嵌合抗原受體基因修飾的NK細(xì)胞治療實體瘤的研究進(jìn)展①

童晨曦 宋銀宏

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原與免疫學(xué)系 三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002)

近年來，免疫治療惡性腫瘤取得了長足的進(jìn)步，多種免疫治療方式對不同的惡性腫瘤都有良好的治療效果[1]。嵌合抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor-modified T,CAR-T)療法是一種很有前景的治療性療法，在血液腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用取得了很好的療效[2]，識別CD19靶點的CAR-T細(xì)胞可以治愈B淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤。2017年8月30日，諾華公司的CTL019獲得FDA批準(zhǔn)上市用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病[3]。CAR-T在血液腫瘤領(lǐng)域成功應(yīng)用在于其并不依賴通常會發(fā)生腫瘤耐受的常規(guī)治療途徑。但是，此療法也有不足之處：輸注后可能出現(xiàn)副反應(yīng)如細(xì)胞因子釋放綜合征(Cytokine release syndrome,CRS)，特征為高熱、低血壓、凝血障礙、神經(jīng)毒性和嚴(yán)重病例死亡；還可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，造成患者正常組織的損傷；CAR-T細(xì)胞的制備通常也需要患者自體細(xì)胞，因為同種異體T細(xì)胞會引起移植物抗宿主反應(yīng)(Graft-versus-host disease,GVHD)[4]。另外，CAR-T療法在實體瘤中的治療效果并不像治療血液腫瘤那么顯著。利用較成熟的CAR技術(shù)修飾其他效應(yīng)細(xì)胞來治療腫瘤，同樣是具有基礎(chǔ)研究和臨床意義的。NK細(xì)胞被認(rèn)為是更有潛力用CAR模式構(gòu)建來治療惡性腫瘤的[5]，特別是在治療實體瘤方面，可能比構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞的治療效果更理想。已經(jīng)有大量的實驗在研究如何構(gòu)建特異性高且有效的CAR-NK，并明確CAR-NK對各種惡性腫瘤的治療作用?，F(xiàn)將CAR-NK療法的發(fā)展及其治療實體瘤方面的一些研究進(jìn)展進(jìn)行一個綜述。

1 CAR-NK細(xì)胞免疫療法

NK細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在宿主抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。與CAR免疫療法中靶向的T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞具有許多優(yōu)點。例如，異基因NK細(xì)胞可以用作效應(yīng)細(xì)胞，不需要HLA匹配，也不會發(fā)生GVHD[6]。CAR-NK細(xì)胞可能比CAR-T細(xì)胞更安全，因為它們通常不會誘導(dǎo)CRS，也更少導(dǎo)致脫靶效應(yīng)[6]。此外，NK細(xì)胞可以從不同來源產(chǎn)生，如外周血、臍帶血(Umbilical cord blood,UCB)[7]、胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent cells,iPS)，甚至NK-92細(xì)胞系[8]。通常，嵌合抗原受體(CAR)包含三個結(jié)構(gòu)域：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是單鏈抗體片段(scFv)，其通過特異性結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated antigen,TAA)將效應(yīng)細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞的靶部分；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通常是包含CD3ζ鏈和共刺激因子如CD28和4-1BB(CD137)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。目前CAR分四代：第一代的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域僅含有CD3ζ鏈；第二代含有CD3ζ鏈和共刺激分子，如CD28、4-1BB、CD134(OX40)或者ICOS；第三代包含一個CD3ζ鏈和兩個或多個不同的共刺激分子；四代的CAR則加入了細(xì)胞因子或共刺激配體[9]，這樣能夠使改造過的效應(yīng)細(xì)胞的擴增活性和壽命有所提升。 CAR-NK繼承了CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的設(shè)計思路和基本框架，同時又有一些CAR-NK獨有的個性化設(shè)計。例如，選擇DNAX相關(guān)蛋白12(DNAX-associated protein 12,DAP12)和DAP10作為胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，DAP12可能比CD3ζ能更好地激活NK細(xì)胞信號傳導(dǎo)。已經(jīng)有研究開發(fā)了包含自然殺傷組2，成員D(Natural killer group 2,member D,NKG2D)作為胞外域，將DAP10和CD3ζ作為關(guān)鍵信號分子的獨特CAR構(gòu)建體。NKG2D是NK細(xì)胞表面受體，其配體在廣譜腫瘤中表達(dá)。這些CAR-NK細(xì)胞也表現(xiàn)出了對廣譜的腫瘤亞型很強的細(xì)胞毒性，在急性淋巴細(xì)胞白血病、骨肉瘤、前列腺癌和橫紋肌肉瘤中都有較好殺傷腫瘤效果[10]。用于NK細(xì)胞激活的最佳CAR構(gòu)建體的組合還取決于腫瘤類型或靶抗原。根據(jù)不同腫瘤中過表達(dá)的抗原來設(shè)計構(gòu)建特異性高的、獨特的CAR構(gòu)建體,對靶向特定的腫瘤細(xì)胞及增強CAR-NK的殺傷作用都會是有益處的。

2 CAR-NK治療實體瘤的研究進(jìn)展

2.1CAR-NK治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM) GBM是一種預(yù)后不良的高度惡性腦腫瘤，目前無法治愈。治療主要采用常規(guī)的手術(shù)切除，然后是放療、化療和抗血管生成。盡管采取這些治療方法干預(yù)，但GBM患者預(yù)后仍然很差。只有1/3的GBM患者存活1年[11]。之前有研究提出人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2,ErbB2/HER2)是CAR-T細(xì)胞治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點，因為在GBM中HER2蛋白水平升高，且與不良預(yù)后有關(guān)[12]。為了研究HER2特異性CAR-NK細(xì)胞用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛力，Zhang等[13]采用能在體外大量擴增的NK-92細(xì)胞系，設(shè)計出結(jié)合了HER2特異性抗體FRP5和包含CD28/CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的密碼子優(yōu)化的第二代CAR(CAR 5.28.z)。并研究了NK-92/5.28.z細(xì)胞對體外培養(yǎng)的GBM細(xì)胞和GBM小鼠腫瘤模型體內(nèi)治療的有效性和特異性，結(jié)果顯示這些CAR-NK細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤活性，且治療后能誘導(dǎo)內(nèi)源性抗腫瘤免疫。同樣是關(guān)于GBM的研究，Genβler等也重新基因修飾了人NK細(xì)胞系NK-92細(xì)胞，同樣是包含用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)合CD28/CD3ζ結(jié)構(gòu)域的CAR和用于細(xì)胞結(jié)合的scFv抗體片段，不同的是，它可以識別HER1、表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)兩種表達(dá)的抗原，Genβler等并在體外和體內(nèi)針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤活性進(jìn)行了實驗。結(jié)果顯示，用雙特異性NK細(xì)胞治療效果優(yōu)于用相應(yīng)的單特異性CAR-NK細(xì)胞治療；且治療使GBM腫瘤模型小鼠存活的顯著延長，也不會像用單特異性效應(yīng)物治療時那樣誘導(dǎo)快速免疫逃逸，即CAR-NK細(xì)胞的雙靶向降低了免疫逃逸的風(fēng)險[14]。這些結(jié)果都為CAR-NK的設(shè)計和應(yīng)用提供了一些思路。設(shè)計構(gòu)建其他抗原的雙特異性CAR-NK、CAR-NK同其他治療腫瘤的方法的組合也值得探索。眾所周知，惡性腫瘤往往不只表達(dá)單一的腫瘤相關(guān)抗原，且很難找到只在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的絕對特異性的抗原(Tumor specific antigen,TSA)，如果只設(shè)計針對單一的TAA的受體，難免會對正常組織產(chǎn)生不良反應(yīng)，這種識別多種抗原的多特異性CAR-NK的設(shè)計就使治療精準(zhǔn)度更高，且能限制脫靶副作用。

2.2CAR-NK治療卵巢癌 卵巢癌是全世界最致命的婦科惡性腫瘤，化療和手術(shù)切除是目前治療卵巢癌的主要手段。雖然化療和手術(shù)導(dǎo)致腫瘤宏觀的切除，但患者晚期還是極易發(fā)生死亡，最大的問題是晚期頻繁的復(fù)發(fā)[15]。為了預(yù)防惡性腫瘤的復(fù)發(fā)性，Klapdor等選擇了在多種實體腫瘤的腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSC)中表達(dá)的CSC標(biāo)記CD133作為靶點，利用CAR免疫療法來治療卵巢癌。構(gòu)建了第三代抗CD133-CAR結(jié)構(gòu)，利用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至臨床使用的NK-92細(xì)胞。這些工程化的NK細(xì)胞在對卵巢癌患者腹水培養(yǎng)的CD133陽性卵巢癌細(xì)胞系和原代卵巢癌細(xì)胞都有特異性殺傷作用。為了提高卵巢癌治療的效果，又將化療藥物順鉑與CAR-NK細(xì)胞聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞，再進(jìn)行效果評估。結(jié)果證明，在順鉑治療后NK細(xì)胞仍然具有細(xì)胞毒性和活性，并且能導(dǎo)致更強的殺傷作用[16]。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與癌癥干細(xì)胞的活性有關(guān)，因為癌癥干細(xì)胞是具有提高化學(xué)抗性和自我更新和轉(zhuǎn)移擴散能力的細(xì)胞亞群[17]。針對這些細(xì)胞進(jìn)行免疫治療可能是降低惡性腫瘤復(fù)發(fā)性風(fēng)險的有效策略。在構(gòu)建雙特異性CAR-NK思路的基礎(chǔ)上，也可以去嘗試在雙特異性CAR中組合兩種CSC標(biāo)記作為雙激活信號(例如CD133和CD44)來共同定位腫瘤。另外，我們可以推測，一種CSC標(biāo)記物和一種腫瘤相關(guān)抗原的組合也可能是一種有效果的組合方式。

2.3CAR-NK治療乳腺癌 乳腺癌是威脅女性健康的一種常見的惡性腫瘤，隨著早期檢測手段和乳腺癌治療技術(shù)的改進(jìn)發(fā)展已經(jīng)使患者生存率有所提升，但是乳腺癌仍然是女性癌癥相關(guān)死亡的常見原因[18，19]。想要徹底攻克乳腺癌還需要研究更有針對性的治療方法。在此前針對乳腺癌的治療研究中，特異性靶向HER3/HER4、TEM8/ANTXR1等相關(guān)抗原的CAR-T細(xì)胞就展現(xiàn)出了對不同類型乳腺癌的持續(xù)抑制效果。但是，這些研究對乳腺癌轉(zhuǎn)移的療效并不明確，而快速轉(zhuǎn)移往往是影響患者預(yù)后生存率的重要因素[20,21]。成功治愈實體瘤有很多的挑戰(zhàn)，特別是對于轉(zhuǎn)移性的實體瘤。Chen等用CAR修飾的NK細(xì)胞和溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)的組合對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移進(jìn)行治療。首先是用第二代HER1-CAR修飾的NK-92細(xì)胞系在體外和乳腺癌顱內(nèi)小鼠模型中測試其治療效果，因為腦轉(zhuǎn)移在乳腺癌中十分常見，可能與預(yù)后不良有關(guān)。NK-92細(xì)胞的早期輸注可以快速控制腫瘤生長并減少大腦中的腫瘤大小，讓神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和顱內(nèi)高壓快速緩解。之后使用oHSV能夠殺死殘余的癌細(xì)胞并持續(xù)誘導(dǎo)對癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答[22]。在治療實體瘤時，CAR-NK在體內(nèi)壽命比較短，較少引起CRS或者脫靶效應(yīng)[23]。但從另一方面來思考，它們在體內(nèi)很短的持續(xù)時間可能限制其對腫瘤細(xì)胞殺傷功效，這也有可能是腫瘤以后會發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的隱患?？梢試L試在構(gòu)建特異抗原的CAR-NK前對NK細(xì)胞進(jìn)行改造，使其具有免疫記憶功能，以使其具有更持續(xù)的殺傷活性。

3 不足及展望

雖然CAR-NK療法有著較高的安全性、實體瘤中更好的治療潛力等優(yōu)勢。但目前CAR-NK在治療實體腫瘤方面取得的一些進(jìn)展多限于基礎(chǔ)研究，臨床研究比較局限，不像CAR-T療法開展那么廣泛。最終能否成功治療臨床腫瘤，需要更多的臨床研究去證實。另外，CAR-NK的不良反應(yīng)雖然相對CAR-T來說要少，但并不意味著不會出現(xiàn)不良反應(yīng)，隨著CAR-NK臨床研究的增多，會有更多具體應(yīng)用問題隨之出現(xiàn)。NK細(xì)胞包括如外周血NK細(xì)胞、臍帶血NK細(xì)胞、NK-92細(xì)胞系等不同的NK細(xì)胞型，功能特征也不盡相同。因此如何選擇合適的NK細(xì)胞亞群來擴增并構(gòu)建特定有效的CAR-NK細(xì)胞也有待探索，因為構(gòu)建的CAR-NK最后的治療效果可能也不同。

CAR-NK技術(shù)的飛速發(fā)展給我們徹底治愈惡性腫瘤帶來了希望。雖然在后期臨床研究中可能會出現(xiàn)各種各樣的挑戰(zhàn)，但我們相信解決好這些問題，CAR技術(shù)將是人類對抗腫瘤的有力武器。