高 明,焦 磊,王秉翔

“動物法則”(animal rule)[1]是美國食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)在藥品和生物制品審批法規(guī)中,針對旨在減少或防止因暴露于生物、化學(xué)、放射性核物質(zhì)造成的嚴重或威脅生命的疾病的藥物和生物制品欲獲得上市,出于倫理道德和不可操作性而無法直接在人體進行產(chǎn)品有效性研究等原因,特別制定的以該產(chǎn)品動物試驗有效性數(shù)據(jù)證明其人體有效性為主要依據(jù)的操作原則.動物法則沒有一定之規(guī),視不同類別、不同疾病制定不同策略、不同路徑,關(guān)鍵在于可操作性、可說服性.此法則于2002年5月正式生效,是美國應(yīng)對生物恐怖襲擊的有效策略之一.炭疽[2]、鼠疫[3]、肉毒菌毒素中毒[4]等疾病,均屬于“動物法則”所指的生物因素造成的疾病,它們的病原菌具有毒性強、傳染性強、抵抗力強等特點,常以易于吸入的氣溶膠狀態(tài)進行傳播和擴散,長期以來被“恐怖分子”作為生物戰(zhàn)劑研究和使用,尤其是炭疽.鑒于此類疾病的特性,出于倫理道德和不可操作性等原因,無法直接在人體進行產(chǎn)品的有效性研究.這種情況下,根據(jù)“動物法則”的規(guī)定,以充分且有嚴格對照的動物實驗數(shù)據(jù)為依據(jù),并結(jié)合人體的安全性數(shù)據(jù),開發(fā)者便可向FDA提交藥物和生物制品的上市審批申請.自“動物法則”生效以來,FDA批準的此類產(chǎn)品主要以防治炭疽的單克隆抗體為主,其次還有肉毒抗毒素,尚沒有鼠疫相關(guān)的藥物或生物制品.

1 FDA的要求與建議

1.1 上市前的要求 開發(fā)的產(chǎn)品需要滿足以下幾點要求,才能符合FDA的審批標準[1]:①對于化學(xué)、生物、放射性或核物質(zhì)毒性的病理生理學(xué)機制有明確的了解,并且新產(chǎn)品可以預(yù)防或顯著降低物質(zhì)的毒性.②應(yīng)在一種以上的動物模型中證明新產(chǎn)品有效,而且動物研究的結(jié)果可以證實該產(chǎn)品可能在人類產(chǎn)生臨床效益.若只用一種動物模型,則該動物模型必須具有充分代表性,其反應(yīng)特性已被充分評估可用于預(yù)測人類的反應(yīng)性.③動物研究終點顯然與人類期望的益處有關(guān),通常是提高生存率或降低發(fā)病率.④根據(jù)藥代動力學(xué)(pharmacokinetics,PK)和藥效學(xué)(pharmacod-ynamics,PD)方面的種間差異、暴露－反應(yīng)特性的應(yīng)用以及其它動物和人體的相關(guān)數(shù)據(jù),將動物藥效研究的結(jié)果橋聯(lián)到人,以便推算出適用于人體的有效劑量.

1.2 上市后的要求 新產(chǎn)品上市后,開發(fā)者仍需遵照以下幾點要求[1]:①在倫理道德和可行性允許的范圍內(nèi),繼續(xù)追蹤新產(chǎn)品的臨床效果,并做好安全性評價.②FDA有權(quán)制定新產(chǎn)品的限制使用范圍.③患者具有新產(chǎn)品審批信息的知情權(quán),使用說明書必須告知患者該產(chǎn)品僅是以動物實驗數(shù)據(jù)為依據(jù)制備的,并標明劑量、用藥方式、副作用等相關(guān)信息.④開發(fā)者必須進行上市后銷售及安全使用記錄報告.此外,在“動物法則”規(guī)定之下,申請者若違背上市后的要求,FDA有權(quán)對審批的產(chǎn)品進行撤銷.

1.3 動物模型的選擇 研究發(fā)現(xiàn),非人靈長類(non-human primates,NHP)在疾病發(fā)展進程和易感性等方面與人類相接近,最適合作為研究烈性傳染病的動物模型,常見的有恒河猴、非洲綠猴子、食蟹猴等.Rossi CA等[5]將非洲綠猴暴露于炭疽桿菌芽胞中后,檢測其體溫、心率等生理參數(shù),發(fā)現(xiàn)非洲綠猴具有和恒河猴及人類相似的疾病發(fā)展過程,是研究炭疽的有效動物模型.Henning LN等[6]通過記錄每只動物暴露于致死劑量的炭疽桿菌芽胞后的臨床特征,確定了食蟹猴可作為吸入性炭疽的治療動物模型.相比于NHP的價格高、數(shù)量少、飼養(yǎng)要求高等條件,新西蘭白兔等較小的哺乳動物具有易繁殖、來源便利、屬系多樣等特點,在研究藥物的劑量、用法和療程時也不失為合適的動物模型[7].Fellows P等[8]為了使r F1V鼠疫疫苗滿足“動物法則”的許可要求,通過氣溶膠暴露參數(shù)、臨床癥狀的發(fā)病和嚴重程度、疾病的病理生理反應(yīng)以及與人類疾病相關(guān)的資料,證明了瑞士韋伯斯特鼠疾病病理學(xué)與人類相似,可以作為肺鼠疫研究的有效動物模型.需要注意的是,無論選擇何種動物,在研究開始前,開發(fā)者都應(yīng)該與FDA討論所選動物模型的功效試驗和研究的細節(jié),應(yīng)該證明所選動物模型在未經(jīng)治療時暴露出的臨床癥狀、血藥濃度的極值、死后剖解的病理特征、毒素產(chǎn)物、靶器官、酶系統(tǒng)等方面,都與在人體內(nèi)的相似.

1.4 橋聯(lián)指標的分析 將動物結(jié)果橋聯(lián)到人,需要注意以下幾點:①應(yīng)將未經(jīng)治療的動物與未經(jīng)治療的人類進行比較,包括臨床癥狀、實驗室參數(shù)、組織病理學(xué)、肉眼可見病癥、發(fā)病率和死亡率.②致病因子暴露的途徑應(yīng)選擇氣霧吸入,以模擬人類有意釋放時的情形.③使用的激發(fā)劑應(yīng)該與引起人類疾病的病原體相一致,若不一致應(yīng)作出解釋說明.④要在開發(fā)的早期階段確定藥物消除的方式,并識別代謝產(chǎn)物[9].⑤給藥后,要對新產(chǎn)品的PK譜特征進行描述,并將受影響動物的PK信息與健康動物的PK信息進行比較,以確定病原體引起的疾病或狀況是否影響該產(chǎn)品的藥代動力學(xué).⑥動物模型中PK參數(shù)(藥時曲線下面積AUC、血漿峰濃度Cmax、血漿谷濃度Cmin、穩(wěn)態(tài)血藥濃度CSS)和PD參數(shù)(療效終點和潛在的生物標志物)之間的關(guān)系應(yīng)該在至少3個劑量范圍內(nèi)被確定,并且在劑量范圍的研究中確定暴露－反應(yīng)曲線(E/R)的形狀.⑦如果可能,建議獲得特定人群(老年人、孕婦、腎或肝功能損害、兒童)的PK數(shù)據(jù),用于研究在臨床中聯(lián)合用藥時藥物間相互作用的潛能.⑧動物研究必須遵守《動物福利法》(7U.S.Code.2131)和美國公共衛(wèi)生服務(wù)政策中對動物模型人道關(guān)懷的相關(guān)法律法規(guī).

FDA鼓勵開發(fā)者就人類劑量選擇的兩種方法與FDA積極展開討論.一種是在動物模型中確定PK/PD參數(shù)(最小抑菌濃度 MIC、Cmax/MIC、AUC/MIC),根據(jù)PK/PD參數(shù)來估計藥物的靶濃度和活性.另一種方法是通過識別和使用適當?shù)纳飿酥疚?選擇的生物標志物應(yīng)該與藥物預(yù)防或?qū)嵸|(zhì)性減少病原體引起的疾病以及達到預(yù)期臨床結(jié)果(降低死亡率或發(fā)病率)的機制有關(guān),并對生物標志物的測定方法和性能特征進行描述.美中不足的是,藥物暴露與有效性之間的關(guān)系是在動物體內(nèi)建立的,生物標志物、AUC/MIC等方面的證據(jù)并不能表明這種關(guān)系可以預(yù)測人類有效的藥物暴露.在這種情況下,合理的假設(shè)是人類的E/R關(guān)系類似于動物的E/R關(guān)系,可以基于對動物E/R的關(guān)系的了解,按上述方法選擇人體劑量.

1.5 其他相關(guān)法規(guī)介紹 除了“動物法則”,美國國會和FDA在應(yīng)對此類傳染病方面還制定了很多法規(guī),這些法規(guī)對利用“動物法則”進行產(chǎn)品開發(fā)具有很好的指導(dǎo)作用.1999年頒布的《國防授權(quán)法案》,授權(quán)總統(tǒng)可以在某些軍事環(huán)境下放棄FDA知情同意的要求,縮短了藥物應(yīng)對生物恐怖襲擊時的審批途徑.1999年10月,FDA發(fā)布了一條新規(guī)則,指出當在人類進行有效性研究倫理上不可行時,需要有證據(jù)來證明新藥和生物制品對致命或永久性致殘的有毒物質(zhì)的有效性,此規(guī)則被認為是“動物法則”的前身.2004年3月,FDA提出了“關(guān)鍵路徑計劃”,呼吁全社會共同參與創(chuàng)造新的、能更準確地判斷和預(yù)測藥物安全性及有效性的工具,促進生物研究的基礎(chǔ)成果更快、更好地向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化.2007年11月,FDA和美國過敏與傳染病研究所等機構(gòu)主辦炭疽疫苗研討會,專門討論將動物保護與人類免疫原性橋聯(lián)起來的策略.2009年1月,FDA發(fā)布了“動物模型－動物(效應(yīng))法規(guī)下考察藥效的基本要素”一文,作為開發(fā)者使用動物模型的指南.2013年,美國國會通過了《大流行和所有災(zāi)害的準備再授權(quán)法案》,明確了FDA的一項應(yīng)對突發(fā)性事件的新職能:當在人體測試新藥或生物制品的有效性不具有可行性或不道德時,FDA應(yīng)加強與開發(fā)者的交流與合作,并建立與開發(fā)者之間的技術(shù)咨詢會議機制,幫助新藥和生物制品的開發(fā).2015年10月,FDA發(fā)布了新一版的“醫(yī)療器械動物實驗指南文件的征求意見稿”,指出動物試驗須在符合藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(good laboratory practice,GLP)的機構(gòu)進行,否則必須向FDA說明其理由,并具體描述實際操作與GLP相關(guān)要求之間的差距.此外,在啟動研究之前,開發(fā)者還應(yīng)當確定GLP法規(guī)的例外情況,并尋求FDA同意的替代方法,以確保數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整性.

2 近年來獲批的藥物及生物制品介紹

2.1 Bio Thrax Bio Thrax是由 Emergent BioSolutions公司開發(fā)的炭疽吸附疫苗,是第一款基于“動物法則”而獲得FDA批準的疫苗,也是唯一經(jīng)FDA許可的預(yù)防炭疽感染的疫苗.早在1970年,FDA批準Bio Thrax用于軍事人員、獸醫(yī)、動物毛發(fā)和獸皮加工者,以及實驗室人員等在高風險環(huán)境下工作人群的暴露前預(yù)防(pre-exposure prophylaxis,Pr EP),免疫程序為6針次皮下注射,分別為0、2、4周和6、12、18月各接種一劑,此后每年加強一劑.后來,接種計劃被多次調(diào)整,直到2012年改為0、1、6月的3針次肌肉注射,在12、18月加強免疫,此后每年注射一次[10].研究還發(fā)現(xiàn),除了皮下注射和肌肉注射,通過鼻腔接種2劑次的Bio Thrax可以使A/J小鼠能對抗100倍LD50炭疽芽胞的攻擊,表明鼻粘膜免疫也是炭疽的有效免疫方式[11].

“動物法則”被頒布后,2015年,FDA批準了Bio Thrax一項新的適應(yīng)癥,即與特定抗生素聯(lián)用,用于疑似或確診感染炭疽病例的暴露后預(yù)防(postexposure prophylaxis,PEP),免疫程序為0、2、4周進行3針次皮下注射,隨后美國和德國將免疫程序改為0、1、6月進行3針次肌肉注射,三年后加強免疫一次.Bio Thrax用于PEP的有效性已經(jīng)在多種動物模型中得到了驗證[7]:①家兔PEP研究結(jié)果表明,暴露后接種Bio Thrax,存活率呈劑量依賴性增長.接種Bio Thrax和左氧氟沙星的一組存活率為100%,單獨使用抗生素的一組存活率僅為23%.②兔子與食蟹猴的PEP研究結(jié)果顯示,暴露后接種Bio Thrax將誘導(dǎo)劑量依賴性的中和抗體反應(yīng),且暴露后幸存者的毒素中和抗體水平是暴露前的10～250倍.

另外三項研究[12],檢測了健康的18－65歲的成年人接種Bio Thrax之后,其體內(nèi)抗體的產(chǎn)生情況以及安全性,并證明和環(huán)丙沙星合用不會產(chǎn)生不利影響.以上這些結(jié)果最終被用于支持Bio Thrax在“動物法則”下用于PEP的許可.Savransky V等進行的最新研究[13],以CpG 7909作為佐劑與Bio-Thrax配伍成AV7909疫苗,表明Cp G 7909可以增加炭疽毒素中和抗體水平的閾值,這也使得AV7909有望開發(fā)成為炭疽暴露后預(yù)防的下一代疫苗.

2.2 Raxibacumab Raxibacumab是由美國人類基因組科學(xué)公司(HGS)、美國衛(wèi)生及人類服務(wù)部(H HS)和生物醫(yī)學(xué)高級研究及發(fā)展管理局(BARDA)合作開發(fā)的單抗,也是首個基于“動物法則”批準的抗炭疽桿菌保護性抗原(PA)的人源性單抗,可以高親和力的結(jié)合PA,特異性阻斷PA與炭疽毒素受體結(jié)合,并抑制毒素介導(dǎo)的細胞死亡[14].盡管在獲得FDA批準之前,美國根據(jù)國家戰(zhàn)略儲備計劃(Strategic National Stockpile,SNS)和“生物盾”計劃(Project Bioshield),已經(jīng)采購了數(shù)萬劑Raxibacumab作為戰(zhàn)略儲備,以滿足應(yīng)急情況下足夠的藥物數(shù)量.然而,Raxibacumab正式獲得FDA批準上市的過程并不順利.2009年11月,FDA以臨床試驗數(shù)據(jù)和分析數(shù)據(jù)不足為由拒絕了HGS公司提交的關(guān)于Raxibacumab的生物制品許可申請(Biologics License Application,BLA).此后,HGS公司針對問題進行了進一步的對比分析研究,并于2012年7月再次向FDA提交了Raxibacumab的BLA.直到2012年12月,FDA批準Raxibacumab與合適的抗菌藥物聯(lián)用,用于成人和兒童吸入性炭疽治療,以及在替代療法不可用或不適合的情況下作為吸入性炭疽的預(yù)防用藥[15].

Raxibacumab之所以可以獲得FDA的審批,憑借著動物模型中的有效性研究和人體的安全性評價方面的良好結(jié)果.動物模型中的研究包括暴露前預(yù)防和暴露后治療吸入性炭疽[16-17],所選的動物模型主要為大鼠、新西蘭白兔和食蟹猴.人體中進行的安全性研究[18],目的是評估健康人的安全性、耐受性和PK參數(shù).研究還證明,在應(yīng)對可能發(fā)生的炭疽暴發(fā)時,通過肌肉注射或皮下注射給藥比靜脈注射更有利于炭疽的防治.最近的比較發(fā)現(xiàn)[19],與單獨使用抗生素可在暴露后4 d內(nèi)可預(yù)防毒血癥相比,將Raxibacumab與抗生素聯(lián)合使用可以使超過80%的受試者的保護時間延長為暴露后7 d,即使在抗生素耐藥的情況下,Raxibacumab也能提高至少6 d的保護作用.

2.3 HBAT 2013年3月,FDA根據(jù)“動物法則”批準加拿大Cangene公司開發(fā)的肉毒桿菌中毒7價抗毒素注射劑Equine-Derived Heptavalent Botulinum Antitoxin(HBAT),用于治療有病史或疑有接觸肉毒桿菌神經(jīng)毒素后顯示肉毒桿菌中毒征象的非嬰兒患者.Yu PA等[20]所作的臨床報告表明,HBAT對疑似或確診肉毒中毒患者的耐受性良好,早期給藥比晚期給藥更有效,出現(xiàn)麻痹性疾病的病人在進行實驗室確認之前,保持對肉毒桿菌中毒的臨床懷疑是很重要的.在104例肉毒中毒確診患者治療過程中驗證了HBAT的臨床療效,癥狀出現(xiàn)后2 d內(nèi)應(yīng)用HBAT治療可縮短住院時間和重癥監(jiān)護時間,平均在2.4 d可以檢測到肉毒中毒癥狀的改善,平均在4.8 d會有肌肉力量的改善.需要注意的是,HBAT在生產(chǎn)過程中會有胃蛋白酶、磷酸三丁酯和Triton X-100殘留在成品中,每一種都有可能引起過敏反應(yīng),綜合發(fā)生率為1%～2%,需要腎上腺素和抗組胺劑治療,而且可能需要重癥監(jiān)護[21].

2.4 Anthrasil 2015年,FDA批準了Anthrasil與其他抗菌藥物聯(lián)用治療吸入性炭疽.Anthrasil由加拿大Cangene公司生產(chǎn),是獲得FDA批準并納入戰(zhàn)略性國家儲備的少數(shù)幾種抗毒素藥物之一,成分是靜脈注射人炭疽免疫球蛋白(AIG-IV),由采集于Bio Thrax接種者的血漿制成,內(nèi)含對抗PA的多克隆毒素中和抗體.在獲得FDA審批之前,Anthrasil最大的臨床應(yīng)用是參與2009年～2010年英國的海洛因吸食者之間暴發(fā)的炭疽[22],美國也曾在2011年采購Anthrasil作為試驗性藥物用于戰(zhàn)略儲備,如需使用則要FDA緊急授權(quán).

根據(jù)“動物法則”,Anthrasil的有效性已在動物模型被證明[23],安全性已在125名健康志愿者身上得到了評估[24],研究結(jié)果提供了Anthrasil獲得FDA審批的充分證據(jù).在新西蘭白兔和食蟹猴中的療效研究表明,Anthrasil可以增加炭疽感染動物的存活率,即使是在臨床疾病發(fā)作后給藥.動物模型中的研究中還發(fā)現(xiàn),暴露后12 h接種Anthrasil,可以保護89%～100%的動物,而暴露后24 h接種Anthrasil會使生存率降為39%,這強調(diào)了早期干預(yù)的重要性.對Anthrasil進行PK分析,表明動物體內(nèi)人抗PA抗體的衰減速度比在人體內(nèi)更快,這就意味著必須給動物注射較高劑量的藥物才能模擬人體的藥物暴露,例如兔子及NHP在21mg/kg劑量時的效果與人體劑量為7mg/kg時的效果相類似[24].

2.5 Anthim 2016年,FDA批準Anthim注射液與特定抗生素聯(lián)用,治療成人和兒童的吸入性炭疽感染,以及在不適合替代療法時預(yù)防吸入性炭疽熱.Anthim是一種嵌合免疫球蛋白G1(k)單克隆抗體,結(jié)合并中和PA,在炭疽毒素裝配和靶細胞中毒中起核心作用.Anthim與左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素合用治療吸入性炭疽,與單獨使用抗菌藥相比,動物表現(xiàn)出更高的存活率[25].Anthim的最佳治療劑量是16 mg/kg,該劑量用于人體時的AUC大于動物體內(nèi)的2倍[26],在兔子體內(nèi)試驗時存活率達93%[27],還可有效減少不良反應(yīng)的發(fā)生.需要注意的是,鑒于Anthim易引起過敏反應(yīng),只推薦在獲益大于風險的情況下使用,且患者必須提前給藥苯海拉明,并將Anthim用氯化鈉稀釋.

3 小結(jié)與展望

“動物法則”旨在許可那些能夠減少或防止暴露于生物、化學(xué)、放射性或核物質(zhì)造成的嚴重的或威脅生命的疾病的藥物和生物制品獲得上市.本綜述主要關(guān)注的還是針對嚴重的或威脅生命的傳染性疾病的治療用藥品和生物制品以及預(yù)防用藥品和生物制品的研究,在獲批產(chǎn)品舉例中,Bio Thrax是“動物法則”概念提出以前即已使用的老疫苗,其余4個新獲批產(chǎn)品都是治療用的單克隆或抗毒素產(chǎn)品,沒有新疫苗類.每一種類疾病,每一種類產(chǎn)品,并且具體到每一個產(chǎn)品,所考慮的問題、選擇的方法必定有很大差異,必須進行單獨的實驗設(shè)計才能使其數(shù)據(jù)符合該類疾病、該項產(chǎn)品的實際.

應(yīng)對可能發(fā)生的生物恐怖襲擊,既要優(yōu)化藥物和生物制品本身,又要改善外界條件.首先,應(yīng)該縮短產(chǎn)品的接種程序并擴大產(chǎn)品的適應(yīng)癥,這也是今后新產(chǎn)品發(fā)展的主要方向.當然,加強免疫的重要性也不容小覷.某項接種Bio Thrax的實驗結(jié)果表明[28],只接受初次免疫的受試者體內(nèi)檢測到抗PA IgG的概率為30%,而在接受2或3劑次強化免疫的受試者體內(nèi)檢測到抗PA IgG的概率高達99%.其次,要有足夠的疫苗儲備.2009年,FDA批準將Bio Thrax的有效期延長3～4年,這有利于美國按照國家戰(zhàn)略儲備計劃進行藥品儲備,為炭疽恐怖襲擊和疫情暴發(fā)提供緊急支援.2016年8月,FDA批準Emergent BioSolutions公司一個新的制造工廠用于大規(guī)模生產(chǎn)Bio Thrax,該設(shè)施將有助于提高Bio Thrax的產(chǎn)量以應(yīng)對未來的需求.此外,動物模型方面,諸如發(fā)燒和氣短等人類的某些疾病表現(xiàn)可能難以通過臨床觀察在動物中識別,未來的研究中開發(fā)者可能需要使用遙感勘測技術(shù)等更精細的技術(shù)來評估受影響的動物.“動物法則”的制定,為人類防治一些棘手的疾病帶來了福音,也拓寬了動物實驗研究的應(yīng)用范圍.

當然,“動物法則”不是藥物審批的捷徑,只有更加嚴格地執(zhí)行FDA的要求,才能讓“綠色通道”真正造福人類.不論是在開發(fā)前還是開發(fā)過程中,開發(fā)者都應(yīng)該盡早且頻繁地與FDA進行交流互動,討論開發(fā)過程中的細節(jié)并隨時解決出現(xiàn)的問題,避免走彎路.