李重陽，孟慶玲，喬 軍*，伍曄暉，王立霞，郭 晶，馬 帥，才學鵬

(1.石河子大學 動物科技學院， 新疆 石河子 832003； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州)

立克次體目為革蘭氏染色陰性、細胞內專性寄生菌，屬于a-變形菌綱(a-Proteobacteria)。立克次體目中的立克次體屬、埃立克體屬和無形體屬的媒介主要是硬蜱，宿主為多種脊椎動物，硬蜱叮咬是人或宿主動物感染立克次體的主要途徑[1-4]。在臨床上，人感染立克次體表現(xiàn)為局部淋巴結病變，可有疼痛，隨后出現(xiàn)發(fā)熱和皮疹[1-2]。自1899年首次報道人落基山斑點熱以來，世界各地相繼發(fā)現(xiàn)20多種致病性立克次體[5]。在20世紀80年代末期，美國相繼發(fā)現(xiàn)人單核細胞埃立克體病和人粒細胞埃立克體病，并從病人的血液樣本中分離到HME病原體查菲埃立克體(E.chaffeensis)和HGE的病原體嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophUum)[6]，引起了世界各國對無形體科及其引起的疾病的重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的埃立克體有5種，無形體有6種，有多個新發(fā)現(xiàn)的埃立克體和無形體尚未分類[7]。

犬感染埃立克體會出現(xiàn)發(fā)熱、嗜睡、厭食、黏膜蒼白、脾臟腫大、出血，并成為持續(xù)攜帶者[8]。經(jīng)蜱傳染的犬埃立克體和犬無形體是導致犬單核細胞埃立克體病(CME)和犬循環(huán)血小板減少癥(CCT)的病原體，也可引起人感染。自阿爾及利亞首次檢測到犬埃立克體以來，隨后在美國[9]、歐洲[10]、亞洲[11]和非洲[12]的一些國家相繼廣泛被檢測到。犬作為人類重要的伴侶動物，分析鑒定犬立克次體的流行特點對于預防我國人立克次體感染有重要公共衛(wèi)生學意義。因此，本研究利用PCR檢測立克次體16S rRNA基因，分析新疆石河子地區(qū)犬立克次體的感染和流行狀況。在此基礎上，通過遺傳進化分析揭示立克次體，犬埃立克體及無形體石河子流行株與國內外流行株的親緣關系，為該病的防控提供分子流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DNA Marker、pMD19-T(simple)載體均購自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購買于天根(北京)生化科技有限公司；質粒小量提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣本的采集

在石河子地區(qū)采集犬體表寄生蜱655只，并在石河子市寵物醫(yī)院采集犬全血58份。樣本蜱于-20 ℃或70%酒精保存，檢測前進行形態(tài)學鑒定，新鮮血液于4 ℃保存。

1.3 樣本DNA提取及PCR檢測

根據(jù)試劑盒說明，對采集的血液和蜱組織進行DNA的提取，用乙醇沉淀DNA，用DD水洗脫，-20 ℃保存待檢測。然后利用特異性引物擴增立克次體16S rRNA基因，上游引物:5'-GGTACCYACAGAAGAAGTCC-3'和下游引物：5'-TAGCACTCATCGTTTACAGC- 3'；擴增埃立克體16S rRNA基因，上游引物：5'-TTTATCGCTATTAGATGAGCCTATG-3'和下游引物：5'-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3'。PCR反應體系為50 μL，包括：5 μL DNA模板，各1 μL上下游引物，5 μL10×PCR buffer，1 μL Tap酶，4 μL dNTP mixture，滅菌去離子水加至50 μL。立克次體目的基因PCR反應條件：95 ℃，預變性5 min；94 ℃，變性40 s；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。犬埃立克體目的基因PCR反應條件：95 ℃，預變性2 min；94 ℃，變性1 min；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；擴增40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.4 DNA序列的克隆及測序

利用PCR純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化，將純化產(chǎn)物連接到pMD19-T(simple)載體，連接體系(10 μL)：Solution I 5 μL，回收的目的片段4.5 μL，pMD19-T(simple)載體0.5 μL。連接產(chǎn)物混勻瞬時離心后于4 ℃連接過夜。將5 μL連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞E.coliDH5α中，然后涂在有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，在平板上挑取菌落進行PCR鑒定，篩選陽性克隆送上海生工生物技術公司進行測序。

1.5 16S rRNA基因遺傳進化分析

利用BLAST N在線軟件，將測序結果與GenBank 中注冊基因序列進行同源性比對。使用DNAstar8.0軟件進行同源性分析，使用MEGA5.0 軟件通過NJ(Neighbor-Joining)法構建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap值為1000)。

2 結果與分析

2.1 蜱形態(tài)學鑒定結果

釆集犬體表寄生蜱655只，參照《新疆蜱類志》[13]及《中國經(jīng)濟昆蟲志》[14]，通過體式倒置顯微鏡進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，為血紅扇頭蜱和俄扇頭蜱兩種，其中血紅扇頭蜱612只，俄扇頭蜱43只(圖1)。

2.2 PCR檢測結果

經(jīng)PCR從采集的蜱中擴增到52份立克次體陽性，其中俄扇頭蜱7份陽性，血紅扇頭蜱45份陽性，犬血液中沒有檢測到立克次體陽性，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證，出現(xiàn)345 bp大小的條帶(圖2)，結果與預期目標條帶分子量大小相符。使用犬埃立克體特異性引物，擴增到87份犬埃立克體陽性，其中俄扇頭蜱15份陽性，血紅扇頭蜱72份陽性，血液中檢測到7份陽性，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證，出現(xiàn)452 bp大小的條帶(圖3)，結果與預期目標條帶分子量大小相符。同時利用此引物從蜱中檢測出無形體陽性樣本28份，血液中檢出無形體陽性3份，擴增目的片段為452 bp(圖3)。

2.3 16S rRNA基因遺傳進化分析

將陽性樣本送至上海生工測序，Shz-1與烏拉圭的Rickettsialesbacterium( EF687768.1)序列同源性達到99%且在同一分支，與其它Rickettsiales同源性在86.96%以上，在進化樹分支上相距較近，提示Shz-1可能是一種立克次體新基因亞型(圖4A)。Shz-2序列與Ehrlichiasp. HF(CP007474.1)、Ehrlichiasp.Yunnan(GU227701.1)、Ehrlichiaewingii( NR_044747.1)、Ehrlichiachaffeensis(CP007480.1)同源性達到99%；與E.platysGzh981和E.canisGzh982株同源性分別為92.27%、98.89%；在進化樹中與Ehrlichiasp. Yonaguni206(HQ697589.1)處于同一分支，和Ehrlichiasp. HF(DQ647318.1)、Ehrlichiamuris(AB013009.1)處于較近的分支；與巴西、馬來西亞半島、土耳其、馬來西亞、臺灣、日本、美國、意大利南部的Ehrlichiacanis(EF195135.1、 KR920044.1、KJ513197.1、JF429693.1、GU810149.1、AF536827.1、NR_118741.1、EU439944.1)同源性達到98.67%以上，且處于較近分支，提示Shz-2可能是一種犬埃立克體新基因亞型(圖4B)。Shz-3序列與Anaplasmasp.cloneXinjiang051-9(JX402604.1)、Anaplasmaphagocytophilum(CP006618.1、AY527213.1、GQ412337.1)同源性為99%～100%；與Anaplasma(KJ410247.1、KJ410248.1、KJ410249.1)處于同一分支，和其它A.phagocytophilum在進化樹中處于較近分支(圖4C)。Shz-1、Shz-2、Shz-3石河子流行株用箭頭標識。

圖3 犬埃立克體和無形體16S rRNA PCR擴增結果M. DNA分子標準質量；3-6.犬埃立克體陽性樣本；7.無形體陽性樣本；1-2.陰性樣本 Fig.3 Amplification of 16S rRNA genes of Ehrlichia caniand Anaplasma by PCRM. DNA Marker DL2000;3-6. Ehrlichia cani Positive samples;7. Anaplasma Positive samples;1-2. Negative samples

3 討 論

從20世紀80年代以來，在新疆陸續(xù)檢測或分離出多種蜱媒疾病病原體，包括萊姆病原體、康氏立克次體(R.conorii)、Candidatusrickettsiabarbariae、R.slovaca、R.raoulti和A.phagocytophilum等。病原學調查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)蜱攜帶立克次體有明顯差異[15]。在北疆地區(qū)，在精河的草原革婢中分離出SFGR；在瑪納斯、精河縣等地的蜱中分離出萊姆病螺旋體、SFGR并檢測出A.phagocytophilum[16]；在伊梨歷史上被證實為蜱傳斑點熱自然疫源地，范德生等[17]首次證實了伊犁當?shù)厝巳貉逡约爱數(shù)丶倚篑R牛羊中都存在無形體抗體陽性；在南疆地區(qū)，在尉犁荒漠地區(qū)的短小扇頭蜱中檢出SFGR和與中央無形體(A.centrale)同源性最高的無形體[18]，在和碩地區(qū)的俄扇頭蜱中檢測出A.phagocytophilum和SFGR等[3]。在新疆博樂和塔城地區(qū)也同樣檢測到立克次體，無形體和埃立克體。

埃立克體病主要分布在美國東南部以及中南部地區(qū)[15，19]，世界上其他部分地區(qū)如墨西哥、以色列、意大利、葡萄牙、泰國、韓國、日本等證實有該病的血清陽性人群[17]。1998年，廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所獸醫(yī)研究室在廣州市郊某養(yǎng)犬基地發(fā)現(xiàn)了犬埃立克體病的流行，證實引起發(fā)病的病原為兩種埃立克體E.canis和E.platys，經(jīng)測序病原的16S rRNA并在Genbank比對后，兩株埃立克體分別命名為Gzh981(E.platys)和Gzh982(E.canis)。我國在1999年報告了首例埃立克體病例。2001年在大興安嶺地區(qū)人群血中檢測到查菲埃立克體和人粒細胞埃立克體的16S rRNA基因片段。2006年1月，在安徽宣城縣首次出現(xiàn)10例確診的無形體病例，其中一例死亡，并且證實了該病原體可以在人與人之間傳播。

圖4 立克次體、埃立克體、無形體石河子流行株16S rRNA基因遺傳進化分析A：立克次體；B：埃立克體；C：無形體Fig.4 Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes of Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma A. Rickettsia; B. Ehrlichia; C. Anaplasma

石河子地處新疆北部，位于古爾班通古特沙漠邊緣，生態(tài)環(huán)境多樣，是蜱等媒介傳染病的多發(fā)地，蜱傳立克次體和犬埃立克體的傳播風險較大。由于埃立克體和無形體可引起人感染，因此應加強對該病的病原學和分子流行病學調查。本研究在655只犬體表蜱樣本和58份犬血液樣本中，蜱中檢出52份立克次體陽性樣本，占7.9%，87份埃立克體陽性樣本，占13.3%，28份無形體陽性樣本，占4.3%；血液中7份埃立克體陽性樣本，占12.1%，3份無形體陽性樣本，占5.1%。在本研究中，獲得的16S rRNA基因序列分別與GenBank中部分立克次體、埃立克體、無形體的序列同源性達到99%以上；遺傳進化分析顯示，新疆石河子地區(qū)犬源立克次體、埃立克體及無形體流行株與國內外流行株具有較近的親緣關系，但也存在一定的變異。近年來，隨著寵物犬數(shù)量的上升，犬作為人類重要的伴侶動物，犬攜帶的立克次體和人類密切，因此開展犬源立克次體病的流行病學調查對于防控人立克次體的感染具有重要的意義。

[1] PADDOCK C D, CHILDS J E. Ehrlichia chaffeensis: a prototypical emerging pathogen[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2003, 16(1): 37-64.

[2] WALKER D H, ISMAIL N. Emerging and re-emerging rickettsioses: endothelial cell infection and early disease events[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(5): 375-386.

[3] 孫響，張桂林，劉曉明，等．新疆和碩地區(qū)主要蜱類及蜱媒病原體調查[J]．中國媒介生物學及控制雜志，2013，24(1)：5-7, 10．

[4] CABEZAS-CRUZ A, VALDéS J J, DE LA FUENTE J. The glycoprotein TRP36 of Ehrlichia sp. UFMG-EV and related cattle pathogen Ehrlichia sp. UFMT-BV evolved from a highly variable clade of E. canis under adaptive diversifying selection[J]. Parasites & Vectors, 2014, 7(1): 584.

[5] PAROLA P, PADDOCK C D, RAOULT D. Tick-borne rickettsioses around the world: emerging diseases challenging old concepts[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2005, 18(4): 719-756.

[6] DAWSON J E, ANDERSON B E, FISHBEIN D B, et al. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with human ehrlichiosis[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29(12): 2 741-2 745.

[7] ISMAIL N, BLOCH K C, MCBRIDE J W. Human ehrlichiosis and anaplasmosis[J]. Clinics in Laboratory Medicine, 2010, 30(1): 261-292.

[9] AGUIAR D M, ZHANG X, MELO A L, et al. Genetic diversity of Ehrlichia canis in Brazil[J]. Veterinary Microbiology, 2013, 164(3/4): 315-321.

[10] CARDOSO L, MENDO C. Madeira de carvalho L.prevalence of dirofilariaimmitis,ehrlichia canis,borrelia burgdorferi sensu lato,anaplasma spp.and leishmania infantum in apparently healthy and CVBD-suspect dogs in portugala National serological study[J]. Parasites & Vectors, 2012, 5(1): 62.doi:10.1186/1256-3305-5-62.

[11] PINYOOWONG D, JITTAPALAPONG S, SUKSAWAT F, et al. Molecular characterization of Thai Ehrlichia canis and Anaplasma platys strains detected in dogs[J]. Infection, Genetics and Evolution : Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 2008, 8(4): 433-438.

[12] DAHMANI M, LOUDAHI A, MEDIANNIKOV O, et al. Molecular detection of Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs from Kabylie, Algeria[J]. Ticks and Tick-borne Diseases, 2015, 6(2): 198-203.

[13] 于心，葉瑞玉，龔正達．新疆蜱類志[M]．新疆烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1997：54-122．

[14] 鄧國藩，姜在階．中國經(jīng)濟昆蟲志·第39冊·蜱螨亞綱·硬蜱科[M]．北京：科學出版社，1991：62-326．

[15] CHEN S-m, DUMLER J S, BAKKEN J S, et al. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1994, 32(3): 589-595.

[16] 謝杏初，劉惠君，葉爾肯，等．新疆萊姆病的地理分布及流行情況調查[J]．地方病通報，1996，11(3)：48-51．

[17] 范德生，禹惠蘭，吳保新，等．新疆伊犁地區(qū)無形體流行病學調查及病原16S rRNA序列分析[J]．中國人獸共患病學報，2011，27(4)：327-330．

[18] 劉曉明，張桂林，趙焱，等．新疆尉犁荒漠地區(qū)蜱中主要蜱傳疾病病原檢測[J]．中國媒介生物學及控制雜志，2012，23(6)：496-498．

[19] BAKKEN J S, DUMLER J S, CHEN S-m, et al. Human granulocytic ehrlichiosis in the upper Midwest United States. A new species emerging[J]. JAMA : the Journal of the American Medical Association, 1994, 272(3): 212-218.