無(wú)NH4NO3培養(yǎng)基SK設(shè)計(jì)及其組培效果

梁秋玲 張能 全國(guó)龍 黃慶鋒

摘 要 無(wú)NH4NO3條件下，參考MS及ER大量元素離子濃度，設(shè)計(jì)SK大量元素組分，SK鐵鹽、微量元素及有機(jī)物同MS，得到SK基本培養(yǎng)基。以‘廣林9號(hào)巨尾桉、黑金剛橡膠榕、美酒白掌為試材，評(píng)價(jià)其組培效果。結(jié)果表明：SK適用于‘廣林9號(hào)巨尾桉增殖及所有參試物種生根培養(yǎng)；SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g適用于黑金剛橡膠榕和美酒白掌增殖培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞 NH4NO3 ；組織培養(yǎng) ；SK ；MS

中圖分類號(hào) Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.004

Abstract Consulting the ion concentration of macro elements in the MS and ER， the macro element constituents of the cultural medium SK without NH4NO3 were designed. The basal SK medium prepared was similar to the MS in molysite， microelements and organic matters. The prepared SK was used to culture the explants of Eucalyptus hybrid Guanglin 9 （Eucalyptus grandis×E. urophylla）， Ficus elastic ‘Decora Burgundyand Spathiphyllum mojo to evaluate its effect on tissue culture. The results showed that the SK was suitable for the rooting of Eucalyptus hybrid Guanglin 9 and other materials. The SK+Cuiyun （18-18-18） water-soluble fertilizer was suitable for the proliferation of F. elastic‘Decora Burgundyand S. mojo.

Keywords NH4NO3 ； tissue culture ； SK ； MS

MS培養(yǎng)基由Murashige 和 Skoog于1962年發(fā)布，其普遍適用性及穩(wěn)定性使其廣泛用于多種植物的各類組織培養(yǎng)。香蕉[1]、蘭花[2-4]及桉樹[5]等實(shí)現(xiàn)工業(yè)化組培育苗的品種，其培養(yǎng)基均由MS衍生改良而來(lái)。硝酸銨NH4NO3為MS主要構(gòu)成成分，占大量元素質(zhì)量百分比36.4%，是MS銨態(tài)氮NH4+的來(lái)源，同時(shí)維持了NH4+與NO3-摩爾濃度近似1∶2的合適比例。NH4NO3是《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》及《民用爆炸物品安全管理?xiàng)l例》管制藥劑，禁止純品NH4NO3市場(chǎng)流通，NH4NO3的禁用對(duì)組培產(chǎn)業(yè)可謂釜底抽薪，尋求NH4NO3有效替代品維持正常生產(chǎn)成為產(chǎn)業(yè)生存與發(fā)展的重要課題。

王媛花[6]將MS培養(yǎng)基NH4NO3替換為3.4 g/L （NH4）2SO4，對(duì)蘋果、草莓和葡萄組培苗進(jìn)行試驗(yàn)，報(bào)道結(jié)論為繼代的植物葉片平展，葉色嫩綠，植物幼嫩組織含水量高，植株生長(zhǎng)旺盛。大量元素的簡(jiǎn)單替換導(dǎo)致離子濃度大幅波動(dòng)，其NH4+及SO42-水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)MS、ER、B5、WPM等常用培養(yǎng)基，NH4+與NO3-比例亦是獨(dú)樹一幟達(dá)到2.74∶1，而據(jù)普遍適用的規(guī)律，培養(yǎng)基內(nèi)過(guò)高NH4+水平，持續(xù)培養(yǎng)會(huì)抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)，誘發(fā)玻璃化等毒害反應(yīng)，該配方應(yīng)用效果和適應(yīng)性有待驗(yàn)證。

本研究使用（NH4）2SO4、（NH4）3PO4和NH4Cl提供NH4+，Ca（NO3）2、Mg（NO3）2和KNO3提供NO3-，部分替換NH4NO3，重新設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，使其大量元素離子濃度與MS、ER等常用培養(yǎng)基接近，能維持組培苗正常生長(zhǎng)，應(yīng)對(duì)NH4NO3短缺對(duì)組培產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的挑戰(zhàn)，需求迫切，具備現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥劑

用于配制大量元素、鐵鹽、微量元素及有機(jī)物的藥劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?，蔗糖為食用?jí)白砂糖，卡拉膠為北京康倍斯科技有限公司生產(chǎn)。翠筠（18-18-18）水溶肥由佛山市順德區(qū)翠筠園藝有限公司生產(chǎn)，其標(biāo)識(shí)成分為：全氮18%（其中銨態(tài)氮3.6%、硝態(tài)氮5.3%）、水溶性磷18%、水溶性鉀18%、水溶氧化鎂2%。

1.1.2 培養(yǎng)材料

‘廣林9號(hào)巨尾桉、黑金剛橡膠榕、美酒白掌組培苗均為湛江市森科種苗有限公司生產(chǎn)用繼代材料，無(wú)細(xì)菌污染。

1.2 方法

1.2.1 參試材料組培方法

原始培養(yǎng)基：（1）‘廣林9號(hào)巨尾桉，增殖ER+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，生根1/2 ER+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；（2）黑金剛橡膠榕，增殖MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（3）美酒白掌，增殖MS+6-BA 1.5 mg/L，生根MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。所有培養(yǎng)基均加入卡拉膠6.5 g/L、白砂糖30 g/L，滅菌前pH調(diào)節(jié)為5.8。

培養(yǎng)環(huán)境：培養(yǎng)室光照強(qiáng)度1 600 lx、培養(yǎng)溫度（26±2）℃；煉苗間為單層遮陽(yáng)網(wǎng)大棚，遮光率40%，配備風(fēng)機(jī)水簾。

培養(yǎng)周期：‘廣林9號(hào)巨尾桉繼代增殖周期20 d，生根培養(yǎng)時(shí)間為25 d；黑金剛橡膠榕繼代增殖周期30 d，生根培養(yǎng)時(shí)間為25 d；美酒白掌繼代增殖周期30 d，生根培養(yǎng)時(shí)間為35 d。

生根苗接入標(biāo)準(zhǔn)：‘廣林9號(hào)巨尾叢生芽?jī)?nèi)高度>1.0 cm單芽可用于生根，切取長(zhǎng)度0.5 cm頂芽接種至生根培養(yǎng)基；黑金剛橡膠榕高度>2.0 cm單芽可用于生根，切取長(zhǎng)度1.2～1.5 cm頂芽接種至生根培養(yǎng)基；美酒白掌高度>2.5 cm單芽可用于生根，將單芽完整的從叢生芽分離，接種至生根培養(yǎng)基。達(dá)不到高度要求但形態(tài)完整的單芽保留在接種團(tuán)塊上用于繼代，本研究將可用于生根的單芽稱為生根芽、形態(tài)完整的后備單芽稱為后備芽。

1.2.2 SK配方

SK大量元素組成，Ca（NO3）2 494 mg/L，Mg（NO3）2 222 mg/L，（NH4）2SO4 198 mg/L，（NH4）3PO4 372 mg/L，NH4Cl 321 mg/L， KNO3 2 153 mg/L；SK微量元素、鐵鹽、有機(jī)物同MS。

1.2.3 SK適應(yīng)性測(cè)試

‘廣林9號(hào)巨尾桉增殖、黑金剛橡膠榕、美酒白掌組培苗增殖和生根培養(yǎng)均設(shè)置MS、ER、SK、SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培養(yǎng)基共4個(gè)處理，‘廣林9號(hào)巨尾桉原基本培養(yǎng)基為1/2 ER，則基本培養(yǎng)基處理大量元素均減半。各物種原有培養(yǎng)基激素、培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)周期等保持不變。

（1） 各培養(yǎng)基對(duì)參試材料增殖繼代的影響

以生產(chǎn)用繼代增殖材料，接入試驗(yàn)培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種30瓶，繼代周期完成后，選擇具備代表性的增殖材料重新轉(zhuǎn)入相同試驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行第2代培養(yǎng)，共培養(yǎng)3代。第3代繼代培養(yǎng)周期完成后觀察其增殖苗植株形態(tài)是否出現(xiàn)可見(jiàn)變化，玻璃化程度、小芽完整程度、葉片是否正常展開(kāi)。統(tǒng)計(jì)單瓶增殖苗內(nèi)生根芽及后備芽數(shù)量，測(cè)量生根芽基部莖粗及高度等指標(biāo)。

（2） 各培養(yǎng)基對(duì)參試材料生根培養(yǎng)的影響

‘廣林9號(hào)巨尾桉使用1.2.3（1）所得SK增殖試驗(yàn)苗、黑金剛橡膠榕及美酒白掌使用SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g增殖試驗(yàn)苗作為試材，接入不同生根培養(yǎng)基，使用生產(chǎn)配方接種生根苗作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種30瓶，接種10 d，剔除污染，帶瓶轉(zhuǎn)移至煉苗棚煉苗，各品種生根培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，觀測(cè)生根苗頂芽生長(zhǎng)是否正常，根系完整情況及根系質(zhì)地，測(cè)量生根苗高度、根系條數(shù)并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SK與MS、ER大量元素離子濃度比較

SK、MS及ER大量元素離子濃度見(jiàn)表1。

由表1可知：SK大量元素離子Ca22+、Mg2+、SO42-、Cl-均與MS及ER相同。SK銨態(tài)氮NH4+離子濃度為16.50 mmol/L，介于MS和ER之間，SK硝態(tài)氮NO3-離子濃度為30.28 mmol/L，低于MS和ER。SK鉀離子K+濃度為21.30 mmol/L ，與ER相同，略高于MS。SK磷酸根PO42-濃度為2.50 mmol/L，與ER相同，為MS磷酸根PO42-濃度的2倍。SK總氮素為46.78 mmol/L，SK、MS、ER總氮素比為0.78∶1∶0.81，各培養(yǎng)基NO3-/ NH4+比例均接近2∶1。

SK大量元素組成未使用NH4NO3，由（NH4）2SO4、（NH4）3PO4和NH4Cl提供NH4+， Ga（NO3）2、Mg（NO3）2和KNO3提供NO3-，部分替代了NH4NO3功能，SK大量元素離子濃度除NO3-、NH4+以外，均與MS、ER接近，總氮素與ER接近，且NO3-/NH4+比接近2∶1，符合一般富鹽培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)規(guī)律。

2.2 SK 適應(yīng)性測(cè)試

2.2.1 基本培養(yǎng)基處理對(duì)各參試物種增殖繼代培養(yǎng)的影響

基本培養(yǎng)基處理對(duì)‘廣林9號(hào)巨尾桉、黑金剛橡膠榕及美酒白掌組培苗增殖均存在影響。（1）‘廣林9號(hào)巨尾桉，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培養(yǎng)基處理，增殖苗生長(zhǎng)旺盛，組織含水量高，呈現(xiàn)輕微玻璃化，叢生芽多而葉片大，叢生芽?jī)?nèi)單芽莖干纖細(xì)。ER和SK基本培養(yǎng)基處理，苗木形態(tài)正常，充實(shí)健壯，且叢生芽?jī)?nèi)單芽質(zhì)地趨向木質(zhì)化，利于生根培養(yǎng)。（2）黑金剛橡膠榕，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培養(yǎng)基處理，叢生芽團(tuán)塊基部輕微愈傷化，增殖苗生長(zhǎng)旺盛，叢生芽?jī)?nèi)單芽莖干粗壯整齊、未見(jiàn)玻璃化、頂芽色澤和形態(tài)均正常。ER和SK基本培養(yǎng)基處理，叢生芽團(tuán)塊愈傷極少，苗木形態(tài)正常，叢生芽?jī)?nèi)單芽莖粗不均勻，部分單芽較纖細(xì)、頂芽葉片小，不能正常用于生根培養(yǎng)。（3）美酒白掌，MS及SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g基本培養(yǎng)基處理，叢生芽團(tuán)塊少量不定根發(fā)生，增殖苗生長(zhǎng)旺盛，叢生芽?jī)?nèi)單芽葉柄粗壯，葉片正常展開(kāi)、葉色濃綠未見(jiàn)玻璃化，可生根單芽矮縮莖膨大。ER和SK基本培養(yǎng)基處理，叢生芽團(tuán)塊不定根發(fā)生較多，增殖苗長(zhǎng)勢(shì)稍差，部分單芽細(xì)弱、葉片窄而狹長(zhǎng)、葉色淡綠，可生根單芽矮縮莖未見(jiàn)明顯膨大。相關(guān)指標(biāo)見(jiàn)表2。

由表2可知，（1）對(duì)‘廣林9號(hào)巨尾桉，MS處理效果與SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g處理效果類似，呈現(xiàn)后備芽多而生根芽少、生根芽纖細(xì)而高生長(zhǎng)明顯的趨勢(shì)。ER和SK培養(yǎng)基效果類似，有效生根芽數(shù)量多，而后備芽也能正常發(fā)育為有效生根芽，生根芽粗壯敦實(shí)。（2）對(duì)黑金剛橡膠榕增殖苗的影響，各處理后備芽數(shù)量、生根芽高度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。效果類似，有效生根芽數(shù)量多，單芽莖基直徑大，與ER和SK處理差異顯著，MS處理與SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g處理之間在有效生根芽數(shù)量和單芽莖基直徑上不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ER和SK處理之間亦不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（3）對(duì)美酒白掌的影響，各基本培養(yǎng)基處理后備芽數(shù)量不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ER和SK處理繼代過(guò)程中后備芽不能正常發(fā)育達(dá)到生根標(biāo)準(zhǔn)，其生根芽數(shù)量和生根芽莖基直徑均顯著小于MS與SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g處理。

2.2.2 基本培養(yǎng)基處理對(duì)各參試物種生根培養(yǎng)的影響

各基本培養(yǎng)基處理均能使各參試組培苗100%生根，且苗木生長(zhǎng)健壯，頂芽色澤及形態(tài)均正常，根系完整，主根生長(zhǎng)均勻且木質(zhì)化程度良好、側(cè)根發(fā)達(dá)，根冠比例正常。各處理相關(guān)指標(biāo)見(jiàn)表3。

由表3可知，各基本培養(yǎng)基處理對(duì)‘廣林9號(hào)巨尾桉、黑金剛橡膠榕和美酒白掌生根苗高度、生根苗莖基直徑的影響均不構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低鹽培養(yǎng)基ER和SK，生根條數(shù)優(yōu)于MS與SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g處理。

3 結(jié)論與討論

SK大量元素離子濃度設(shè)計(jì)合理，NO3-/NH4+比接近2∶1，符合一般富鹽培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)規(guī)律。在培養(yǎng)基適應(yīng)性研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，SK或SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g培養(yǎng)基，可使參試物種正常增殖繼代和生根培養(yǎng)，SK應(yīng)用效果和ER接近，SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g應(yīng)用效果同MS接近。MS為組培常用培養(yǎng)基，ER亦為經(jīng)典培養(yǎng)基，但二者均需用到NH4NO3，SK用其它藥品完全取代了NH4NO3，為應(yīng)對(duì)NH4NO3禁用對(duì)組培產(chǎn)業(yè)的影響提供了簡(jiǎn)單可行的解決方案。

諸葛強(qiáng)[7]使用將大量元素調(diào)整為NH4NO3 850 mg/L、KNO3 2 000 mg/L、KH2PO3 100 mg/L的改良MS培養(yǎng)基，對(duì)杉木、北美紅杉組培效果良好，擴(kuò)大試驗(yàn)至20余種木本植物，其改良MS培養(yǎng)基適應(yīng)性廣泛，認(rèn)為降低MS硝酸銨NH4NO3用量，對(duì)木本植物組織培養(yǎng)更為適宜。與本研究‘廣林9號(hào)巨尾桉組織培養(yǎng)中低NH4NO3培養(yǎng)基ER觀察結(jié)果類似。將SK培養(yǎng)基中2.5 mmol/L （NH4）3PO3替換為1.25 mmol/L NH4H2PO3，其大量元素離子濃度與諸葛強(qiáng)改良MS接近相同，為在SK基礎(chǔ)上配方的改良，提供了思路。

郎賢波[8]將MS氮素總量降為 30、NO3-/NH4+比接近2∶1時(shí)，可促進(jìn)馬鈴薯試管苗地上部和地下部的生長(zhǎng)；磷濃度提高為2.5 mmol/L 時(shí)，有利于馬鈴薯的增殖和地上部生長(zhǎng)，磷濃度為1.25 mmol/L時(shí)，根的生長(zhǎng)旺盛。SK相比于MS，其離子濃度變化趨勢(shì)和郎賢波對(duì)MS的改良相同，蔡茁[8]對(duì)人參組培中MS無(wú)機(jī)元素消耗率經(jīng)計(jì)算 N 為 27.16%、K 為 8.39%、P 為 78.17%，也在一定程度上反應(yīng)了MS降低總氮素濃度，提高磷濃度的可行性。

SK+翠筠（18-18-18）水溶肥0.5 g設(shè)計(jì)，在一定程度上補(bǔ)償了SK總氮素的不足，試驗(yàn)中其對(duì)黑金剛橡膠榕和美酒白掌增殖表現(xiàn)良好，效果與MS類似。翠筠（18-18-18）水溶肥中9.1%的酰胺態(tài)氮以及磷、鉀、鎂的加入，未對(duì)參試植物產(chǎn)生可見(jiàn)傷害。

本研究SK生根培養(yǎng)適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，參試生根苗，根系條數(shù)雖然出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但苗木狀態(tài)與質(zhì)量均符合生產(chǎn)需要。分析其原因，所參試培養(yǎng)基養(yǎng)分接近，而組培苗養(yǎng)分吸收、利用到產(chǎn)生質(zhì)量變化也是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程，即量變積累不足以引發(fā)質(zhì)變。

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