血液系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)外泌體研究進展①

李偉偉 李歸冀 樊 華 李劍平

(沈陽中心血站(遼寧省血液中心)，沈陽 110044)

外泌體越來越多地被認(rèn)為是疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)后因子而進行廣泛研究。外泌體應(yīng)用在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的診療研究方面進展迅速，研究熱點主要集中在：外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，外泌體miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，外泌體作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物和外泌體相關(guān)的腫瘤化療耐藥等幾大方面。本文將就血液系統(tǒng)惡性腫瘤外泌體的最新研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

外泌體(Exosomes)，也被稱為細(xì)胞外囊泡(small extracellular vesicle,sEV)是一種在生理和病理情況下由細(xì)胞分泌的直徑30～120 nm，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNAs等分子，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)微小膜泡[1-3]。是在真核細(xì)胞內(nèi)的多泡小體中形成分泌囊泡的一種亞型[4]，當(dāng)這些多泡小體與質(zhì)膜融合時分泌到細(xì)胞外。雖然囊泡亞型的研究越來越細(xì)化，但由于檢測手段的限制，研究者們?nèi)远鄬⑸鲜鲋睆椒秶鷥?nèi)的各亞型分泌囊泡統(tǒng)稱為外泌體[5]。

外泌體具有靶向輸送的能力，且其脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)是內(nèi)包被物的天然保護屏障。生理情況下可通過受體介導(dǎo)的交互作用直接刺激靶細(xì)胞[6]，或通過向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移各種生物活性分子，參與原核生物和高等真核生物細(xì)胞之間的生物信號傳遞，發(fā)揮其生物學(xué)功能[7，8]。隨著近幾年外泌體研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤疾病狀態(tài)下，機體細(xì)胞分泌的外泌體其組分、數(shù)量和功能與生理條件下相比都會發(fā)生改變：腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可包含腫瘤特異性蛋白和RNAs分子等，大部分腫瘤細(xì)胞分泌數(shù)量更多的外泌體顆粒，腫瘤細(xì)胞外泌體參與腫瘤細(xì)胞間信息傳遞與免疫調(diào)節(jié)，腫瘤外泌體可作為腫瘤疾病診斷的生物標(biāo)志物。

在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體(Tumor-derived exosomes,TEX)重新編程腫瘤微環(huán)境，抑制機體抗白血病免疫，介導(dǎo)腫瘤耐藥并干擾機體免疫治療和參與血液腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，因此TEX被視為抗血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有希望的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點。

2 外泌體的分離提取與鑒定

2.1外泌體的分離提取 外泌體的純度是外泌體相關(guān)研究中最重要的問題。外泌體研究的關(guān)鍵步驟是如何從不同樣本中獲取一定濃度的高純度的外泌體樣本。外泌體的富集主要有傳統(tǒng)的高通量方法和較新的微流控、非接觸和免疫吸附法等。傳統(tǒng)的高通量方法主要包括：超速離心法、沉淀法、分子排阻法和場流分級法等，目前較多采用的提取方法有高速離心法、沉淀試劑盒法等。梯度密度離心法是公認(rèn)的獲取高純度外泌體的方法，但是操作相對復(fù)雜[9，10]；沉淀試劑盒法實驗操作相對簡單但外泌體純度一般，其沉淀物中多有鐵蛋白、病毒顆粒等存在，電鏡檢測時較難觀察到典型的茶托樣具有清晰膜結(jié)構(gòu)的納米粒子外泌體圖像[11，12]。

2.2外泌體的鑒定 外泌體的鑒定是外泌體分離獲取后的重點和難點問題，只有經(jīng)過多種方法鑒定均滿足外泌體標(biāo)準(zhǔn)的沉淀獲取物才可以被稱為外泌體而進行下游實驗。精準(zhǔn)和絕對的外泌體尺寸規(guī)范還沒有明確定義。2006年，外泌體領(lǐng)域?qū)＜业谝淮伟l(fā)表了膠體金電鏡顯示的典型外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)圖[13]，至今仍然為外泌體研究者們提供了經(jīng)典的研究方法和圖像參考。

目前為止，外泌體純度、活性和提取鑒定標(biāo)準(zhǔn)仍以實驗室標(biāo)準(zhǔn)為主。外泌體鑒定的常規(guī)方法包括：透射電鏡進行外泌體結(jié)構(gòu)觀察、沉淀物粒子直徑測量和Western blot檢測外泌體蛋白，當(dāng)透射電鏡無法觀察到外泌體典型形態(tài)時，需加做免疫膠體金電鏡實驗進行進一步觀察。透射電鏡可以觀察到外泌體為茶托樣具有清晰的膜結(jié)構(gòu)；粒子直徑分析系統(tǒng)測量顆粒物直徑在30～120 nm之間(多數(shù)小于100 nm)；Western blot檢測CD81、CD63和Hsp70等多種外泌體標(biāo)志蛋白均陽性表達；免疫膠體金電鏡觀察到免疫膠體金顆粒較牢固的吸附于外泌體膜結(jié)構(gòu)表面。目前研究者們已經(jīng)建立了專門針對細(xì)胞培養(yǎng)上清、新鮮血漿和凍存血漿外泌體提取方案[14]，可重復(fù)、大規(guī)模和高通量的臨床級外泌體生產(chǎn)純化方案[15]，并采用電鏡、納米粒徑分析和蛋白印跡等方法對沉淀物進行檢測，均取得了較好的實驗效果。

3 外泌體與血液系統(tǒng)惡性腫瘤

3.1白血病 白血病是血液系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤疾病，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷對指導(dǎo)患者臨床用藥、靶向治療和判斷疾病預(yù)后都具有重要臨床意義。

3.1.1急性骨髓性白血病 急性骨髓性白血病是(Acute myeloid leukemia，AML)是一種造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化受阻并無序增殖的惡性血液系統(tǒng)疾病，若不采取有效治療則會迅速進入骨髓衰竭期[16]。然而人類對此病的微環(huán)境調(diào)控機制仍知之甚少。最新研究證實AML通過分泌外泌體將骨髓微環(huán)境重建成有利于白血病細(xì)胞生長和抑制正常造血功能的微環(huán)境[17]，AML衍生的外泌體通過抑制正常造血因子DKK1的表達和誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的造血干細(xì)胞促進因子(CXCL 12、KITL和IGF1等)廣泛下調(diào)，而營造有利于白血病細(xì)胞增殖和存活的微環(huán)境[18]。AML外泌體還可以促進健康造血干細(xì)胞生存并誘導(dǎo)白血病樣功能特征，使miR21和miR29等過表達[19]。外泌體不但在腫瘤微環(huán)境構(gòu)建中發(fā)揮重要作用，還介導(dǎo)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的信息傳遞，白血病干細(xì)胞源性外泌體可以促進AML細(xì)胞的增殖、遷移并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

3.1.2急性淋巴細(xì)胞白血病 急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是兒童白血病的主要類型且目前治愈成功率較高，但患兒仍然要承受多次重復(fù)骨髓活檢所帶來的巨大痛苦。原發(fā)性ALL和相應(yīng)細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞都會釋放具有完整細(xì)胞器和組織細(xì)胞骨架的膜結(jié)構(gòu)大囊泡，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要結(jié)構(gòu)介質(zhì)[20]。研究人員還依據(jù)ALL外泌體包含肌動蛋白等囊泡分支結(jié)構(gòu)，建立了一種對患者血液中的ALL外泌體進行追蹤的實驗技術(shù)，為急性粒細(xì)胞白血病的診斷、藥物治療和顯著減輕患兒痛苦提供了啟示[21]。該技術(shù)的建立為腫瘤外泌體是否可以提供腫瘤個性化信息及后續(xù)能否以此為依據(jù)開展個性化治療提供了較好的科研思路和實驗基礎(chǔ)。

3.1.3慢性淋巴細(xì)胞白血病 慢性淋巴細(xì)胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL)是成人常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，外泌體相關(guān)研究主要集中在外泌體介導(dǎo)骨髓基質(zhì)與CLL腫瘤細(xì)胞之間信息交換、生物標(biāo)志物鑒定、免疫逃逸、惡性轉(zhuǎn)化和化療耐藥等幾大方面。

外泌體在慢性淋巴細(xì)胞白血病B細(xì)胞與骨髓微環(huán)境之間通訊具有關(guān)鍵作用[22，23]：通過對外泌體在CLL與微環(huán)境的相互作用關(guān)系進行深入研究發(fā)現(xiàn)，一方面CLL外泌體通過調(diào)節(jié)AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)VEGF等CLL促進因子高表達，進行腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)；另一方面，微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源外泌體能夠增強CLL B細(xì)胞的遷徙能力和化療耐藥性，并幫助CLL白血病細(xì)胞逃離自發(fā)或藥物誘導(dǎo)凋亡。

CLL相關(guān)外泌體還參與腫瘤患者機體免疫調(diào)節(jié)。CLL小鼠單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面攜帶較多PD-L1受體，其衍生的外泌體RNA促進CLL患者單核細(xì)胞免疫抑制表型蛋白程序性死亡配體1(PD-L1)的表達，PD-L1免疫抑制點的調(diào)節(jié)為CLL患者供了一種新的免疫治療預(yù)選方案[24]。研究者們對外泌體作為CLL物標(biāo)志的研究較深入，CD19+、CD37+、CD52+外泌體和miRNA155+等均是CLL臨床分期和指導(dǎo)用藥的較好指標(biāo)，含有CLL“白血病”轉(zhuǎn)錄物的外泌體還能夠?qū)⑵湎嚓P(guān)miRNA向健康間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞傳遞，使其惡性增殖轉(zhuǎn)化。

3.2淋巴瘤

3.2.1非霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin′s lymphoma,HL)是血液系統(tǒng)腫瘤研究較深入的一種高發(fā)性淋巴瘤，1997年以CD20為靶點的非霍奇金淋巴瘤靶向藥(也是人類歷史上的首個癌癥靶向藥)——利妥昔單抗(Rituxima)在美國獲批上市，從此癌癥的靶向治療進入了一個全新的快速發(fā)展階段[25]。通過大樣本臨床試驗發(fā)現(xiàn)，非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤患者血漿外泌體中含有C-MYC、BCL-XL、PTEN、AKT和BCL-6等多種mRNAs，是對腫瘤一線藥物治療無效的統(tǒng)計學(xué)顯著性預(yù)測因子，可以對腫瘤進行檢測和預(yù)后判斷[26]：C-MYC mRNA與患者無進展生存期負(fù)相關(guān)；首次復(fù)發(fā)和疾病進展期患者外泌體BCL-XL和PTEN mRNA低表達；BCL-6 mRNA的表達含量與患者死亡率正相關(guān)，上述多種外泌體相關(guān)標(biāo)志物的鑒定為非霍奇金淋巴瘤的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。而當(dāng)腫瘤中外泌體CD20陽性表達時，外泌體可以截獲Rituximab，使抗體與靶細(xì)胞的結(jié)合率降低，幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[27]。

3.2.2霍奇金淋巴瘤 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma,HL)是較高發(fā)的中老年血液系統(tǒng)腫瘤，埃博斯坦巴爾病毒(EBV)檢測多為陽性表達[28,29]。研究證實EBV可以通過其外泌體途徑使腫瘤中的巨噬細(xì)胞感染病毒并加速淋巴瘤的發(fā)展進程[30]。

3.3血液系統(tǒng)其他惡性腫瘤 多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者循環(huán)外泌體miRNA對患者診斷和預(yù)后判斷具有指導(dǎo)意義。MM患者血清中檢測到外泌體存在，且通過實時定量PCR技術(shù)共分析了外泌體中22個miRNA，發(fā)現(xiàn)let-7b和miR-18a與患者無進展生存期和總生存期顯著相關(guān)[31]。骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)患者外泌體可以通過傳遞miRNA、mRNA和蛋白質(zhì)等介導(dǎo)骨髓基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞之間的信息交通[32]。與正常造血細(xì)胞相比較，IL-3受體在慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelocytic leukemia，CML)母細(xì)胞中過表達，可作為靶向給藥的靶標(biāo)。與傳統(tǒng)直接給藥組相比較，通過改造外泌體使其靶向CML-IL3R遞送抗腫瘤藥物-伊馬替尼，外泌體給藥組可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長[33]。

4 結(jié)語與展望

研究表明外泌體在血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，尤其是各種外泌體相關(guān)腫瘤生物標(biāo)志物的成功鑒定為無創(chuàng)液體活檢提供了廣泛可能。如何生產(chǎn)出安全、靶向能力強、易于獲取和高純度的臨床級別外泌體仍是外泌體研究領(lǐng)域的重點。雖然研究人員不斷創(chuàng)新，建立了可以循環(huán)利用細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)生產(chǎn)高濃度的細(xì)胞外泌體的中空纖維生物反應(yīng)器和基于超順磁納米粒子簇快速獲取高純度外泌體的新方法[34]，但總體來講，仍存在很大局限性和不確定性，有關(guān)外泌體活體回輸后遠期效應(yīng)的研究仍較少涉獵，其免疫調(diào)節(jié)能力也仍需進一步廣泛深入研究[35]。隨著不斷深入的研究，以外泌體為基礎(chǔ)的診療體系必將會不斷完善，將為廣大血液病腫瘤患者診斷、治療和預(yù)后開辟了新的臨床診療視角。