，

甲型肝炎(甲肝)與戊型肝炎(戊肝)較為相似，均為急性、自限性疾病，通過糞口途徑、人與人之間的接觸或者污染的水和食物傳播[1]。甲肝主要在衛(wèi)生環(huán)境較差的發(fā)展中國(guó)家，例如非洲、亞洲和南美洲的部分地區(qū)流行[2]。甲型肝炎病毒(HAV)是引起急性病毒性肝炎的主要病原體，屬于小核糖核酸家族的肝病毒屬，基因組全長(zhǎng)約7 500 nt，為單正鏈線性RNA病毒，包括5′非編碼區(qū)(UTR)、蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)(UTR)。HAV非常穩(wěn)定，具有耐熱性和耐酸性，這一點(diǎn)和其它小核糖核酸家族的病毒有所不同，該特點(diǎn)利于病毒的傳播[3]。以往以為HAV為無倉(cāng)膜病毒，但近年來研究發(fā)現(xiàn)HAV在血液中是以有包膜的顆粒形式存在，而在糞便中則為裸露的、無包膜的顆粒形式[4]。目前，HAV被分為6個(gè)基因型(I、II、III、IV、V、VI)，I-III型為人類起源，每一型又可分為A、B兩個(gè)亞型，其中IA型在世界范圍內(nèi)最為流行。據(jù)報(bào)道，全球每年有超過1 400萬人新發(fā)HAV感染[5]，被感染的兒童通常為隱性感染沒有臨床癥狀，而被感染的成人多為顯性感染會(huì)出現(xiàn)黃疸等其它臨床癥狀，感染之后可以獲得終生免疫力。盡管由于衛(wèi)生條件改善等因素，全球范圍內(nèi)人群中甲肝抗體的陽(yáng)性率在日益下降，導(dǎo)致了部分地區(qū)人群對(duì)甲肝的暴發(fā)流行缺乏免疫力，因此甲肝仍然是一個(gè)值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。

如同乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，HAV的宿主主要局限于人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[6]。但是HAV可成功在小鼠及豚鼠細(xì)胞中培養(yǎng)，提示其可能有其它種類的宿主存在[7-8]。目前為止，關(guān)于HAV的致病性和宿主免疫反應(yīng)的動(dòng)物模型主要是以黑猩猩和狨猴為主的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[9]，尚無能準(zhǔn)確復(fù)制該病毒的致病過程的小型動(dòng)物模型。本文將對(duì)甲型肝炎目前的動(dòng)物模型研究情況進(jìn)行分類綜述。

1 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物

雖然HAV可成功感染非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，但是即使在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，該病毒的宿主范圍也相當(dāng)有限，對(duì)HAV最為敏感的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物主要是狨猴和黑猩猩，而這兩種動(dòng)物的資源十分稀缺，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作都很困難。因此，我們?nèi)孕枰诳紤]到實(shí)驗(yàn)條件、經(jīng)濟(jì)條件和倫理范疇的情況下，選擇最佳研究HAV的非人靈長(zhǎng)動(dòng)物種類。

1.1狨猴 在過去很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，由于HAV不能在細(xì)胞培養(yǎng)中分離且缺乏可以成功感染的動(dòng)物模型，因此對(duì)于該病毒的研究一直處于停滯階段。1969年，Deinhardt等人[10]嘗試用甲肝病人血清感染狨猴，5只中的兩只在感染后出現(xiàn)了臨床癥狀，并且能夠傳染給其它狨猴。隨后，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過分離甲肝病人的血清并感染狨猴，證實(shí)不同種類的狨猴對(duì)HAV易感[11-14]。

雖然甲肝是通過糞口途徑傳播，但研究發(fā)現(xiàn)在狨猴中，靜脈注射HAV比口服病毒的感染效率更高，且注射劑量越高，狨猴的甲肝潛伏期就越短，血清和糞便中出現(xiàn)陽(yáng)性指標(biāo)也更早[15]。其原因可能是經(jīng)靜脈注射后，病毒能夠迅速定植于肝臟并進(jìn)行繁殖，而經(jīng)口途徑感染的病毒須先在腸粘膜等部位定植，之后才能入侵血液并定植于肝臟，在肝內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并形成感染病灶。

狨猴感染甲肝后，臨床癥狀并不明顯，只有輕微的厭食及體重下降。在感染HAV后平均1～5周，狨猴血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)開始出現(xiàn)升高，隨著病程發(fā)展達(dá)到峰值并可持續(xù)3～4周，這表明狨猴出現(xiàn)了急性肝炎并發(fā)生了肝臟損傷[16-21]。在感染病毒后一周左右，可以在狨猴排出的糞便中檢測(cè)到HAV RNA及HAV抗原，狨猴的糞便排毒可持續(xù)20～30[19-21]。通過對(duì)感染甲肝的狨猴的不同器官的檢查，發(fā)現(xiàn)不僅在肝臟中能檢測(cè)到HAV抗原，在膽囊、脾臟等肝外器官中也可檢測(cè)到[19-21]。大多數(shù)狨猴在肝臟損傷伊始便開始產(chǎn)生抗-HAV IgM抗體，在達(dá)到峰值2～3周后發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換并產(chǎn)生抗-HAV IgG抗體[19-20]。利用光鏡、電鏡、免疫電鏡和過氧化酶標(biāo)記抗體等方法進(jìn)行組織學(xué)方面的檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)肝炎的組織學(xué)變化，例如肝細(xì)胞嗜酸性變、肝臟細(xì)胞壞死和凋亡、氣球樣變性、肝巨噬細(xì)胞增殖等，病毒顆?？沙霈F(xiàn)于肝細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞及微膽管上皮細(xì)胞等[20-21]。

此外，Provost等人[22-23]的研究表明，向狨猴注射HAV的野毒株和經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)傳代的疫苗株后，狨猴對(duì)于二者的反應(yīng)有所不同，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)傳代的疫苗株所引起的肝臟生化及組織學(xué)的指標(biāo)均有所下降，而且病毒在肝內(nèi)的復(fù)制和糞便中排出量也相應(yīng)減少。因此狨猴不僅可作為甲肝病毒感染的動(dòng)物模型，也可作為測(cè)試毒力指標(biāo)的模型。

1.2黑猩猩 自然環(huán)境下，黑猩猩感染HAV和抗-HAV抗體存在的概率較高，約有90%的野生黑猩猩攜帶抗-HAV的抗體，故不適合用作HAV感染研究，并且導(dǎo)致了在過去的實(shí)驗(yàn)條件下用HAV感染新捕捉的黑猩猩的失敗率較高[24]。隨著對(duì)于抗-HAV抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法的發(fā)展，人工培育的黑猩猩可以通過血清中的抗-HAV抗體篩選并選擇陰性者進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，隨后許多研究均表明黑猩猩可以成功感染HAV[25-26]。

雖然甲肝的傳播是通過糞口途徑，但同狨猴一樣，對(duì)黑猩猩進(jìn)行靜脈注射病毒的感染率高于經(jīng)口感染，而且注射劑量越高，潛伏期也越短[15]。黑猩猩在感染HAV后，會(huì)出現(xiàn)輕度的急性肝炎相應(yīng)的臨床癥狀,但臨床癥狀一般比較輕微[27]。在感染病毒后14 d，可在黑猩猩血清中檢測(cè)到病毒，病毒血癥持續(xù)大約兩周，而糞便排毒出現(xiàn)在感染病毒后10 d左右，可持續(xù)3周[27-29]。感染病毒21 d后，除了糞便及血清中可檢測(cè)到病毒外，還可在黑猩猩肝臟以及膽汁、扁桃體、唾液等中檢測(cè)到HAV抗原，并可用免疫電鏡觀察到病毒顆粒[28-31]。隨后，可在黑猩猩血清中檢測(cè)到甲肝抗體的出現(xiàn)及抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[30-32]。感染病毒后15～30 d左右，黑猩猩血清中的轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)升高達(dá)到最高值[30-33]，而血清學(xué)指標(biāo)的上升通常是肝臟損傷的直接證據(jù)。此外，Maynard等人[34]的研究結(jié)果表明，在感染了HAV的黑猩猩的血清中，可檢測(cè)到循環(huán)免疫復(fù)合物，可能與體內(nèi)對(duì)病毒清除的機(jī)制以及相應(yīng)的免疫反應(yīng)有關(guān)，而循環(huán)免疫復(fù)合物在甲肝患者中很少被關(guān)注。

雖然黑猩猩是研究甲型肝炎的理想動(dòng)物模型，并且之前對(duì)于HAV的致病性研究主要依賴于黑猩猩為主的動(dòng)物模型，然而由于價(jià)格昂貴、來源困難，飼養(yǎng)條件苛刻、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，因此其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中具有一定的局限性，有些國(guó)家已經(jīng)明令限制黑猩猩用于實(shí)驗(yàn)，并倡導(dǎo)使用替代的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[35]。

1.3其它非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 除了狨猴及黑猩猩，還有研究表明HAV可以成功感染夜猴、食蟹猴、短尾猴、恒河猴、松鼠猴等其它種類非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[36-41]。這些種類的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，在感染HAV后，均可以出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶的升高、糞便排毒、抗-HAV抗體的產(chǎn)生以及肝臟病理學(xué)改變等肝炎引起的表現(xiàn)[36-41]，但相較于狨猴和黑猩猩而言，這些非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物雖然能夠被HAV感染，其糞便排毒、肝臟酶學(xué)改變、肝臟病理學(xué)改變等，均變化不明顯。此外，也有研究表明恒河猴、卷尾猴、綠長(zhǎng)尾猴以及梟猴在注射了HAV之后，只產(chǎn)生抗-HAV抗體而沒有產(chǎn)生肝炎的表現(xiàn)[42]，這些結(jié)果的差異可能是由于動(dòng)物種類的不同，也可能是由于所選用的動(dòng)物在入組前已經(jīng)被感染了，需要重復(fù)驗(yàn)證。

1.3.1食蟹猴 通過對(duì)自然狀況下食蟹猴的血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)野生食蟹猴在自然環(huán)境中可以感染HAV，感染HAV后其ALT等酶學(xué)指標(biāo)也會(huì)相應(yīng)上升，而且食蟹猴的抗-HAV抗體血清陽(yáng)性率與體重成正比[43-44]。在對(duì)食蟹猴進(jìn)行HAV感染后，沒有出現(xiàn)人類患急性肝炎時(shí)的臨床表現(xiàn)，但其ALT等酶學(xué)指標(biāo)相應(yīng)升高，其糞便、血清中可檢測(cè)到HAV RNA，血清中的抗-HAV抗體也呈陽(yáng)性，同時(shí)肝臟出現(xiàn)相應(yīng)病理學(xué)改變[39,45-46]。此外，HAV也可在食蟹猴的肝外器官如唾液腺進(jìn)行復(fù)制[39]。

1.3.2恒河猴 與食蟹猴類似，在感染HAV之后，恒河猴的糞便中可以檢測(cè)到HAV RNA，血清中也相應(yīng)出現(xiàn)抗-HAV抗體，但其肝臟病理性變化較為輕微，并且其中一些感染HAV的恒河猴ALT等酶學(xué)指標(biāo)仍處于正常范圍內(nèi)[45,47-48]。

1.3.3夜猴 在自然環(huán)境中，夜猴可被HAV感染，并且夜猴之間也可相互傳染，但感染后的抗體陽(yáng)性率較低[36]。通過靜脈注射或者經(jīng)口途徑，均可成功使夜猴感染HAV，感染后夜猴出現(xiàn)糞便排毒、抗-HAV抗體的產(chǎn)生以及ALT等酶學(xué)指標(biāo)的升高，組織學(xué)結(jié)果也表明肝臟出現(xiàn)類似于人類肝炎變化，例如壞死、退行性變、炎性細(xì)胞增生等現(xiàn)象[37-38,49]。

總之，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，目前對(duì)HAV最為易感的是黑猩猩和狨猴，其它種類的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物雖然也可以成功感染HAV，但臨床癥狀、生化指標(biāo)、肝臟病理學(xué)改變等不如黑猩猩和狨猴明顯。HAV的宿主范圍局限在人類和非人靈長(zhǎng)類之中而且非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染HAV的疾病過程與人類較為相似，故之前的研究主要采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，但由于其資源稀缺，且飼養(yǎng)困難、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，故亟需建立可替代的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

2 其它種類動(dòng)物模型

2.1豬 Song等人[50]在460份不同年齡段的豬的血清中，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)出豬在自然環(huán)境下抗-HAV抗體陽(yáng)性率為3.5%。隨后，他們分別通過經(jīng)口及靜脈注射對(duì)豬進(jìn)行了HAV感染，病毒血癥及糞便排毒均在注射病毒后一周左右出現(xiàn)，而抗-HAV抗體則在病毒注射后28 d出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間為15 d。此外，只有靜脈注射組的豬出現(xiàn)了抗-HAV抗體，而經(jīng)口感染組的豬沒有出現(xiàn)抗體。通過對(duì)豬的肝臟組織學(xué)檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)變化，在肝外組織中，淋巴結(jié)等組織也出現(xiàn)了相應(yīng)的病理學(xué)改變。但是，被感染的豬均沒有出現(xiàn)發(fā)熱、黃疸等肝炎的臨床表現(xiàn)，而且經(jīng)感染的豬血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素水平與對(duì)照組豬并無顯著性差異。Song等人認(rèn)為[50]，HAV可以在豬的體內(nèi)復(fù)制，豬可替代非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，成為HAV感染的動(dòng)物模型。但豬在感染HAV后，其臨床表現(xiàn)及血清標(biāo)志物水平均沒有顯著變化，用于感染相關(guān)的研究仍有局限。

2.2豚鼠 由于HAV可以在豚鼠細(xì)胞中成功培養(yǎng)[51]，提示HAV的復(fù)制可能不局限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞中。2001年Hornei等人[52]嘗試HAV能否在實(shí)驗(yàn)條件下感染豚鼠，通過經(jīng)口及靜脈注射對(duì)豚鼠進(jìn)行了病毒感染后，他們發(fā)現(xiàn)在感染后2～3周，豚鼠開始出現(xiàn)糞便排毒及病毒血癥，經(jīng)口感染的豚鼠出現(xiàn)的時(shí)間晚于靜脈注射者。感染60 d后，對(duì)豚鼠肝臟進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)及肝細(xì)胞壞死等改變，另外，豚鼠的小腸、淋巴結(jié)、脾臟等肝外組織也發(fā)生了病理性改變。但是，在整個(gè)感染過程中，豚鼠血清中均沒有出現(xiàn)抗-HAV抗體，谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)也與對(duì)照組豚鼠沒有顯著性差異。Hornei等人[52]認(rèn)為豚鼠沒有出現(xiàn)抗體及生化指標(biāo)異常的原因是所注射的病毒載量較低，故認(rèn)為豚鼠適宜作為研究HAV感染所引起的病理改變的模型，但不適宜作為比較抗體、生化指標(biāo)的模型。由于本研究未在糞便及血清中檢測(cè)到HAV RNA，也未進(jìn)行組織免疫組化或免疫熒光等確認(rèn)HAV感染，故不能排除其它原因?qū)е碌难装Y病理學(xué)改變。

2.3基因敲除小鼠 之前研究表明，HAV的復(fù)制能夠被I型干擾素抑制[53]，而且被HAV感染的黑猩猩體內(nèi)的I型干擾素反應(yīng)被明顯抑制[54]，因此Hirai-Yuki等人[55]給I型干擾素受體和II型干擾素受體雙敲除的小鼠靜脈注射了HAV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙敲除小鼠出現(xiàn)了糞便排毒及低水平的病毒血癥，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平也有所升高。感染后28 d，雙敲除小鼠血清中可以檢測(cè)到抗-HAV抗體，感染后37～41 d，小鼠肝臟也出現(xiàn)了肝細(xì)胞凋亡和壞死等病理學(xué)改變。

隨后，Hirai-Yuki等人又用HAV分別感染了線粒體抗病毒信號(hào)分子(MAVS)敲除小鼠和I型干擾素受體敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)二者在感染7 d后，均出現(xiàn)糞便排毒，感染15 d后能夠在肝臟中檢測(cè)到病毒RNA。然而，只有I型干擾素受體敲除小鼠出現(xiàn)了谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的升高和肝細(xì)胞壞死等組織學(xué)改變，線粒體抗病毒信號(hào)分子敲除小鼠則沒有顯著改變。因此，Hirai-Yuki等人認(rèn)為，I型干擾素受體敲除小鼠可以作為研究HAV的動(dòng)物模型，而且線粒體抗病毒信號(hào)分子介導(dǎo)的干擾素信號(hào)通路可能與肝臟損傷有關(guān)。但由于其為基因敲除小鼠，制備較為困難、繁瑣，且不能模仿生理情況下對(duì)HAV感染的反應(yīng)，故應(yīng)用受限。

2.4樹鼩 樹鼩是一種介于食蟲目和靈長(zhǎng)目之間的動(dòng)物，在我國(guó)廣西、云南等地區(qū)分布廣泛，因其與猴類等相比，數(shù)量較多，具有對(duì)多種人類疾病的易感性，如乙肝、丙肝等[56-58]，故具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值。

詹美云等[59]用5%的甲肝病人糞便懸液，通過經(jīng)口感染方式感染了9只樹鼩。結(jié)果表明，感染后樹鼩沒有出現(xiàn)明顯的急性肝炎的臨床表現(xiàn)。在感染后7～13d，有7只樹鼩出現(xiàn)糞便排毒現(xiàn)象，并且持續(xù)12～27 d，說明HAV能夠在樹鼩體內(nèi)進(jìn)行繁殖。在感染后2～16周，有78%的樹鼩血清中出現(xiàn)了抗-HAV的抗體，但抗體的滴度比較低，可能和病毒毒力或者樹鼩的免疫力有關(guān)。此外，部分樹鼩出現(xiàn)了ALT等肝臟相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)的升高，以及肝臟充血、水腫等病理學(xué)改變。這些結(jié)果都提示HAV可以在樹鼩的體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。樹鼩在我國(guó)數(shù)量較多，資源豐富，故可作為甲型肝炎的動(dòng)物模型而被使用。但由于其沒有明顯的臨床表現(xiàn)且出現(xiàn)糞便排毒的比率不高，故在相關(guān)研究中仍具有局限性。

綜上所述，由于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物能夠模擬人類罹患甲肝的自然病程及轉(zhuǎn)歸，仍是甲肝相關(guān)疾病研究的理想動(dòng)物模型。而在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物之中，又?jǐn)?shù)黑猩猩和狨猴對(duì)甲肝病毒最為易感，感染HAV后能夠產(chǎn)生類似人類感染的臨床癥狀，并且不同研究結(jié)果一致。其它種類的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型對(duì)于感染HAV后產(chǎn)生的臨床癥狀，不同學(xué)者報(bào)道有所差異，故這些種類的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為HAV感染的動(dòng)物模型仍有待證實(shí)?？傊?，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物還是目前最適合作為HAV感染的動(dòng)物模型，但由于其數(shù)量稀少、飼養(yǎng)困難、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，以及動(dòng)物倫理及保護(hù)等考慮，因此，已有規(guī)定在實(shí)驗(yàn)中限制使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的數(shù)量。此外，樹鼩、豚鼠、豬及基因敲除小鼠等，都可在實(shí)驗(yàn)條件下感染HAV。但是這些種類的動(dòng)物作為HAV感染的動(dòng)物模型仍然不夠理想，在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、病理改變等方面都與靈長(zhǎng)類感染HAV不盡相同。雖然這些動(dòng)物均有局限性，但仍可被選擇作為替代的甲肝動(dòng)物模型用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

3 展 望

近年來，由于我國(guó)衛(wèi)生環(huán)境條件的改善以及甲肝疫苗的普遍接種，我國(guó)甲肝的患病率有所下降，但每年新增的甲肝患者數(shù)量告訴我們，甲型肝炎仍然是一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題。目前，在HAV的發(fā)病機(jī)制及抗病毒藥物等方面的研究仍比較缺乏。隨著對(duì)于HAV感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的進(jìn)一步研究，人們對(duì)于HAV的致病機(jī)制也會(huì)認(rèn)識(shí)得更加深入，而這對(duì)于防控甲型肝炎也有重要意義。

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