徐小雄 馮慧敏 徐云升 孫宏元

摘 要 為從海南野生阿寬蕉居群根際土壤中篩選出具有較高酶活的產(chǎn)纖維素酶的放線菌，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，從而探索阿寬蕉居群根際土壤產(chǎn)纖維素酶的潛力。從海南不同的野生阿寬蕉居群采集7份根際土壤，采用GA培養(yǎng)基和HV培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性分離放線菌，采用剛果紅染色法對(duì)分離得到菌株進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶活性篩選，并對(duì)具有活性的菌株進(jìn)行16S rRNA鑒定，以確定其分類地位。結(jié)果表明：從7份野生阿寬蕉根際土壤中共分離得到210株放線菌。其中，55株菌具有纖維素酶活性，12株菌表現(xiàn)出強(qiáng)活性。16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，它們屬于放線菌綱下5個(gè)亞目6個(gè)科8個(gè)屬，分別為鏈霉菌屬、小單孢菌屬、野野村氏菌屬、疣孢菌屬、戈登氏菌屬、假諾卡氏菌屬、擬諾卡氏菌屬和球孢囊菌屬，其中鏈霉菌屬、小單菌屬和野野村氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。菌株X2303、X2502和X2733與已知菌的序列相似率最高，分別為98.52%、98.79%和99.11%，可能分別為鏈霉菌屬、戈登氏菌屬和疣孢菌屬潛在的新分類單元。具有最高纖維素酶活性的菌株X2407為鏈霉菌，其與Streptomyces iranensis的16S rRNA基因序列相似率最高，為99.64%，具有較高的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。所以，海南野生阿寬蕉根際土壤中存在產(chǎn)纖維素酶的放線菌資源，主要以鏈霉菌為主。阿寬蕉根際土壤中存在一些新的放線菌分類單元。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；放線菌 ；纖維素酶 ；多樣性

中圖分類號(hào) S668.1 ；Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.012

Abstract Actinobacteria producing cellulase in the rhizospheric soil of Musa itinerans in Hainan was isolated and identified by using 16S rRNA gene sequences to explore potential cellulase resources from those habitats. Seven rhizospheric soil samples were collected from M. itinerans populations in Hainan. GA and HV media were used to isolate actinobacteria selectively. The cellulase-producing activities of the isolated strains were screened and preliminarily identified by using 16S rRNA. The results showed that a total of 210 actinobacterial strains were isolated， of which 55 strains had cellulase activity and 12 strains showed strong activity. The results of 16S rRNA gene analysis showed that these strains belonged to 5 suborders， 6 families and 8 genera. These 8 genera included Streptomyces， Micromonospora， Nonomuraea， Verrucosispora， Gordonia， Pseudonocardia， Nocardiopsis and Sphaerisporangium， of which Streptomyces， Micromonospora and Nonomuraea were dominant cellulase-producing genera. Strains X2303， X2502 and X2733 were similar to the known bacteria in sequence， and their similarities were 98.52%， 98.79% and 99.11%， respectively. The Strains X2303， X2502 and X2733 are potential new taxonomic units for Streptomyces， Gordonia and Verrucosispora， respecitvely. The Strain X2407 belonged to Streptomyces which showed the highest cellulase activity， and it had the highest similarity （99.64%） of 16S rRNA gene sequence to Streptomyces iranensis. It had high value for development and application. Cellulase-producing actinobacteria resources in the rhizosphere soil of M. itinerans in Hainan were mainly under Streptomyces. Some new taxonomic units of actinobacteria were detected in the rhizosphere soil of M. itinerans.

Keywords banana ； actinobacteria ； cellulase ； diversity

香蕉為芭蕉科（Musacase）芭蕉屬（Musa L.）大型單子葉草本植物[1-2]，國(guó)際糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）認(rèn)定其為僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物，也是熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要水果作物，在全球超過130個(gè)熱帶和亞熱帶國(guó)家廣泛種植。就我國(guó)而言，2015年，我國(guó)香蕉種植面積為39.33萬hm2，生產(chǎn)總量為1 211萬t，年產(chǎn)值達(dá)到229億元[3]。

香蕉具有速生和生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)，其莖干數(shù)量較多，纖維含量高[4]。但是每年香蕉收獲季節(jié)，香蕉果實(shí)收割后，大量的香蕉莖干被丟棄，當(dāng)作廢物四處堆放，這既造成資源浪費(fèi)也易帶來環(huán)境污染[5]。史倩青[6]的研究表明，香蕉莖干中干物質(zhì)的化學(xué)成分主要是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中，纖維素含量為58.5%～76.1%，半纖維素28.5%～29.9%，木質(zhì)素4.8%～6.13%，由于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量高，在自然條件下，香蕉莖干難以被降解[7]。因此，研究篩選出對(duì)香蕉莖干具有較強(qiáng)專一性的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行發(fā)酵，將可實(shí)現(xiàn)香蕉莖干的快速分解和再利用，從而提高丟棄的香蕉莖干纖維資源的再利用率。楊禮富等[8]從23份堆肥、森林表土、蕉園耕作層土和糖水廢水污泥樣品中分離到纖維素酶高產(chǎn)菌和木質(zhì)素酶高產(chǎn)菌各2株，并對(duì)香蕉莖葉表現(xiàn)出較高的酶活。文少白等[9]從香蕉種植園腐爛的香蕉莖稈中分離到8株具有酶活的菌株。其中，細(xì)菌3株，放線菌4株，真菌1株。并認(rèn)為，自然界中能利用香蕉桿的放線菌、細(xì)菌很多，但大多數(shù)對(duì)香蕉桿纖維素的降解能力不強(qiáng)。施娟娟[10]從腐爛蕉頭中分離到4株細(xì)菌和2株真菌具有一定的酶活。雖然對(duì)香蕉莖干纖維素降解的菌株已有部分研究報(bào)道，但是篩選到的菌株較少，專一性不強(qiáng)。

阿寬蕉（Musa itinerans Cheesman）隸屬于芭蕉科芭蕉屬[11]，是野生香蕉種質(zhì)，該物種克隆生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，容易形成單種群優(yōu)勢(shì)群落[12]，是我國(guó)分布最廣的野生蕉[13]，也是海南分布的唯一野生蕉[14]，并且是熱帶亞熱帶次生林的先鋒植物[15]。在野生阿寬蕉居群中，莖干枯萎凋亡后只能依賴環(huán)境自然降解。根據(jù)達(dá)爾文進(jìn)化論中自然選擇的原則推測(cè)，在野生阿寬蕉居群的根際土壤中可能存在豐富的纖維素酶系，并且這種纖維素酶系可能對(duì)香蕉莖干的降解具有較強(qiáng)的專一性。

本研究以海南野生蕉根際土壤放線菌資源為研究對(duì)象，通過純培養(yǎng)和分子生物學(xué)手段，探索海南野生蕉居群根際土壤放線菌資源多樣性及其纖維素酶應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

7份樣品均采自海南省中部地區(qū)，所采集的土樣均為分布有大片野生阿寬蕉居群的根際土壤。從居群內(nèi)采集5株間距在2 m以上的野生阿寬蕉的根際土壤，采用抖落法采集根際土壤，將各樣品混合后，放無菌的封口袋，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，攤開后置于陰涼處自然風(fēng)干，待用。樣品信息見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1） 分離培養(yǎng)基

葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基（GA）[16]：葡萄糖 2 g，天門冬素 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O定容至1L，pH為7.2～7.4。

腐殖酸培養(yǎng)基（HV）[17]：腐殖酸1.0 g，CaCO3 0.02 g，Na2HPO4 0.5 g，KCl 1.7 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂18 g，H2O定容至1 L，pH 7.2。

GA和HV培養(yǎng)基中添加終濃度為50 mg/L的放線菌酮，重鉻酸鉀和制霉菌素；復(fù)合維生素（每升培養(yǎng)基添加VB2 0.5 mg，VB1 0.5 mg，VB6 0.5 mg，煙酸0.5 mg，肌醇0.5 mg，泛酸0.5 mg，生物素0.25 mg，對(duì)-氨基苯甲酸0.5 mg）。

（2） 純化培養(yǎng)基

ISP2培養(yǎng)基[18]：酵母粉4 g，麥芽浸提物10 g，葡萄糖4 g，H2O定容至1 L，pH 7.2。

（3） 纖維素酶活性篩選培養(yǎng)基

ISP4-CMC-Na培養(yǎng)基[19-20]：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，（NH4）SO4 1 g，trace salts solution 0.5 mL，定容至1 L，agar 15～20 g，pH 7.2。

Trace salts solution：FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，H2O定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將從不同地方帶回的阿寬蕉根際土壤，剔除香蕉根和石頭等，攤開置于陰涼處自然風(fēng)干1周，研缽碾磨成粉末。

1.2.2 分離方法與培養(yǎng)條件

每個(gè)樣品各稱量土壤粉末10 g，放置于無菌干燥的三角瓶中，加入無菌水90 mL，搖勻，蓋緊，利用50 Hz超聲波處理30 min，得到10-1土壤稀釋液。然后用無菌水將10-1土壤稀釋液稀釋得到10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液。在室溫下靜置20 min后，分別吸取每個(gè)樣品10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液100 μL，分別涂布于GA和HV培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 挑菌及保藏

經(jīng)過4～6周的培養(yǎng)，根據(jù)平板上菌落的形態(tài)特征簡(jiǎn)單去重后，選取平板上所有的代表性菌落，在ISP2培養(yǎng)基上采用劃線法純化獲得單菌落。

將已純化的菌株接種到ISP2小斜面培養(yǎng)基，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待長(zhǎng)出發(fā)達(dá)菌絲體后采用石蠟封口，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中低溫保藏。同時(shí)，挑取菌株的菌體和孢子于20%甘油管中分散，制成懸液，置于-80℃冰箱中保藏。

1.2.4 纖維素酶活性評(píng)價(jià)

參照沈雪亮和夏黎明[20]的方法，采用接種環(huán)將分離得到的菌株接種到ISP4-CMC-Na培養(yǎng)基中，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右。待菌落長(zhǎng)出來以后，在培養(yǎng)基中覆蓋濃度為1 mg/mL的剛果紅溶液，15 min后，倒去剛果紅溶液，加入濃度為1 mol/L的NaCl溶液，15 min后，再倒去溶液，觀察是否產(chǎn)生透明圈，若產(chǎn)生，則說明待測(cè)菌可以降解纖維素。測(cè)量方法是視菌落邊緣到透明圈邊緣的距離，菌落邊緣到透明圈邊緣0.1 cm以內(nèi)視為無活性，大于等于0.1 cm視為有活性。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析

在表現(xiàn)出纖維素酶活性的菌株中，通過形態(tài)去重后，選取代表性的菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列分析，使用OMEGA細(xì)菌DNA試劑盒（D3350-01）提取待測(cè)菌的DNA，為下一步PCR提供模板。

采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，其中50 ng/μL的DNA模板工作液2 μL，10 μmol/L的前后引物各2 μL，2 × Taq Master Mix （Vazyme， P111）25 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃變性1 min，56℃退火1 min；72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)前95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，直接送華大基因測(cè)序。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序成功的雙向序列用ContigExpress軟件進(jìn)行拼接，隨后在Bioedit 7.0中進(jìn)行手工校對(duì)。參考Kim等[21]的方法，將得到的16S rRNA基因序列放在Eztaxon（www.ezbiocloud.net）進(jìn)行比對(duì)，然后從網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫下載相似率高的相關(guān)菌屬的模式菌株（Type strain）的16S rRNA基因序列，隨后采用Bioedit 7.0中的Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建聚類分析圖，初步確定菌株分類歸屬，推斷菌株的系統(tǒng)發(fā)育分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南野生蕉根際土壤可培養(yǎng)放線菌分離結(jié)果

通過菌落形態(tài)簡(jiǎn)單去重后，7個(gè)樣品共分離得到210株放線菌。其中，從GA培養(yǎng)基中共挑取169株菌，HV培養(yǎng)基中挑取41株菌，GA培養(yǎng)基的分離效果比HV培養(yǎng)基的更好。通過其在ISP2培養(yǎng)基上的培養(yǎng)觀察，初步判斷，分離得到的210株放線菌中，鏈霉菌110株，非鏈霉菌100株。而對(duì)各個(gè)樣品的分離效果來看，來自陵水吊羅山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的27號(hào)樣品分離得到的菌株數(shù)最多。各個(gè)樣品在不同培養(yǎng)基中的分離結(jié)果和初步判斷結(jié)果詳見表2。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)分離得到的210株菌株進(jìn)行纖維素酶活性篩選，結(jié)果表明，55株菌表現(xiàn)出纖維素酶活性，占篩選菌株的26.2%?；?6S rDNA基因序列的分析，55株活性菌株分布于放線菌綱下5個(gè)亞目、6個(gè)科、8個(gè)屬、22個(gè)種。其中，鏈霉菌為優(yōu)勢(shì)菌，共有活性鏈霉菌21株，它們與鏈霉菌屬內(nèi)9個(gè)種有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，占全部分離菌株的10%，占全部具有酶活菌株的38.13%；第二優(yōu)勢(shì)菌為小單孢菌，與小單孢菌屬內(nèi)5個(gè)種有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，占全部分離菌株的5.71%，占全部具有酶活菌株的21.85%；第三優(yōu)勢(shì)菌為野野村氏菌，與野野村氏菌屬2個(gè)種有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，占全部分離菌株的2.86%，占全部具有酶活菌株的10.91%。此外，與能產(chǎn)生纖維素酶的菌株具有最近系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的菌屬還包括疣孢菌屬、戈登氏菌屬、擬諾氏菌屬、球孢囊菌屬和假諾卡氏菌屬，各活性菌株的分類及比例詳見表3。

通過與已知數(shù)據(jù)庫的比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，測(cè)序的菌株中存在候選新種3個(gè)。菌株X2303與Gordonia didemni的16S rRNA基因序列相似率最高，為98.52%；菌株X2502與Streptomyces phaeoluteichromatogenes的16S rRNA基因序列相似率最高，為98.79%；菌株X2733與已知菌Verrucosispora gifhornensis的16S rRNA基因序列相似率最高，為99.11%。

結(jié)合16S rRNA基因序列信息對(duì)活性菌株的樣品來源分析發(fā)現(xiàn)，從吊羅山分離的活性菌株中多樣性最為豐富，分屬于6個(gè)屬；其次為百花嶺和仲田嶺，分屬于5個(gè)屬。從所有樣品分離到的活性菌株中都鑒定了鏈霉菌。除田頭嶺外，其他樣品中都鑒定到了小單孢菌。進(jìn)一步驗(yàn)證了鏈霉菌和小單孢菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。在所有樣品中，百花嶺分離到的活性菌株數(shù)占總分離菌株數(shù)的比例最高，且包含5個(gè)菌屬，多樣性較為豐富。各樣品分離到的活性菌株數(shù)及其分類詳見表4。

基于16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果，選取22個(gè)種級(jí)類群的代表菌株（包括候選新種）及其最相近的有效發(fā)表菌種，構(gòu)建聚類樹（圖1）。

2.3 纖維素酶活性評(píng)價(jià)

在分離到的210株菌種，能產(chǎn)纖維素酶活性的菌株55株。其中，透明圈直徑大于1.0 cm的放線菌菌株共12株，占具有酶活菌株的21.82%。菌株X2407產(chǎn)生的透明圈最大，直徑達(dá)到2.3 cm，如圖2。

經(jīng)過16S rDNA基因序列分析，12株高纖維素酶活性菌株中，鏈霉菌屬Streptomyces 10株，與該屬6個(gè)種具有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，小單孢菌屬M(fèi)icromonospora 1株，野野村氏菌屬Nonomuraea 1株，其透明圈大小、分離地點(diǎn)和系統(tǒng)分類地位最近的菌株詳見表5。在這10株鏈霉菌屬菌株中，Streptomyces iranensis共4株，且產(chǎn)生的透明圈均較大，最大直徑為2.3 cm，最小直徑1.3 cm，平均直徑1.8 cm。因此推測(cè)，Streptomyces iranensis為該生境中產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢(shì)菌種，可能具有纖維素酶開發(fā)與應(yīng)用的潛力。

3 結(jié)論與討論

阿寬蕉為芭蕉科芭蕉屬作物，由于具有較長(zhǎng)的根莖，并且克隆生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，極易形成大面積的野生居群，是熱帶亞熱帶次生林中的先鋒植物。由于其保水能力強(qiáng)，生態(tài)修復(fù)能力好，已成為海南自然保護(hù)區(qū)和野生林區(qū)的重要保護(hù)物種。在野生阿寬蕉居群中，香蕉莖稈枯萎后自然降解形成肥沃的土壤。因此推測(cè)，其根際土壤菌群中可能蘊(yùn)藏豐富的待開發(fā)利用的纖維素酶資源。

本研究采用稀釋涂布法對(duì)海南島內(nèi)7個(gè)野生阿寬蕉居群的根際放線菌進(jìn)行分離，得到55株具有纖維素酶活性菌株。16S rRAN基因分析顯示分屬于5個(gè)亞目、6個(gè)科、8個(gè)屬、22個(gè)種。其中，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為鏈霉菌屬、小單孢菌屬和野野村氏菌屬，這一結(jié)果與張敬等[22]的研究結(jié)果基本一致。張敬等對(duì)云南東川干熱河谷、元謀土林以及昆明周邊高溫堆肥、熱泉等環(huán)節(jié)可培養(yǎng)高溫放線菌的多樣性及其產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明，具有高纖維素酶活的菌株中鏈霉菌所占的比例最大，其次為小單孢菌[22]。而在本研究中，具有高酶活的12株菌株中，鏈霉菌10株，占高酶活菌株的83.33%。目前的研究表明，鏈霉菌是分布最廣泛，且具有較高酶活及活性的放線菌類群。在本研究和前人的研究中也表明，其在纖維素酶的產(chǎn)生上可能有較高的應(yīng)用價(jià)值，具有開發(fā)和應(yīng)用的潛力。另外，也有研究表明，小單孢菌具有棉花纖維的降解能力[23]。

通過16S rRAN基因分析，本研究得到的具有酶活的55株菌種中，可能存在3個(gè)候選新種。其中，菌株X2733與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近已知菌Verrucosispora gifhornensis的基因序列相似率為99.11%；菌株X2502與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近已知菌Streptomyces phaeoluteichromatogenes的基因序列相似率為98.79%；菌株X2303與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近已知菌Gordonia didemni的基因序列相似率為98.52%。下一步將對(duì)以上3株菌進(jìn)行深入研究，已確定其新種的可能性及可能存在的開發(fā)潛力。

目前，對(duì)香蕉根際土壤微生物的研究還有對(duì)其健康栽培地和染病栽培地微生物群落差異的研究方面，而尚未見對(duì)香蕉野生居群微生物群落多樣性方面的研究。鄧曉等[24]對(duì)23個(gè)香蕉枯萎病發(fā)病和不發(fā)病土壤樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)病土壤中可培養(yǎng)放線菌總數(shù)為7.48×104，而不發(fā)病的為1.99×105。栽培香蕉地土壤中的可培養(yǎng)放線菌數(shù)量與土壤的質(zhì)量呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究野生香蕉土壤可培養(yǎng)放線菌的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，有利于下一步利于它們來開發(fā)微生物菌肥，進(jìn)而通過改良發(fā)病土壤的放線菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量來改善發(fā)病區(qū)域不能種植香蕉的狀況。此外，Cao等[25]從健康的香蕉根和葉分離得到224株放線菌，絕大多數(shù)是鏈霉菌，其內(nèi)生鏈霉菌是控制香蕉巴拿馬病的有效潛在生物資源。在本研究中，從野生阿寬蕉根際土壤分離得到的210株放線菌菌株，可以進(jìn)一步探索其在香蕉種植病原菌的生物防治上的應(yīng)用，從而為香蕉種植病害的生物防治提供菌種資源。

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