（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

1 前言

對于生豬養(yǎng)殖來說，豬繁殖障礙性疾病可以說是極為常見的疾病之一，而這其中豬藍(lán)耳病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒所引發(fā)的繁殖障礙是最為常見的。但是無論是哪一種病毒所引發(fā)的，疾病的癥狀有類似之處，那就是母豬易出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，如果公豬的話，容易初心繁殖性障礙，如果是仔豬的話，以呼吸道癥狀為明顯，死亡率也很高，關(guān)鍵是仔豬還很容易出現(xiàn)一些繼發(fā)性感染和混合性的感染，進(jìn)而給治療帶來極大的困難。在這樣的現(xiàn)實背景下，及時對病原做出診斷，并且進(jìn)行分離，依托血清學(xué)的調(diào)查，對上述幾種病毒的免疫情況和感染情況進(jìn)行初步確定，通過PCR的方法再對已經(jīng)確診的病原進(jìn)行陽性病料的快速篩查，從而能夠為快速分離鑒定病原提供有力的保障。

2 關(guān)于豬繁殖障礙性疾病病原鑒定的研究與分析

2.1 試驗的材料

在病料方面，主要是從某豬場流產(chǎn)的母豬采集到8份血清，3頭流產(chǎn)的胎兒。在這個豬場，經(jīng)產(chǎn)的母豬以及后備的母豬都已經(jīng)進(jìn)行過豬乙型腦炎、細(xì)小病毒、圓環(huán)病毒以及豬瘟、繁殖與呼吸綜合征疫苗的接種，但是并沒有進(jìn)行過豬偽狂犬病疫苗的接種。

在試劑方面，用到的主要就是豬瘟抗體、豬繁殖與呼吸綜合征、主乙型腦炎、豬偽狂犬病以及豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒抗體檢測試劑盒，都是從某生物科技有限公司購買的。

2.2 試驗的方法

試驗的方法主要有ELISA檢測和陽性病料的PCR篩選等。

首先，關(guān)于ELISA檢測，對血清前血液樣品進(jìn)行離心分離處理，并且在37℃的條件下靜置，時間大約是15min，然后再把它放置到冰箱中，溫度控制在4℃，時間大約是20min，之后再將其在室溫的條件下進(jìn)行處理，離心處理建議按照4000轉(zhuǎn)/min的速度進(jìn)行，處理時間大約是5min，然后再把上清液進(jìn)行收集，收集到EP管中，做好標(biāo)記之后，根據(jù)試劑盒的實際要求，將稀釋后的血清分別進(jìn)行上面所提到六種病毒的ELISA抗體的檢測。

其次，關(guān)于陽性病料的PCR篩選，第一步就是要對病料DNA的核酸進(jìn)行提取，具體的做法就是取流產(chǎn)仔豬的腦、腎臟和脾臟等組織適量，對其進(jìn)行研磨處理，研磨要充分，一直到研磨成均勻的漿狀方可停止，然后將兩毫升的分離緩沖液加入，待混合均勻之后，將組織懸液取出，劑量大約是400μl，去除之后放到實現(xiàn)準(zhǔn)備好的容器中，采用科學(xué)的方法，對DNA進(jìn)行提取，放置到冰箱中留以備用，溫度條件控制在零下20℃。接下來需要做好引物的設(shè)計和PCR的擴(kuò)增處理。

3 關(guān)于結(jié)果與分析

3.1 ELISA抗體血清學(xué)檢測

從實驗的數(shù)據(jù)中，我們可以看出，PRRSV、CSFV、PCV2、JEV和PPV以及PRV的陽性率分別是75%、87.5%和100%，這也就是說這個生豬養(yǎng)殖場的抗體合格率都已經(jīng)超過了70%，已經(jīng)達(dá)到了相關(guān)規(guī)定對此的要求。雖然這個養(yǎng)殖場并沒有進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗的接種免疫工作，但是陽性率卻是100%。這樣的話，就是說這個養(yǎng)殖場疑似感染了豬偽狂犬病毒野毒，為了進(jìn)一步確診，就需要進(jìn)行PRV和PCR的核酸分子檢測。

3.2 PCR的擴(kuò)增

對于送檢的流產(chǎn)胎兒病料進(jìn)行DNA的提取，經(jīng)過PCR的擴(kuò)增，所獲取的兩份病料和預(yù)期目的片段的大小是相符的特異性條帶。

4 結(jié)語

依托六種病毒的ELISA抗體血清學(xué)的檢測結(jié)果，立足于該生豬養(yǎng)殖場的免疫背景，在PRRSV、CSFV、PCV2以及JEV和PPV的陽性抗體合格率都達(dá)到了70%以上，而PRV的抗體陽性率則是100%，這個豬場雖然沒有進(jìn)行該種疫苗的接種免疫，這就說明疑似感染了野毒，從而為病原陽性病料的快速篩選奠定了有力的基礎(chǔ)。通過對上面所提到六種能夠?qū)е履肛i流產(chǎn)疾病進(jìn)行的ELISA血清抗體檢測的結(jié)果來看，分別對送檢的三份病料進(jìn)行PRV和PCR核酸檢測，結(jié)果有兩份病料是感染了PRV野毒的。

另外，偽狂犬病發(fā)病之后，發(fā)熱、癢以及腦脊髓炎都是主要的癥狀表現(xiàn)，再加上這是一種急性傳染病，危害嚴(yán)重。事實上，對于偽狂犬病來說，生豬是最為主要的寄主和傳染源，因此很容易導(dǎo)致母豬的繁殖障礙和仔豬的批量死亡。

事實上，PCR和ELISA在生豬養(yǎng)殖場繁殖障礙性疾病中的配合使用，不僅僅可以實現(xiàn)對上述疾病的血清學(xué)抗體檢測，同時依托于檢測的結(jié)果，再依托對病料的PCR核酸特異性檢測，就可以對陽性病料進(jìn)行確定，這樣的話，就有效避免了病料確定時候的盲目性，分離與鑒定工作也更加迅速。

[1] 劉志杰，李如舉，周莉，等.豬繁殖障礙性疾病的病原鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（8）：136-137.

[2] 劉志杰，湯德元，周莉，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43（9）：1429-1436.

[3] 孫剛，郭昭林，楊本，等.黑龍江省種豬場母豬繁殖障礙性疾病的監(jiān)測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，（7）：29-30.