時巧翠，朱 斌

（浙江警察學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)系，杭州310053）

樣品前處理是法庭科學(xué)中毒物分析的關(guān)鍵步驟，直接影響毒物的檢出率［4］。傳統(tǒng)的樣品前處理方法如固相萃取、液液萃取等，存在操作繁瑣費時、提取率低、需要使用大量對人體和環(huán)境有毒害作用的有機溶劑等問題［5－6］。介質(zhì)液液萃取（SLE）是1997年由Johnson提出的一種新型的樣品前處理技術(shù)［7］。與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，SLE具有操作簡便，能大大縮短樣品提取時間，回收率高，基質(zhì)干擾小，可以應(yīng)用于以96孔板結(jié)構(gòu)為代表的高通量體系等特點。SLE已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析，食品安全等方面［8－10］，但在法庭科學(xué)中的應(yīng)用鮮有報道［11］。

目前，測定血液中唑吡坦和扎萊普隆的方法主要有氣相色譜法［12］、液相色譜法［13］、氣相色譜－質(zhì)譜法［14］及液相色譜－質(zhì)譜法［15］等。但這些方法均存在靈敏度較低，分析時間略長等缺點。本工作建立了介質(zhì)液液萃?。咝б合嗌V－三重四極桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（SLE－HPLC QTRAP－MS／MS）測定血液中唑吡坦和扎萊普隆含量的方法。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Biotage ISOLUTE SLE 1mL 介質(zhì)液液萃取柱；Shimazu LC 20A／AB Sciex Qtrap 6500型高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀。

唑吡坦標(biāo)準儲備溶液：1．000g·L－1，使用時用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

扎萊普隆標(biāo)準儲備溶液：1．000g·L－1。

緩沖溶液：pH 7的緩沖溶液以飽和氯化鈉溶液代替；用0．2mol·L－1氨水和0．2mol·L－1氯化銨溶液按比例配制成pH 9的緩沖溶液；0．2mol·L－1乙酸銨溶液作為pH 10的標(biāo)準緩沖溶液；用0．2mol·L－1氫氧化鈉溶液和0．2mol·L－1氯化鉀溶液按比例配制成pH 12和pH 13的緩沖溶液。

乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷均為分析純；甲酸、乙酸銨、乙腈均為色譜純。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Kinetex C18色譜柱（50mm×3．0mm，2．6μm），柱溫40℃；進樣量5μL；流量0．5mL·min－1；流動相 A為含5mmol·L－1乙酸銨的0．1%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0．0～4．0min時，B為10%；4．0～4．1min時，B由10%升至90%，保持2min；6．0～6．1min時，B由90%降至10%，保持3min。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；輔助加熱氣溫度500℃；離子化電壓5 500V；氣簾氣壓力275．8kPa；碰撞氣為氮氣，壓力選擇 Medium；噴霧氣壓力344．7kPa；輔助加熱氣壓力344．7kPa。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中“＊”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

1．3 試驗方法

移取含有唑吡坦與扎萊普隆的血液0．50mL，加入pH 10的緩沖溶液0．3mL?；靹蚝髮悠芳尤虢橘|(zhì)液液萃取柱中，施加壓力，使樣品全部均勻分散在填料上后，靜置2min。用二氯甲烷8mL洗脫，控制其流量在1mL·min－1左右，最后施加壓力將柱中殘余的二氯甲烷擠出。洗脫液用氮氣吹干后，用初始流動相溶解并定容至0．50mL，在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

唑吡坦和扎萊普隆的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 唑吡坦和扎萊普隆的總離子流色譜圖Fig．1 TIC chromatogram of zolpidem and zaleplon

2．2 SLE萃取條件的選擇

以空白血液為基質(zhì)，分別配制含有1．0μg·L－1唑吡坦與10μg·L－1扎萊普隆的標(biāo)準溶液，按儀器工作條件進行測定。

2．2．1 萃取劑

選用pH 10的緩沖溶液、平衡時間2min、溶劑使用量6mL，試驗分別考察了乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷等萃取劑的萃取效果。結(jié)果表明：二氯甲烷作為萃取劑時，效果較好，這可能是因為唑吡坦與扎萊普隆在二氯甲烷中有較好的溶解度。試驗選擇二氯甲烷為萃取劑。

2．2．2 萃取劑用量

選用pH 10的緩沖溶液、平衡時間2min，試驗考察了二氯甲烷用量分別為4，6，8，10mL時唑吡坦與扎萊普隆的回收率。結(jié)果表明：隨著二氯甲烷用量的增加，唑吡坦和扎萊普隆的回收率也逐漸提高，但當(dāng)二氯甲烷的用量為8，10mL時，兩種藥物回收率趨于穩(wěn)定。試驗選擇二氯甲烷的用量為8mL。

2．2．3 緩沖溶液酸度

固定平衡時間2min、萃取劑二氯甲烷6mL，試驗考察了緩沖溶液pH 分別為7，9，10，12，13時唑吡坦和扎萊普隆的萃取回收率。結(jié)果表明：隨著緩沖溶液pH的增大，唑吡坦和扎萊普隆的回收率也逐漸提高。但當(dāng)緩沖溶液的pH由10增大至13時，兩種藥物的回收率相差很小?？紤]到堿性太強，血液容易凝固而堵塞SLE萃取柱，試驗選擇pH為10的緩沖溶液。

2．2．4 平衡時間

在緩沖溶液pH為10、萃取劑二氯甲烷6mL的條件下，樣品均勻分散在介質(zhì)液液萃取柱填料上以后，試驗考察了靜置時間分別為2，5，8，10min時唑吡坦和扎萊普隆的萃取回收率。結(jié)果表明：平衡時間對目標(biāo)物回收率的影響較小。試驗選擇平衡時間為2min。

2．3 色譜條件的選擇

試驗分別比較了0．1%甲酸－甲醇、0．1%甲酸－乙腈、0．1%甲醇－乙腈和水－乙腈4種流動相體系對分析結(jié)果的影響。結(jié)果表明：流動相選用0．1%甲酸－乙腈體系時峰形更好，分離效果更優(yōu)，因此流動相選擇0．1%甲酸－乙腈體系進行梯度洗脫。添加不同體積分數(shù)的甲酸（0．1‰，0．5‰，1‰）、乙酸（0．1‰，0．2‰，0．5‰），不同濃度的乙酸銨（0．5，1，5mmol·L－1），結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 在 流 動 相 中 加 入5mmol·L－1乙酸銨不僅可以改善待測化合物的峰形，同時還可以增加待測物質(zhì)的響應(yīng)值。試驗選擇在0．1%甲酸的流動相中加入了5mmol·L－1乙酸銨，以提高方法的靈敏度。優(yōu)化的色譜條件見1．2節(jié)。

2．4 質(zhì)譜條件的選擇

試驗采用ESI正離子模式作為其離子化方式。取質(zhì)量濃度均為0．100g·L－1的吡唑坦、扎萊普隆標(biāo)準溶液，采用微量蠕動泵連續(xù)進樣，一級質(zhì)譜全掃描，確定準分子離子。結(jié)果顯示唑吡坦與扎萊普隆均在正離子模式下獲得準分子離子峰。唑吡坦與扎萊普隆的準分子離子峰分別為m／z308．1，306．1。以唑吡坦與扎萊普隆的準分子離子峰為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選豐度最高的兩個特征碎片離子作為定性定量離子，并優(yōu)化相應(yīng)離子對的去簇電壓、碰撞能量、碰撞室出口電壓和入口電壓。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2．5 標(biāo)準曲線和檢出限

以空白血液為基質(zhì)，分別配制唑吡坦的質(zhì)量濃度為 0．10，0．20，0．50，1．00，2．00，5．00，10．00μg·L－1，扎萊普隆的質(zhì)量濃度為 1．00，2．00，5．00，10．00，20．00，50．00，100．0μg·L－1的標(biāo)準混合溶液系列，按儀器工作條件進行測定。以藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，唑吡坦和扎萊普隆的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

按3倍信噪比計算方法的檢出限（3S／N），其結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)及檢出限Tab．2 Linearity parameters and detection limits

2．6 精密度和回收試驗

取空白血液，在線性范圍內(nèi)分別加入質(zhì)量濃度為0．20，2．00，10．00μg·L－1的唑吡坦和2．00，10．00，25．00μg·L－1的扎萊普隆，按試驗方法平行測定6次，其加標(biāo)回收率和測定值的相對標(biāo)準偏差（RSD）見表3。

由表3可知：兩種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率在85．0%～103%之間，RSD在3．5%～8．5%之間。

2．7 樣品分析

案例1：某女46歲，長期受失眠困擾。一天其被發(fā)現(xiàn)在家中自殺身亡。抽取該女子心臟內(nèi)血液按照試驗方法進行檢測分析，結(jié)果在其血液中檢出唑吡坦的質(zhì)量濃度為1．26mg·L－1，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2（a）。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab．3 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

案例2：某女38歲，因與其丈夫吵架而吞服大量Sonata自殺身亡。抽取其心臟內(nèi)血液按照試驗方法進行測定，結(jié)果在其血液中檢出扎萊普隆的質(zhì)量濃度為46．7μg·L－1，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2（b）。

圖2 樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig．2 MRM chromatograms of samples

本工作建立了高效液相色譜－三重四極桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜結(jié)合介質(zhì)液液萃取技術(shù)測定血液中的唑吡坦和扎萊普隆的分析方法，優(yōu)化了介質(zhì)液液萃取試驗條件及高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的儀器條件，對血液中的這兩種藥物進行了定性與定量分析。方法具有較高的靈敏度、回收率和精密度，能有效測定血液中唑吡坦與扎萊普隆的含量，可滿足偵查、訴訟及醫(yī)療急救的檢測要求。

［1］ SANGER D J，MOREL E，PERRAULT G．Comparison of the pharmacological profiles of the hypnotic drugs，zaleplon and zolpidem［J］．European Journal of Pharmacology，1996，313（1／2）：35－42．

［2］ GIROUD C，AUGSBURGER M，MENETREY A，et al．Determination of zaleplon and zolpidem by liquid chromatography－turbo－ionspray mass spectrometry：application to forensic cases［J］．Journal of Chromatography B，2003，789（1）：131－138．

［3］ 張蕾萍，于忠山，何毅，等．法庭鑒定中的新型催眠藥［J］．刑事技術(shù)，2008（5）：37－40．

［4］ OSEMWENGIE L I，STEINBERG S．On－site solidphase extraction and laboratory analysis of ultra－trace synthetic musks in municipal sewage effluent using gas chromatography－mass spectrometry in the full－scan mode［J］．Journal of Chromatography A，2001，932（1／2）：107－118．

［5］ BESTER K．Analysis of musk fragrances in environmental samples［J］．Journal of Chromatography A，2009，1216（3）：470－480．

［6］ PIETROGRANDE M C，BASAGLIA G，DONDI F．Signal processing to evaluate parameters affecting SPE for multi－residue analysis of personal care products［J］．Journal of Separation Science，2009，32（9）：1249－1261．

［7］ HARA K，KASHIMURA S，HIEDA Y，et al．Simple extractive derivatization of methamphetamine and its metabolites in biological materials with Extrelut columns for their GC－MS determination［J］．Journal of Analytical Toxicology，1997，21（1）：54－58．

［8］ LIU H T，HUANG L P，CHEN Y X．Simultaneous determination of polycyclic musks in blood and urine by solid supported liquid－liquid extraction and gas chromatography－tandem mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography B，2015，992：96－102．

［9］ RAMES B，MANJUL N，RAMAKRISHNA S，et al．Direct injection HILIC－MS／MS analysis of darunavir in rat plasma applying supported liquid extraction［J］．Journal of Pharmaceutical Analysis，2015，5（1）：43－50．

［10］ ALBERO B，SNCHEZ－BRUNETE C， MIGUEL E，et al．Determination of selected pharmaceutical compounds in biosolids by supported liquid extraction and gas chromatography－tandem mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2014，1336：52－58．

［11］ ROSITANO J，HARPAS P，KOSTAKIS C，et al．Supported liquid extraction（SLE）for the analysis of methylamphetamine， methylenedioxymethylamphetamine and delta－9－tetrahydrocannabinol in oral fluid and blood of drivers［J］．Forensic Science International，2016，265：125－130．

［12］ DEBRUYNE D，LACOTTE J， HURAULT DE LIGNY B，et al．Determination of zolpidem and zopiclone in serum by capillary column gas chromatography［J］．Journal of Pharmaceutical Sciences，1991，80（1）：71－74．

［13］ METWALLY F H， ABDELKAWY M， ABDEL－WAHAB N S．Application of spectrophotometric，densitometric and HPLC techniques as stability indicating methods for determination of zaleplon in pharmaceutical preparations［J］．Spectrochimica Acta Part A，2007，68（5）：1220－1230．

［14］ KELLER T，SCHNEIDER A，TUTSCH－BAUER E．GC／MS determination of zolpidem in postmortem specimens in a voluntary intoxication［J］．Forensic Science International，1999，106（2）：103－108．

［15］ HORSTKOTTER C，SCHEPMANN D，BLASCHKE G．Separation and identification of zaleplon metabolites in human urine using capillary electrophoresis with laser－induced fluorescence detection and liquid chromatography－mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2003，1014（1／2）：71－81．