糖尿病足神經(jīng)病變動物模型研究進(jìn)展

李丹，陳龍菊

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，湖北 恩施 445000)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

糖尿病基礎(chǔ)上并發(fā)神經(jīng)病變導(dǎo)致的糖尿病足是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)中的一種，受損的神經(jīng)包括運(yùn)動神經(jīng)、感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)。在排除其他因素的情況下，糖尿病晚期患者常出現(xiàn)痛覺或溫度覺異常、神經(jīng)傳導(dǎo)功能下降等神經(jīng)功能障礙方面的癥狀和體征。DPN的臨床表現(xiàn)隨累及部位不同而表現(xiàn)各異[1]，累及運(yùn)動神經(jīng)時則可造成足部畸形；累及感覺神經(jīng)則可造成如麻木、灼痛或放射性疼痛等感覺異常；累及自主神則表現(xiàn)為肢端皮膚少汗或無汗、皮膚皸裂。上述神經(jīng)受損可導(dǎo)致患者足部對外界感覺遲鈍，進(jìn)而失去自我保護(hù)，更嚴(yán)重的是產(chǎn)生感染[1]、神經(jīng)性潰瘍[2]等病變。糖尿病足神經(jīng)病變帶給患者的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過糖尿病本身，盡管糖尿病足神經(jīng)病變的臨床研究已經(jīng)積累了大量的治療經(jīng)驗(yàn)，但治療機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。基于動物模型的基礎(chǔ)研究能夠更好的了解疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律。因此，在研究疾病的診斷、預(yù)防和治療過程中，合理構(gòu)建動物模型關(guān)乎實(shí)驗(yàn)研究的成敗。本文將從DPN的發(fā)病機(jī)制、動物模型的構(gòu)建方法以及造模成功標(biāo)準(zhǔn)三方面進(jìn)行綜述，旨在為DPN的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 DPN的發(fā)病機(jī)制

1.1 高血糖

DPN的發(fā)生和發(fā)展很大程度上歸因于高血糖[3]，高血糖能引起脂質(zhì)和糖基化修飾蛋白質(zhì)直接損傷神經(jīng)細(xì)胞，而且，蛋白質(zhì)的氨基與糖的醛基發(fā)生非酶促化反應(yīng)的終產(chǎn)物即為糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的受體可激活炎性信號通路，使損傷進(jìn)一步加重[4-5]。生理條件下，神經(jīng)組織中蛋白質(zhì)的非酶促反應(yīng)處于正常水平，AGEs生成的速度極為緩慢，當(dāng)機(jī)體罹患糖尿病時，可導(dǎo)致血糖持續(xù)處于高水平狀態(tài)，大量的AGEs迅速產(chǎn)生。AGEs與糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGEs)結(jié)合所導(dǎo)致的副作用，不僅是髓鞘的完整性遭到破壞，神經(jīng)組織的微管蛋白以及微管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能也會受到影響，進(jìn)而使得周圍神經(jīng)不能較好地得到細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)蛋白的營養(yǎng)作用而受到損害。此外，AGEs與RAGEs相互作用直接或間接地導(dǎo)致糖尿病慢性微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷，使神經(jīng)組織處于缺氧、缺血狀態(tài)，繼而引起一系列不良反應(yīng)。高血糖狀態(tài)破壞了神經(jīng)細(xì)胞正常生長所需的微環(huán)境，如果這種狀態(tài)不加以調(diào)整，神經(jīng)功能的恢復(fù)只能是空談。因此，在治療糖尿病足時，降糖處理尤為重要。

1.2 氧化應(yīng)激

多元醇信號通路如被激活，則可引起高滲性損傷和氧化應(yīng)激[6]。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)絕大多數(shù)葡萄糖通過有氧氧化和糖酵解途徑被機(jī)體代謝。長期高血糖會激活葡萄糖的多元醇途徑[7](葡萄糖的旁路代謝)。醛糖還原酶(aldose reductase，AR)和山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)是多元醇通路的兩個關(guān)鍵酶。葡萄糖經(jīng)AR催化為山梨醇，后者再經(jīng)SDH催化生成果糖，然而果糖激酶不存在于神經(jīng)組織內(nèi)，因而果糖不能被進(jìn)一步分解，進(jìn)而致山梨醇和果糖大量堆積，使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性甚至壞死，最后出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘改變，神經(jīng)傳導(dǎo)速率減慢。另一方面，還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)是葡萄糖經(jīng)AR催化生成山梨醇過程中的輔酶，NADPH的耗損導(dǎo)致谷胱苷肽含量下降或者NO合成減少，其結(jié)果是產(chǎn)生大量自由基和血管收縮而引起血流量降低。其中氧自由基(oxygen free radical, OFR)通過過氧化損傷破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，破壞線粒體，斷絕細(xì)胞的能源，毀壞溶酶體，使細(xì)胞自溶。而且，糖尿病所致的高血糖狀態(tài)下，使機(jī)體清除自由基的能力降低，OFR大量增加，可激活caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，加速神經(jīng)元的凋亡。因而氧化應(yīng)激在DPN的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[8]。與單純的高血糖狀態(tài)相比，不論是多元醇通路的激活還是多元醇途徑引起的氧化應(yīng)激都會直接導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。

1.3 線粒體功能障礙

線粒體功能障礙[9-11]產(chǎn)生氧自由基增多、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]等。線粒體是真核生物直接利用氧氣，也是糖類最終氧化釋放能量的場所，近90%吸入體內(nèi)的氧氣被線粒體消耗掉。若線粒體功能障礙，其消耗氧的能力減退，產(chǎn)生氧自由基增多或大量電子會過早地還原氧氣，形成超氧化物等活性氧(superoxide and other reactive oxygen species, ROS)，這種高活性分子能引起氧化應(yīng)激[13]進(jìn)一步損害線粒體的功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害了細(xì)胞的代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達(dá)。線粒體功能障礙[14]的特點(diǎn)是降低ATP合酶活性，減少電子傳遞鏈活動，并增加無效原氮循環(huán)。能量障礙的特點(diǎn)是減少糖酵解的儲備，減少糖酵解能力，并增加非糖酵解酸化?？偠灾?，線粒體功能障礙會進(jìn)一步加重糖代謝的異常以及氧化應(yīng)激反應(yīng)帶給機(jī)體的損傷。

1.4 代謝異常

血脂異常[10]生成的氧化型膽固醇以及氧化和糖基化脂類介質(zhì)可引起氧化應(yīng)激，并能激活炎癥信號通路。另外，代謝性炎癥[15]、神經(jīng)炎癥[16]、神經(jīng)滋養(yǎng)血管病變[17-18]、胰島素抵抗[19]、神經(jīng)營養(yǎng)因子[20]均參與DPN的發(fā)生發(fā)展的過程中。

2 模型制作

2.1 缺血再灌注

Muthuraman 等[21]認(rèn)為中度缺血再灌注損傷模型可模擬糖尿病嚴(yán)重疼痛障礙的相關(guān)癥狀。造模方法如下：SD大鼠麻醉后腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)。行右側(cè)腹股溝切口暴露股血管，在手術(shù)顯微鏡下游離出股神經(jīng)，找到附近的坐骨神經(jīng)，使用6-0的絲線運(yùn)用活結(jié)技術(shù)結(jié)扎股動脈，4 h后解去結(jié)扎，造成坐骨神經(jīng)的缺血再灌注模型。感覺行為測試顯示，爪和尾部的溫度覺和痛覺過敏分別表現(xiàn)出外周和中樞神經(jīng)并發(fā)神經(jīng)病變所致糖尿病足的臨床癥狀。該模型只是對坐骨神經(jīng)造成暫時缺血的狀態(tài)，神經(jīng)的連續(xù)性依然完整，這有利于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究。

2.2 神經(jīng)切除法

Shu等[22]認(rèn)為失神經(jīng)支配的皮膚可能會導(dǎo)致糖尿病足潰瘍，于是采用神經(jīng)切除的方法造成皮膚失去神經(jīng)支配。研究者選擇裸小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，切斷T9-L1段神經(jīng)根。待動物蘇醒后，用針頭刺激傷口部位。若小鼠無任何響應(yīng)，指示神經(jīng)切除成功。該方法使用的裸鼠為1～3日齡的小鼠或6～8周齡BALB/c小鼠，手術(shù)造模技術(shù)要求較高。該模型適用于糖尿病動物的神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)再生方面的研究。

2.3 神經(jīng)結(jié)扎法

Kale 等[23]采取結(jié)扎神經(jīng)的方法建立糖尿病神經(jīng)病變模型，選擇 SD 大鼠，在鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)糖尿病基礎(chǔ)上，手術(shù)分離坐骨神經(jīng)后結(jié)扎，使后肢發(fā)生潰瘍壞疽。該模型可評價多層次減壓對于DPN的治療效果。該方法使大鼠長時間保持在高血糖狀態(tài)，是較為理想的研究糖尿病足神經(jīng)病變的模型。

2.4 神經(jīng)擠壓法

Thipkaew等[24]由STZ誘發(fā)雄性Wistar大鼠糖尿病，之后手術(shù)分離坐骨神經(jīng)，用止血鉗對其造成擠壓傷，從而誘導(dǎo)神經(jīng)損傷。該模型對大鼠傷害較小且成模時間短，考慮到經(jīng)濟(jì)效益可選用此模型。

2.5 燙傷法

Xia等[25]由STZ誘發(fā)雄性SD大鼠糖尿病建立糖尿病足潰瘍模型，之后在背后足的左側(cè)做了一個4 cm × 4 cm燒傷，從而達(dá)到損傷神經(jīng)的目的。該模型采用燙傷的辦法，不僅能導(dǎo)致神經(jīng)病變，還可能導(dǎo)致血管病變或產(chǎn)生感染，因而不好控制。

2.6 單純STZ誘導(dǎo)法

Jolivalt 等[26]采用注射STZ誘導(dǎo)糖尿病的方法，選擇C57BL / 6小鼠。5個月后，小鼠表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，熱痛覺、觸覺異常的神經(jīng)病變癥狀。該模型制作方法簡單易于操作，雖耗時長但在研究糖尿病周圍神經(jīng)病變的長效治療方面有潛在價值。也有學(xué)者[27]選用產(chǎn)后3 d的ICR小鼠，通過STZ誘導(dǎo)糖尿病，4周齡時表現(xiàn)出STZ誘發(fā)糖尿病的神經(jīng)病。該模型適合DPN的早期癥狀以及藥物治療方面的研究。

2.7 轉(zhuǎn)基因動物模型

研究表明[28]，瘦素缺乏的ob/ob小鼠可作為2型糖尿病小鼠模型，O’Brien等[29]發(fā)現(xiàn)5周BTBR ob/ob小鼠的炎癥和免疫反應(yīng)過強(qiáng)，可能有助于引起神經(jīng)病變的產(chǎn)生。BTBR ob/ob小鼠對于探討疾病發(fā)病機(jī)制來說是個良好模型。瘦素為基礎(chǔ)的模型有助于模擬糖尿病足神經(jīng)病變，但其擾亂了瘦素信號系統(tǒng)所導(dǎo)致的后果應(yīng)予以考慮，同時瘦素為基礎(chǔ)的模型小鼠往往是不育的，因此實(shí)驗(yàn)研究費(fèi)用相對過高。

3 DPN造模成功標(biāo)準(zhǔn)

齊一俠[30]和萬江波[31]認(rèn)為，腹腔注射STZ，一周后外周空腹血糖≥16.7 mmol/L或16.8 mmol/L，即可認(rèn)定為該糖尿病模型成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。Thipkaew等[24]和Sundaram 等[32]認(rèn)為大鼠空腹血糖水平為250 mg/dL時為糖尿病大鼠。Sapunar等[33]測試?yán)涿粜?、熱敏性及機(jī)械性痛覺的實(shí)驗(yàn)研究顯示動物的冷痛、熱痛和觸覺均減退。Muthuraman等[21]研究顯示DPN大鼠的坐骨神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity, MNCV)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(sensory nerve conduction velocity, SNCV)和坐骨神經(jīng)血流量(sciatic blood flow，SBF)均降低。以上診斷標(biāo)準(zhǔn)從運(yùn)動神經(jīng)、感覺神經(jīng)及自主神經(jīng)的功能方面對實(shí)驗(yàn)動物造模成功進(jìn)行評價，與臨床診斷類似，是比較理想的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)語

DPN的發(fā)生主要由高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、多元醇途徑、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙以及血脂異常等多種因素導(dǎo)致而成。然而筆者整理DPN動物模型研究進(jìn)展時發(fā)現(xiàn)，很少有學(xué)者直接對這些因素進(jìn)行干預(yù)，而是直接瞄準(zhǔn)神經(jīng)，使實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)損傷，模擬神經(jīng)病變。近年來糖尿病的研究成為熱點(diǎn)，研究新的動物模型，制定有效的治療策略仍然是一個關(guān)鍵問題。盡管臨床對糖尿病足神經(jīng)病變的對癥治療上有一定療效，但藥物作用機(jī)制尚不清楚。能良好模擬臨床病癥的動物模型，將為糖尿病足神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制、藥物作用機(jī)制及臨床新藥驗(yàn)證等方面提供參考。

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