shí)，可以根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選的外泌體表面特異性蛋白，對(duì)分離得到的外泌體進(jìn)行鑒定，也可利用此原理來鑒別正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體。由于外泌體具備向定向靶器官轉(zhuǎn)移的特性，可設(shè)計(jì)其作為藥物精準(zhǔn)給藥的載體，將所裝載的藥物運(yùn)輸?shù)桨衅鞴侔l(fā)揮作用，其在藥物靶向載體的應(yīng)用研究中也頗具潛力。Shimbo等［32］報(bào)道通過外泌體向骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143雖然轉(zhuǎn)染效率不及質(zhì)粒，但對(duì)于骨肉瘤轉(zhuǎn)移能力的抑制作用相似，原因可能是雖然外泌體的轉(zhuǎn)染效率低，但已足以抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移能力。

外泌體檢測(cè)作為體液活檢的重要部分，已得到廣大學(xué)者的重視。其不但在上皮來源惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且對(duì)于異質(zhì)性更強(qiáng)的間葉組織來源的惡性腫瘤尤其是骨肉瘤和尤文肉瘤的診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)和治療可能同樣有著重要作用和意義，因此對(duì)于惡性骨腫瘤疾病的外泌體研究同樣需要引起廣大學(xué)者的關(guān)注。

（2018-03-12收稿）

（2018-05-04修回）