，，

艾滋病、非典型性肺炎、人禽流感、病毒性肝炎等病毒性傳染性疾病(Viral Infectious Disease)具有傳染性強，容易引起大規(guī)模暴發(fā)流行等特點，嚴(yán)重威脅公眾健康。當(dāng)前病毒主要快速檢測方法包括基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測方法和基于病毒核酸的分子生物學(xué)檢測方法。實時熒光定量PCR是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，具有實時監(jiān)測核酸拷貝數(shù)量、靈敏度高、檢測速度快、不容易污染等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于病毒性病原體的快速檢測。本文就近年來實時熒光定量PCR在各種病毒的快速檢測，尤其是在狂犬病病毒及狂犬病病毒屬檢測中的應(yīng)用和發(fā)展前景作詳細介紹。

1 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)是能夠定量監(jiān)測目的基因擴增數(shù)量的PCR新技術(shù)。原理是在PCR體系中加入熒光染料或熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，與PCR擴增產(chǎn)物結(jié)合時熒光分子在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，通過熒光信號探測器直接檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化，來監(jiān)測目的基因的拷貝數(shù)量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。Navarro等[1]將熒光標(biāo)記的方法分為兩類：1)雙鏈DNA結(jié)合染料，如SYBRGreen I和Eva Green等；2)應(yīng)用熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，包括3種類型：①熒光探針(Probe)，包括：水解探針(Hydrolysis probes)和雜交探針(Hybridization probe)；②熒光引物探針(Primer-Probe)，如：Scorpion primer-probes、AmplifluorTMprimer-probes等；③核酸類似物(Nucleic acid analogues)，如：LNA(Locked Nucleic Acids，鎖定核酸)、PNAs(Peptide nucleic acids)、ZNA(Zip nucleic acids)等。主要定量方法包括：1)絕對定量，構(gòu)建基因序列標(biāo)準(zhǔn)品并進行定量，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋并檢測得到每個稀釋度的Ct值，Ct值是熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，以核酸數(shù)量為橫坐標(biāo)，以log(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過待檢樣品的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置得到樣本所包含的核酸量；2)相對定量，根據(jù)數(shù)學(xué)公式推導(dǎo)得到目的基因=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組，可直接得到目的基因相對管家基因的量，不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對簡便省時。

實時熒光定量PCR技術(shù)具有以下優(yōu)勢：實時監(jiān)測目的基因擴增數(shù)量，定量估計樣本中目的基因初始量，并通過熒光信號展示清晰的PCR過程；操作簡單，檢測時間短；重復(fù)性和特異性良好、靈敏度很高；在封閉的體系中完成熒光信號的實時監(jiān)測，降低了被污染的可能性。該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如對mRNA表達的研究、各種基因定量分析、點突變分析和等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析以及對各種傳染病進行定性、定量分析[2]等。

2 主要實時熒光定量PCR檢測方法

2.1DNA結(jié)合染料法SYBRGreen Ⅰ等染料可與雙鏈DNA相結(jié)合，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，游離時在紫外線的激發(fā)下發(fā)出的熒光信號極低。在PCR體系中加入DNA結(jié)合染料，隨著PCR反應(yīng)的進行，熒光染料與逐漸增多的雙鏈DNA結(jié)合，熒光強度逐漸增強，因此能夠通過熒光信號的強度實時監(jiān)測反應(yīng)體系中目的基因擴增數(shù)量[1-3]。DNA結(jié)合染料可同時與特異性和非特異性擴增產(chǎn)物(主要為引物二聚體)相結(jié)合，影響定量結(jié)果的可靠性。為消除此類影響，可進行熔融曲線分析(Melting curve analysis)區(qū)分特異性產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物。SYBRGreen I是當(dāng)前使用最普遍的熒光染料，與雙鏈DNA具有高度的親和力[4]。EvaGreen是第三代雙鏈DNA結(jié)合染料，相比SYBRGreen Ⅰ染料更加穩(wěn)定和靈敏，對富含AT和富含CG的DNA序列均具有相近的親和力；在PCR體系中允許加入更高濃度的EvaGreen染料，產(chǎn)生的熒光信號更加穩(wěn)定，在熔融曲線中產(chǎn)生的峰更尖，適用于高分辨率熔融曲線分析(High resolution melting curve analysis)[5]。

2.2TaqMan探針法 TaqMan探針是當(dāng)前使用最廣泛的水解熒光探針，其5′端標(biāo)記了熒光發(fā)射分子(Fluorescence Reporter Molecule)，3′端標(biāo)記了熒光淬滅分子(Fluorescence Quencher Molecule)，當(dāng)TaqMan水解探針處于游離狀態(tài)時，兩端的熒光分子相互靠近，在紫外線的激發(fā)下熒光被吸收，無法被熒光探測器檢測到。隨著PCR反應(yīng)的進行，TaqMan探針與目的基因發(fā)生特異性結(jié)合，5′端的熒光發(fā)射分子被DNA合成酶水解，在空間上脫離了熒光受體分子的影響，在紫外線的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，并被熒光信號探測器所捕獲[6]，通過絕對定量或相對定量的方式對樣本核酸量和擴增片段數(shù)量進行定量估計?？赏ㄟ^對不同基因型的病毒設(shè)計特異性探針，并在不同的探針上標(biāo)記不同的熒光分子，建立多重?zé)晒釶CR來對病毒進行分型檢測[7]。

近年來出現(xiàn)在TaqMan探針的3′或5′端連接MGB配體來提高探針靈敏度和特異度的方法。MGB(Minor groove binding)配體是一種三肽分子，能選擇性地與富含AT兩種堿基的雙鏈DNA螺旋小溝發(fā)生非共價結(jié)合。MGB探針的一端以非熒光淬滅分子(Non-fluorescent Quencher Molecule)代替熒光淬滅分子，減少了背景熒光信號強度。MGB探針與靶基因的結(jié)合更加穩(wěn)定，MGB能提高探針的Tm(Melting Temperature，熔融溫度)值，因此能夠?qū)⑻结樤O(shè)計地更短，有利于針對病毒的多種基因型的相同位點而設(shè)計通用探針[1]；同時使探針能夠分辨一個堿基的差別，當(dāng)存在一個堿基不同時就無法在一定波長紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，因此能夠進行基因點突變的檢測；MGB探針發(fā)生錯配的概率更少，減少了非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)。MGB探針已被應(yīng)用于多重病原體檢測、病毒載量分析、基因表達、等位基因分型以及SNP檢測等領(lǐng)域中。

2.3分子信標(biāo)法 分子信標(biāo)(Molecule Beacon)是呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，5′端標(biāo)記有熒光發(fā)射分子，3′端標(biāo)記有熒光淬滅分子。分子信標(biāo)呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，熒光發(fā)射分子與淬滅分子相互靠近而不能在紫外線的激發(fā)作用下發(fā)出熒光[6]。隨著PCR反應(yīng)的進行，熱循環(huán)溫度達到分子信標(biāo)的解鏈溫度，構(gòu)象發(fā)生改變，與靶基因相結(jié)合而完全伸展成線性分子，熒光報告分子和熒光淬滅分子在空間上足夠的分離，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光。其定量原理與TaqMan探針相同。分子信標(biāo)能夠區(qū)分只有一個核苷酸差異的不同DNA序列，適用于點突變的檢測。

2.4核酸類似物法 LNA(Locked Nucleic Acids，鎖定核酸)是雙RNA聚合的類似物，其2′位的氧原子與核糖4′碳原子形成亞甲基的橋鍵[8]。在寡核苷酸鏈(如TaqMan探針、分子信標(biāo)等)中摻入LNA分子，可以增加寡核苷酸鏈的Tm值，提高其穩(wěn)定性，與靶基因結(jié)合具有很高的特異性。LNA-分子信標(biāo)和LNA-探針已被應(yīng)用于結(jié)核桿菌的SNP檢測、幽門螺旋桿菌的檢測、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測、等位基因的特異性突變檢測以及HBV病毒的的定量檢測等領(lǐng)域中。PNA(Peptide nucleic acids)是電中性DNA類似物，其磷酸戊糖骨架被N-2氨乙基甘氨酸代替，標(biāo)記噻唑橙等熒光分子與雙鏈DNA和RNA結(jié)合，用于實時熒光定量PCR。ZNA(Zip nucleic acids)是攜帶精胺衍生物的人工合成寡核苷酸鏈，能夠放置在探針的3′端、5′端或中間，通過減少核酸之間的靜電斥力來增加與靶基因結(jié)合的穩(wěn)定性[1]。

3 實時熒光定量PCR在病毒檢測中的應(yīng)用

實時熒光定量PCR在臨床快速診斷、治療效果的監(jiān)測和評估、發(fā)現(xiàn)傳染源、疾病流行暴發(fā)的處置等臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR已被應(yīng)用于乙肝病毒、登革熱病毒、流感病毒、水皰口炎病毒等病毒性病原體的核酸檢測，在病毒性傳染病的快速診斷、病毒分型、不同病毒的鑒別檢測、耐藥突變體檢測、新發(fā)傳染病病原體快速檢測等方面發(fā)揮了重要作用。

3.1實時熒光定量PCR在乙肝診斷、乙肝病毒和耐藥突變體檢測等的應(yīng)用 乙肝病毒感染是造成急慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一，在全球大約有20億人感染乙肝病毒，超過350萬人是乙肝病毒的長期攜帶者[9]，乙肝病毒給全球帶來了沉重的疾病負擔(dān)。實時熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于乙肝病毒檢測、乙肝診斷、治療過程監(jiān)測等，雜交探針法和TaqMan探針法是主要方法[10]。

實時熒光定量PCR在乙肝病毒檢測中的應(yīng)用主要有以下幾個方面：1)對臨床患者進行確診，并對所感染乙肝病毒的型別進行區(qū)分。乙肝病毒存在多種基因型，各基因型間的遺傳序列差異較大，Welzel等[11]根據(jù)各基因型病毒全基因序列比對設(shè)計引物和探針，能夠同時測定乙肝病毒的A-G基因型。Wang等[12]應(yīng)用LNA探針法檢測HBV，相比于普通TaqMan探針法具有更高的靈敏度，更廣的線性檢測范圍和更高效的擴增效率，所需探針濃度更低。2)在耐藥突變體檢測中的應(yīng)用?；颊咴陂L期使用拉米夫定抗乙肝病毒治療過程中，乙肝病毒P基因區(qū)的YMDD(酪氨酸-Y，蛋氨酸-M，天門冬氨酸-D，)基因序列容易發(fā)生變異而對拉米夫定耐藥，形成YVDD(纈氨酸-V)、YSDD(絲氨酸-S)、YIDD(異亮氨酸-I)耐藥突變體。Cane[13]等最早在1999年針對P基因區(qū)容易發(fā)生耐藥突變的密碼子550序列周圍設(shè)計4種雜交探針，包含了針對野生型(密碼子550為ATG)的探針和針對YMDD突變型(密碼子550為GTG或ATT)的探針，能夠?qū)δ退幫蛔凅w進行快速檢測。Geng[14]等使用雙TaqMan-MGB探針對拉米夫定耐藥乙肝病毒進行檢測，TaqMan-MGB探針能檢出至少一個堿基的差別，靈敏度和特異度很高。Yang[15]比較了實時熒光定量PCR和PCR產(chǎn)物測序、焦磷酸測序3種技術(shù)在YMDD突變體檢測中的應(yīng)用，結(jié)果顯示實時熒光定量PCR靈敏度更高、檢測時間更短。Shih[16]等通過全基因序列比對，在高度保守區(qū)域設(shè)計引物和雜交探針，通過熔融曲線分析，根據(jù)不同突變體所產(chǎn)生的特異性Tm值的熔融曲線，來對YMDD、YIDD、YVDD進行區(qū)分；同時還能以標(biāo)準(zhǔn)曲線對病毒載量進行定量，用于監(jiān)測抗病毒治療效果和監(jiān)測耐藥突變體的發(fā)生，對于乙肝的抗病毒治療有重要的臨床意義。Ntziora[17]等采用了分子信標(biāo)技術(shù)檢測耐藥突變體，傳統(tǒng)的檢測方法在突變體載量小于總病毒載量的25%時無法發(fā)揮作用，而分子信標(biāo)技術(shù)在低病毒載量乙型肝炎病毒耐藥突變體檢測中發(fā)揮了很好的效果。第三是對某些核酸標(biāo)志物進行檢測。共價閉環(huán)DNA(Covalently Closed Circular DNA，cccDNA)是乙肝病毒復(fù)制的起始模板，在血液中檢測到乙肝病毒DNA的出現(xiàn)表示乙肝病毒在體內(nèi)正在進行活躍復(fù)制，是慢性乙肝的相關(guān)重要生物標(biāo)志物，但其在血漿中的來源尚不完全清楚。已有研究[18]應(yīng)用實時熒光定量PCR對慢性乙肝患者的血漿樣本cccDNA進行檢測，其檢測限為15個拷貝，靈敏度很高，大部分的慢性乙肝患者血漿樣本能被檢出cccDNA的存在，用于慢性乙肝診斷。

3.2實時熒光定量PCR在登革熱病毒檢測中的應(yīng)用 登革熱病毒為蚊媒傳染性病毒，屬于黃熱病毒科，分為1-4型血清型[19]，當(dāng)前主要檢測技術(shù)包括RT-PCR檢測病毒核酸和使用ELISA檢測中和抗體，PCR技術(shù)是當(dāng)前唯一能夠判定病毒血清型的方法[20]。Taqman法[21]和SYBRGreen I法[19]是最早應(yīng)用于急性感染血清樣本中登革熱病毒的實時熒光定量PCR方法，設(shè)計針對4種血清型的引物，特異性檢測登革熱病毒的4種血清型。有研究建立多重檢測體系，使用4種標(biāo)記不同熒光分子的TaqMan特異性探針在單一體系中完成檢測，達到對登革熱病毒4種血清型鑒別診斷的目的[22]。

3.3實時熒光定量PCR在流感病毒檢測中的應(yīng)用 實時熒光定量PCR已被應(yīng)用于流感病毒檢測。甲型流感病毒曾在世界范圍內(nèi)造成多次大流行，2009年在全球發(fā)生了甲型H1N1流感大流行，之后H1N1病毒的檢測能力得到日益提高。Ellis[23]做了對H1N1檢測的4種實時熒光定量PCR方法的對比評估。Song HO等[24]建立Polymeric LabChip實時熒光定量PCR，使用了針對H1N1病毒H基因的新型特異性引物，具有成本低、靈敏度高、特異性高、檢測速度快、檢測設(shè)備重量輕等特點。

甲型流感病毒分為包括H1N1在內(nèi)的很多高致病性亞型，如：H3N2、H5N1、H7N9，2004年Stone等[25]使用特異性雜交探針的雙重實時熒光定量PCR進行H1N1和H3N2兩種甲型流感病毒亞型的分型檢測。Wang等[26]開發(fā)了多重實時定量PCR技術(shù)，同時檢測4種熒光信號，來對甲型流感病毒的4種亞型(H1、H3、H7、H9)進行鑒別檢測，檢測方法采用SYBRGreen或者TaqMan技術(shù)，在針對4種亞型的H基因的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在每種探針兩端分別標(biāo)記不同的熒光集團和熒光淬滅集團，達到分型鑒別檢測的目的。Zhang等[27]建立了MGB多重實時熒光定量PCR方法對H5亞型禽流感進行檢測。

流感病毒分為甲、乙、丙三型，Wu等[28]也應(yīng)用多重實時熒光定量PCR對甲型、乙型流感病毒進行鑒別診斷。同時有研究應(yīng)用多重實時熒光定量PCR鑒別檢測很多導(dǎo)致臨床癥狀類似的病原體，如流感病毒和呼吸道合胞病毒的多重檢測[29-30]，用于引起呼吸道疾病暴發(fā)流行的病原體快速鑒別，對于呼吸道傳染性疾病防控具有重要意義。

3.4實時熒光定量 PCR在狂犬病病毒和狂犬病病毒屬檢測中的應(yīng)用 狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)是狂犬病的主要病原體，屬于狂犬病病毒屬、彈狀病毒科，核酸為單股負鏈RNA，全長約為12 kb，N、L基因為高度保守序列，其他部分仍然具有高度的遺傳多樣性；狂犬病病毒是狂犬病病毒屬中地理分布范圍、宿主分布范圍最廣的病毒，幾乎能感染包括人在內(nèi)的所有哺乳動物?？袢∈且环N急性病毒性腦炎，病死率幾乎為100%，與其他某些病毒引起的急性腦炎癥狀很難區(qū)分，快速可靠的臨床診斷非常重要[31]?？袢〔《緦?Lyssavirus)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，ICTV(國際病毒分類委員會，International Committee of Taxonomy Virus)明確了狂犬病病毒屬的3個譜系：譜系Ⅰ包括RABV, Aravan virus[ARAV]、Khujand virus[KHUV]、Bokeloh bat lyssavirus[BBLV]、Duvenhage virus[DUVV]、European bat lyssavirus 1[EBLV-1]、European bat lyssavirus 2[EBLV-2]，Australian bat lyssavirus[ABLV]和Irkut virus[IRKV]；譜系Ⅱ包括Mokola virus[MOKV]，Shimoni bat virus[SHIBV]和 Lagos bat virus[LBV]；譜系Ⅲ包括Ikoma lyssavirus[IKOV]、West Caucasian bat virus[WCBV]和Lleida bat virus[LLBV]；另外還有尚未明確分類的在西班牙蝙蝠中分離的LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。當(dāng)前又發(fā)現(xiàn)了新的病毒——Gannoruwa bat lyssavirus。歐洲蝙蝠病毒等病毒的感染均有可能造成狂犬病死亡病例，因此也被稱為狂犬病相關(guān)病毒(Rabies-related Viruses)，狂犬病病毒屬的檢測對于狂犬病預(yù)防控制同樣重要。

3.4.1實時熒光定量PCR在狂犬病病毒檢測中的應(yīng)用 當(dāng)前狂犬病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是直接免疫熒光法(Direct Fluorescent Antibody Test，DFA)，靈敏度和特異度很高，但是存在很多局限性，如適用于檢測腦組織樣本，對腐敗樣本和唾液等非神經(jīng)樣本檢出效果不好，檢測時間長，需要熒光顯微鏡，不能用于現(xiàn)場快速檢測等。已有研究應(yīng)用傳統(tǒng)RT-PCR檢測狂犬病病毒，包括巢式、半巢式RT-PCR，相比于金標(biāo)準(zhǔn)具有更高的靈敏度和特異度，對樣本類型限制較少其局限性有對于大量樣本工作負擔(dān)較重，同時存在交叉污染的風(fēng)險。實時熒光定量RT-PCR克服以上局限性，能夠?qū)颖静《据d量進行定量，檢測時間更短，減少污染的風(fēng)險，結(jié)果更可靠。

Nagaraj等[32]最早使用SYBRGreen Ⅰ實時熒光定量PCR檢測了21份陽性狂犬病患者唾液樣本，設(shè)計了位點為64-82和201-183的一對引物，熒光曲線圖顯示大多數(shù)陽性樣本Ct值在26-19個循環(huán)之間，少數(shù)樣本的Ct值超過了35個循環(huán)為非特異性熒光(引物二聚體)，判斷熒光信號是否來源于特異性產(chǎn)物需進行熔融曲線分析(Melting curve analysis)，對擴增產(chǎn)物進行重新升溫并實時監(jiān)測熒光信號，如果熒光信號來源于特異性產(chǎn)物則會出現(xiàn)一個很高的尖峰，結(jié)果為陽性樣本在78 ℃出現(xiàn)尖峰，表明有特異性產(chǎn)物；某些樣本出現(xiàn)小的峰值表示為非特異性產(chǎn)物如引物二聚體。與傳統(tǒng)巢式RT-PCR對相同樣本檢測結(jié)果相比較，顯示實時熒光定量PCR具有更高的靈敏度(75%)，并能在更短的時間內(nèi)完成對狂犬病患者唾液樣本檢測。SYBRGreen Ⅰ實時熒光定量PCR也被用于對感染動物的死前檢測，Saengseesom等[33]研究結(jié)果表明大部分唾液樣本能夠檢出狂犬病病毒，腦脊髓液相比于唾液較難檢出。

狂犬病病毒核酸檢測主要應(yīng)用TaqMan法，探針容易和模板序列發(fā)生錯配，Hughes等[7]發(fā)現(xiàn)錯配發(fā)生數(shù)量會嚴(yán)重影響PCR擴增。Supaporn等[34]開始使用TaqMan技術(shù)應(yīng)用于動物的口腔粘膜拭子、毛囊組織，結(jié)果顯示口腔粘膜拭子檢測靈敏度大于80%，毛囊組織的檢測靈敏度為60%。Mani等[35]應(yīng)用TaqMan技術(shù)對唾液、皮膚組織、腦脊髓液和血清進行被感染動物的死前檢測，檢出率很高。

Martin等[36]以N基因和L基因為靶基因分別設(shè)計引物和探針，構(gòu)建了兩套TaqMan實時熒光定量PCR體系檢測RABV，采用絕對定量的方式，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒合成標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，對標(biāo)準(zhǔn)RNA序列10倍倍比稀釋測定Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種檢測體系對非洲本地RABV分離株均能檢出，與MOKV、LBV等狂犬病病毒屬的其他病毒無交叉反應(yīng)，特異性均為100%，相比于傳統(tǒng)RT-PCR減少工作負擔(dān)和檢測時間；基于L基因的PCR反應(yīng)體系具有更優(yōu)秀的表現(xiàn)，檢測限是0.00 067 TCID50/mL，為傳統(tǒng)半巢式RT-PCR的萬分之一，因此可用于檢測病毒載量較少的動物唾液等樣本，對尚存活患者臨床樣本(唾液、皮膚組織、腦脊液)檢測中檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果完全一致，并且相比于基于N基因的PCR反應(yīng)體系具有更高的靈敏度，可作為人間狂犬病的診斷技術(shù)。

3.4.2實時熒光定量PCR在狂犬病病毒屬檢測中的應(yīng)用 狂犬病病毒屬具有高度遺傳多樣性，開發(fā)單一、方便使用的診斷技術(shù)很困難。金標(biāo)準(zhǔn)DFA以及分子生物學(xué)方法，如RT-PCR和實時熒光定量PCR，目前都不能完全對狂犬病病毒屬的所有病毒進行快速檢測。

Elizabeth[37]最早使用TaqMan實時熒光定量PCR檢測了狂犬病病毒屬的6種基因型，以JW12為逆轉(zhuǎn)錄引物，以JW6(DPL)/JW6(M)/JW6(E) 混合引物為PCR擴增引物；N基因是進行病毒分型并且是最保守的序列，因此以N基因為靶基因設(shè)計均標(biāo)記了FAM熒光報告分子和TRAMA熒光淬滅分子的8種特異性探針(TQM1(ac)、TQM2～6)，探針的特異性很高，某一種病毒的特異性探針在其他基因型檢測中不會產(chǎn)生熒光信號，能夠在單一反應(yīng)體系中對狂犬病病毒屬的6種基因型進行檢測。Coertse[38]等開發(fā)了使用單一探針(620lyssa)的TaqMan實時熒光定量PCR體系對狂犬病病毒屬基因1-4型(RABV、LBV、MOKV、DUVV)進行檢測，以CVS為標(biāo)準(zhǔn)RNA作為陽性對照，以相比β-actin擴增效率更加穩(wěn)定可靠的18s rRNA為內(nèi)參基因作為內(nèi)對照，靈敏度高于巢式RT-PCR 1 000倍。Ashutosh[39]設(shè)計了新的熒光定量PCR——LN34法，檢測所有狂犬病病毒和另外的13種具有代表性的狂犬病相關(guān)病毒，以N基因的高保守非編碼序列和部分編碼序列為靶基因設(shè)計引物和TaqMan探針，并將探針鏈接LNA和MGB分子，能夠提高探針的熔解溫度(Melting Temperature，Tm值)，減少非特異性產(chǎn)物的擴增；兩種探針具有相近的靈敏度和特異度，MGB探針能夠識別探針靶基因的單個堿基的變化，而LNA探針能夠允許出現(xiàn)單個堿基的錯配，因此LNA-探針更適合于更廣范圍的狂犬病相關(guān)病毒的檢測。

多重實時熒光定量PCR已經(jīng)被應(yīng)用于狂犬病病毒屬中不同病毒的鑒別檢測。Wakeley[40]等首次開發(fā)了TaqMan多重實時熒光定量PCR對狂犬病病毒、歐洲蝙蝠病毒-1/2進行分型檢測，通過識別3種基因型的保守序列，設(shè)計了通用型引物N165-146，并設(shè)計3種被標(biāo)記了不同熒光報告/淬滅分子(FAM/TAMRA、HEX/Blackhole Quencher 1、Cy5/Blackhole Quencher 2)的特異性TaqMan探針(LysGT1、LysGT5、LysGT6),分別對應(yīng)3種病毒，不同的熒光分子在波長不同的紫外線照射下產(chǎn)生熒光，達到鑒別檢測的目的，同時設(shè)立了β-actin內(nèi)參基因以排除樣品完整性、核酸提取過程所帶來的系統(tǒng)誤差。Deubelbeiss[41]等在Wakeley所設(shè)計的2種探針的基礎(chǔ)上新加了7種探針，在兩套探針體系下能對狂犬病病毒屬的9種基因型進行分型檢測，并以Sandai Virus為內(nèi)參基因。

Hayman[42]等N165-146引物基礎(chǔ)上建立了只使用兩種引物的SYBRGreen Ⅰ實時熒光定量PCR，能檢測當(dāng)時已發(fā)現(xiàn)的11種狂犬病相關(guān)病毒，其靈敏度是傳統(tǒng)半巢式RT-PCR的200倍。SYBRGreenⅠ檢測法存在出現(xiàn)假陽性的風(fēng)險，而TaqMan法的靈敏度相對較低，而且要設(shè)計多種特異性探針，使用兩種技術(shù)相結(jié)合能夠有效提高病毒檢測范圍和靈敏度[43]。

3.5實時熒光定量PCR在其他病毒檢測中的應(yīng)用

實時熒光定量PCR在寨卡、水皰口炎病毒等的檢測中也被廣泛應(yīng)用。已有研究建立了水皰口炎病毒的實時熒光定量PCR檢測法，如花群義[44]等建立的TaqMan法對印第安型和新澤西型進行檢測；Tolardo等[45]建立的SYBRGreen檢測法，能夠檢測水皰口炎病毒屬的Piry、Carajas、Alagoas、Indiana 4種病毒種，并對黃病毒、甲病毒等不會發(fā)生交叉污染，其中Priy、Alagoas、Indiana均對人致病。Kate[46]等建立了MGB實時熒光定量PCR檢測和分型Indiana病毒1-3型和New Jersey病毒，以L基因7 230-7 465位點為靶基因設(shè)計通用引物和特異性MGB探針，MGB能夠提高探針的退火溫度和特異性，因此能夠在單一體系中進行多重實時熒光定量PCR檢測，同時以159個自然感染的牛上皮細胞樣本進行實際檢測，檢測結(jié)果與補體結(jié)合實驗相一致，同時還能夠進行分型，具有一定的檢測優(yōu)勢。

已有少數(shù)研究建立了某些新發(fā)病毒性病原體如寨卡病毒的實時熒光定量檢測方法[47-50]，但是大部分研究并沒有覆蓋寨卡病毒的大部分株系，同時寨卡病毒與黃熱病毒、登革熱病毒、腦炎病毒等具有同源性，引物設(shè)計不當(dāng)會降低檢測方法的特異性。

4 實時熒光定量PCR在病毒檢測中的意義及展望

實時熒光定量PCR是一種成熟的核酸快速檢測技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病病原體的快速檢測，為傳染性疾病的診斷提供實驗室診斷依據(jù)。實時熒光定量PCR已經(jīng)被應(yīng)用于病毒的定性檢測，病毒各基因型和基因亞型的分型檢測，類似病毒之間的鑒別檢測，用于提供傳染性疾病的臨床診斷證據(jù)，了解病毒的流行狀況，監(jiān)測病毒的流行型別，發(fā)現(xiàn)病毒傳染源，對于制定有針對性病毒性傳染性疾病的防控策略和措施具有重要意義。實時熒光定量PCR技術(shù)能夠檢測感染患者和動物組織、體液樣本的病毒載量，檢測病毒耐藥突變體以及患者體內(nèi)的感染標(biāo)志物等，對于監(jiān)測患者體內(nèi)病毒的耐藥狀況，跟蹤治療進程，評估疫苗預(yù)防效果或藥物治療效果等具有重要的臨床意義。

在狂犬病診斷中，可應(yīng)用實時熒光定量PCR對患者的唾液、腦組織等樣本進行檢測，為狂犬病診斷提供證據(jù)；還能夠?qū)Ρ桓腥緞游镞M行死前檢測，如對低病毒載量的唾液、腦脊液、血清等樣本進行檢測，無需提取動物腦組織進行DFA檢測，靈敏度很高，檢測速度快，具有很大的檢測優(yōu)勢。狂犬病病毒屬中包含14種病毒，均有造成人間狂犬病的可能，而狂犬病疫苗并非對所有狂犬病相關(guān)病毒都有預(yù)防效果。多重實時熒光定量PCR技術(shù)在狂犬病診斷中應(yīng)用廣泛，使用單一方法對狂犬病病毒屬中的大部分病毒進行檢測成為可能，且檢測方法高效、快速、靈敏，具有替代金標(biāo)準(zhǔn)進行狂犬病診斷的潛力，具有一定的臨床意義；同時在國際交流日益頻繁的今天，對于防控外來病毒具有一定的國際意義。大部分病毒都有特定的流行區(qū)域，如歐洲地區(qū)主要流行RABV和歐洲蝙蝠病毒-1/2，其主要感染和傳播動物種類并不相同，對這些流行病毒進行分型診斷，從而了解某地區(qū)的主要流行病毒的型別，加強其主要感染和傳播動物的管理，對于狂犬病的防控具有重要意義。

本文主要針對于實時熒光定量PCR在病原檢測方面的應(yīng)用，在基因表達定量、高度多態(tài)性HLA位點的識別、等位基因識別、基因甲基化檢測、遺傳性疾病檢測等領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，將此技術(shù)與狂犬病病毒等病原體的復(fù)制、表達、突變、致病毒力等方面相結(jié)合，探索病毒致病機制，研究抗病毒治療方法都需要進一步研究。

(本文工作在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所完成，在此謹(jǐn)向幫助我的各位老師和同學(xué)致謝。)