MCR-1介導多粘菌素耐藥機制的研究進展

王新興，鄭常委，王巧云，胡 棟，王 佳，翟 靜，常維山

（1.泰山醫(yī)學院，泰安 271016；2.山東農業(yè)大學，泰安 271018；3.青島海關駐棗莊辦事處，青島 277102；4.中國人民解放軍第960醫(yī)院泰安院區(qū)，泰安 271001）

在養(yǎng)殖業(yè)上，多粘菌素常常作為飼料添加劑來預防動物疾病和促進動物生長。mcr-1由我國學者首次在人和豬及生豬肉上發(fā)現的，也是一種讓細菌對多粘菌素產生抗藥性的基因[1]。mcr-1的發(fā)現引起了科學界對耐多粘菌素基因研究的關注，隨著研究的深入，有了更多的變異體基因，但鑒于mcr-1的獨特重要性，本文就mcr-1的發(fā)現、流行、耐藥性等方面的研究進展進行簡要綜述。

1 mcr-1的首次發(fā)現及其在全球的分布

mcr-1是一種可以讓細菌產生對多粘菌素耐藥性的基因，這種基因廣泛存在于自然界中，在一些引發(fā)流行病的細菌中也常常出現。

2015年由中國學者首次發(fā)表關于MCR-1介導的多粘菌素耐藥的研究成果[1]。隨后朱寶利研究團隊通過對已知的基因和基因組結構進行比較來對該基因的傳播機制進行了探究，發(fā)現mcr-1由獨立于細菌染色體的質粒所攜帶，并可以在腸道菌群間進行水平轉移，從而使得受體菌獲得多粘菌素耐藥性。在過去，僅僅發(fā)現耐抗生素的細菌可以通過染色體突變的形式進行增殖、富集，且這種耐藥性不具備在細菌間傳播的能力，也不具備基因水平的感染和傳播。當細菌局限于染色體突變時，其耐抗生素性細菌數量不穩(wěn)定，且不會大規(guī)模擴散至其他菌株。

除了南極洲外，在全球六大洲都有mcr-1報道，遍布世界的約40個國家：亞洲的中國、日本、老撾、越南、泰國、馬來西亞、柬埔寨、印度、韓國、巴基斯坦和阿曼蘇丹，歐洲的荷蘭、比利時、意大利、瑞士、丹麥、波蘭、瑞典、西班牙、葡萄牙、德國、法國、立陶宛、英國、匈牙利和挪威，非洲的突尼斯、埃及、阿爾及利亞、尼日利亞和南非，北美洲的加拿大和美國，南美洲阿根廷、厄瓜多爾和巴西，以及大洋洲的澳大利亞等國家先后有mcr-1報道，其中在比利時還發(fā)現了mcr-1的變異體[2]。在動物源菌株中發(fā)現mcr-1的比例高于人源菌株。養(yǎng)殖場中的濫用抗生素被認為是mcr-1廣泛出現的原因之一。

2 mcr-1的特征及側翼區(qū)序列的多樣性

該基因在不同細菌菌株之間的側向基因轉移方式包括兩種，由攜帶耐藥基因質粒所介轉移或是僅mcr-1及其上游序列單獨轉移。Liu等[1]首次在大腸桿菌所攜帶的質粒中檢測到的mcr-1，其上游有一個插入序列ISApl1，下游有一個hp假設蛋白。隨后，對多粘菌素的抗性菌株的大規(guī)模篩查并對檢測到的含mcr-1的菌株進行質粒測序，結果表明，在不同質粒中，mcr-1的側翼基因并不一致，而是各有差異，因此，mcr-1側翼區(qū)基因可能不參與mcr-1的轉移。ISApl1基因通常存在于mcr-1的上游，基因數目以單拷貝為主，在部分質粒中也存在雙拷貝基因。完整的ISApl1基因通常包括左側反向重復序列（IRL）、右側反向重復序列（IRR）和一個轉座酶基因tnpA，大部分菌株攜帶完整的ISApl1基因，但是有部分菌株只含有部分ISApl1基因片段，提示經歷了二次重組。mcr-1下游的假設單蛋白也并非普遍存在，僅存在于部分mcr-1陽性菌株中。

3 mcr-1陽性細菌并非是新病菌變種

攜帶mcr-1的細菌不是“超級細菌”，也不是“無敵細菌”，而mcr-1僅是存在于細菌質粒上的一段基因。mcr-1不是一種新病菌變種，且只單一針對多粘菌素產生耐藥性。即使mcr-1存在，我們仍然可以使用對該菌敏感的多粘菌素之外的其他抗生素來殺死該菌株。mcr-1是世界上最早發(fā)現通過質粒來完成對于多粘菌素耐藥性的基因，能夠讓腸桿菌抗多粘菌素，該基因可通過質粒進行水平轉移。近年來研究發(fā)現MCR-1可以由IncI2、IncX4和IncHI2等流行性質粒以及可移動元件，在世界各地40多個國家的多種不同來源的腸桿菌中迅猛傳播。這些研究對于深入了解mcr-1介導的黏菌素耐藥和傳播機制、全球流行分布特征奠定了基礎，豐富了耐藥性形成理論。不同來源腸桿菌科細菌中mcr-1的分布流行情況、耐藥和傳播機制、基因環(huán)境等方面的研究有長足的進展，其臨床風險性以及后續(xù)應對措施得以采用，有助于科學應對耐藥基因的流行。

4 mcr-1的耐藥機制及傳播特點

學者們在食物鏈傳播模式、環(huán)境和人群的流行現狀和攜帶mcr-1的肺炎克雷伯菌感染暴發(fā)等研究取得了諸多成果。MCR-1蛋白通過5個TMHS錨定到質膜周質。細菌LPS在細胞質中被合成，然后通過ABC轉運蛋白MSBA轉化為周質。脂多糖中的脂質A在周質中被磷酸乙醇胺共價修飾。被修飾的脂多糖和多粘菌素親和力降低，對多粘菌素產生抗性[3]。

另有科學家為進一步了解mcr-1的分布、對多粘菌素的敏感程度、以及攜帶該耐藥基因的質粒載體特點，運用分子層面的技術手段，對大量來源于人類的高致病性菌株進行分析研究，從2000多名患病者體內分離出的具有較強致病力的菌株，包括血液感染致病菌大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，共篩選出21株耐多粘菌素菌株。

研究人員發(fā)現，耐多粘菌素mcr-1通過質粒作為載體來存在于自然界微生物中，通過水平基因轉移方式在不同菌株間進行質粒的轉移和基因的交換。這種轉移模式不同于傳統(tǒng)遺傳物質由親代傳到子代的轉移，傳播速度也更快。這一傳播特點與幾年前在東南亞發(fā)現的耐抗生素基因blaNDM-1所發(fā)生情況類似，但blaNDM-1的情況更加嚴峻，攜帶有blaNDM-1基因的微生物幾乎對絕大多數抗生素不敏感，包括被認為是細菌殺手锏的碳青霉烯類。

研究表明，中國臨床血液感染患者中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌mcr-1陽性菌株數量較少，為零星分布。然而，另一研究報道了18位感染產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的病人，其中7位只用多粘菌素一種藥物進行治療后，僅有1位患者康復；另外11位患者使用多種抗生素聯(lián)合治療后，有8位患者獲得痊愈，這說明聯(lián)合使用多粘菌素效果優(yōu)于單獨使用多粘菌素，但因為該臨床實驗的樣本量不大，還需要更多實驗數據支持以上結論的合理性[4]。

最近的研究表明，由質粒攜帶的mcr-1可以在基因水平在大部分自然界微生物中移動。目前，世界各地報道的人源的腸桿菌mcr-1基因攜帶率較少，小于2%[5]，大大低于動物源的腸桿菌的mcr-1攜帶率，這可能與多粘菌素在人類細菌疾病治療使用較少有關。多個國家和地區(qū)從人源菌中均檢測到了mcr-1，并且發(fā)現mcr-1陽性菌往往與其他耐藥基因同時出現在一個菌株內，多種耐抗生素基因同時傳播可能會讓其他抗生素對mcr-1也有選擇作用，而單一的多粘菌素無法對細菌進行篩選，使得mcr-1擴散的問題更加嚴峻[6]。人源耐多粘菌素細菌的出現，可能與多粘菌素在細菌感染中大量使用以及醫(yī)院內耐抗生素菌株的傳播有關。

5 mcr-1基因的溯源

研究發(fā)現，最早攜帶mcr-1的菌株是30年前在雞體內分離的大腸桿菌，當時多粘菌素剛被用在養(yǎng)殖業(yè)中[7,8]。此后2004年～2006年偶爾出現，直到2009年出現大暴發(fā)。歐洲學者對500多株產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌（采自2004～2014年間，從歐洲牛糞細菌分離樣品）進行mcr-1檢查，卻發(fā)現mcr-1出現概率高達21%，在已經公開的包括宏基因組在內的細菌基因數據集中追溯該基因，發(fā)現1000多份來自全球各地的人類糞便樣品中，有3位中國人的腸道細菌的質粒中存在mcr-1[2]。此外，還在24位中國人的腸道細菌發(fā)現了mcr-1片段。以上這部分研究成果都是2011年8月前發(fā)表，因此，采集病例至少應該發(fā)生在2011年以前。這些研究成果充分說明耐多粘菌素基因已經在國內小規(guī)模擴散，該基因在健康人的腸道中也被發(fā)現，因此腸道將成為耐抗生素基因儲蓄池和質粒水平傳播的潛在場所。從300名五歲以下的幼兒的大便中分離出常見腸道細菌共300多株，其中有5株大腸埃希菌被檢測出抗多粘菌素，即攜帶mcr-1。這些mcr-1攜帶者年齡都在3歲以下，最小的只有2個月，戶籍所在地都不同，從出生開始沒有接觸過任何動物，其中有兩名嬰兒分別是2個月齡和10個月齡，尚未接觸常規(guī)食品和食源性微生物[9]。但其腸道細菌中卻發(fā)現了耐多粘菌素基因，由此我們推斷出該耐藥基因已經在環(huán)境中普遍出現并小規(guī)模擴散，通過細菌中的質粒已經長期寄居于人體腸道內并可以通過生育傳播給子代[10]。法國學者對517株產ESBL大腸埃希菌（采取2004年～2014年，法國牛糞樣品）進行流行病學調查，發(fā)現mcr-1檢出率高達21%[11]。

6 mcr-1的變異體及其特征

mcr-2基因在歐洲被發(fā)現僅在局部地區(qū)流行，其轉座機制以及耐藥機制尚不清楚。Wang等[12]合成了該基因及周邊序列，分析了該基因可能通過2個IS1595類似的插入序列（ISEc69）形成的環(huán)狀中間體進行傳播。在實驗中發(fā)現其與mcr-1類似，跨膜區(qū)和底物結合位點也是mcr-2介導黏菌素耐藥性所必須的區(qū)域，而且他們都與天然產黏菌素的菌株的脂質體A轉移酶非常相似，提示mcr-1和mcr-2都可能起源于產黏菌素。mcr-1的其它變異體也逐步被發(fā)現，從mcr-3、mcr-4，一直到最新發(fā)現的mcr-8，他們雖然在流行和引起的耐藥性上普遍不及mcr-1，但是從生物學特征上講，都是mcr-1的變異體。在耐藥基因檢測上，可以使用多重PCR，同時檢測多個變異體耐藥基因。

7 共攜帶現象及危害

多粘菌素被認為是治療鮑氏不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌感染的最后防線；多種細菌均能攜帶mcr-1，與其他耐藥基因共存于質粒上，產生多種藥物耐藥，使臨床患者難以找到有效的治療藥物，目前尋找特效的治療藥物仍是一個巨大挑戰(zhàn)。

8 總結

隨著抗生素濫用，細菌耐抗生素問題日益明顯。特別是多重耐藥革蘭陰性菌的感染，對人體健康構成極大威脅，正如Liu等[1]表示，我們曾經認為，在對抗細菌的戰(zhàn)斗中，多粘菌素會是最后一張王牌，但如今來看已經淪為笑柄。雖然我們的研究局限于中國大陸，但是并不說明，mcr-1沒有成為第二個blaNDM-1的可能，演變?yōu)槭澜缧钥股啬退庪y題。

綜上所述，mcr-1是位于質粒上的可水平轉移的黏菌素耐藥基因，它引起的對多粘菌素耐藥性并不強，卻可能導致無藥可醫(yī)的地步，通過對mcr-1的研究豐富了人們對耐藥性機制的認知，引起了全社會對于抗生素耐藥的重視[13]。mcr-1的變異體在世界范圍內不斷被發(fā)現、檢測和報道，也反映了人類與耐藥細菌斗爭的長期性和復雜性，利于人們對可移動性多粘菌素耐藥基因進行更好防控。細菌耐藥性是一個全人類面臨的嚴峻問題，只有全社會共同認識、通力合作、綜合防控，才能夠有效遏制耐藥性的蔓延。