袁 威， 李 展， 張 平， 劉 江， 劉 君， 姚 燕， 鄧俊良

(1.畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心， 貴州 畢節(jié) 551700 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康重點實驗室 環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室， 四川 成都 611130)

1 單味中藥水提液體外抗PRRSV作用

1.1 單味中藥水提液單獨體外抗PRRSV作用 中藥含有十分復(fù)雜的化學(xué)成分，一味中藥臨床應(yīng)用多樣。研究證實，許多單味中藥水提液均有優(yōu)秀的體外抗PRRSV的作用。王學(xué)斌等[1]研究證實，板藍根水提液能較強抑制PRRSV體外增殖，對PRRSV的最小直接殺滅濃度為0.195 mg/mL，最小阻斷濃度為0.097 mg/mL；黃芪水提液對PRRSV增殖的抑制作用較弱，對PRRSV的最小直接殺滅濃度為25 mg/mL，最小阻斷濃度為12.5 mg/mL，表明黃芪和板藍根均對PRRSV有顯著的體外抑制作用。胡梅等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在安全濃度范圍內(nèi)，連翹水提液、黃芪水提液和板藍根水提液分別在0.125～0.980 mg/mL、0.975～1.960 mg/mL、和0.488～1.960 mg/mL對PRRSV的阻斷作用顯著，3種水提液分別在0.125～0.980 mg/mL、0.125～1.960 mg/mL和0.488～1.960 mg/mL對PRRSV的抑制作用顯著；板藍根水提液在0.488～1.960 mg/mL對PRRSV具有顯著的殺滅作用。李丹等[3]研究黃芪、板藍根、甘草、山楂、魚腥草和青蒿6種中藥水提液在細胞安全濃度范圍內(nèi)抑制PRRSV感染細胞的作用時發(fā)現(xiàn)，先加中藥后接種病毒時，各中藥濃度分別在3.125～12.5 mg/mL、0.391～3.125 mg/mL、0.391 mg/mL、0.782～3.125 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL能顯著(P<0.05)保護細胞；先接種病毒后加中藥時，各中藥濃度在3.125～12.5 mg/mL、1.562～3.125 mg/mL、0.391～1.562 mg/mL、0.391～3.125 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL、0.196～3.1254 mg/mL均能顯著抑制病毒增殖(P<0.05)；中藥和病毒體外作用后加入時，板藍根濃度在1.562～3.125 mg/mL、甘草濃度在0.782 mg/mL對細胞的保護作用達到顯著水平(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，6種中藥對病毒感染細胞均有一定的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系，其中阻斷病毒吸附和進入細胞作用均顯著；而魚腥草抑制病毒的合成及釋放作用較為穩(wěn)定，板藍根在1.562 mg/mL、3.125 mg/mL保護率最高；藥物對病毒的直接殺滅作用較弱，其中板藍根在1.562 mg/mL、3.125 mg/mL的作用比較明顯。曾強等[4,5]研究板藍根、甘草、魚腥草的水提液發(fā)現(xiàn)，板藍根粗提物對PRRSV和PRRSV PX株阻斷的最佳質(zhì)量濃度均為3.125 mg/mL，抑制PRRSV和PRRSV PX株的最佳質(zhì)量濃度分別為3.125 mg/mL和1.563 mg/mL，直接滅活PRRSV和PRRSV PX株的最佳質(zhì)量濃度分別為1.563 mg/mL和0.782 mg/mL；甘草粗提物阻斷PRRSV和PRRSV PX株的最佳質(zhì)量濃度分別為0.391 mg/mL和3.125 mg/mL，抑制PRRSV和PRRSV PX株的最佳質(zhì)量濃度為分別0.782 mg/mL和0.391 mg/mL，直接滅活PRRSV和PRRSV PX株的最佳質(zhì)量濃度均為0.782 mg/mL；魚腥草粗提物質(zhì)量濃度為0.782 mg/mL時，阻斷、抑制PRRSV和PRRSV PX株感染效果最好，無直接滅活作用。劉櫻等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、板藍根及青蒿這3種水提液中黃芪水提液對PRRSV感染Marc-145細胞的阻斷作用最強；同時黃芪水提液對PRRSV的直接殺滅作用保護率為100%，且非常穩(wěn)定；青蒿水提液在濃度較高時還有促進細胞生長的作用，但穩(wěn)定性差，隨濃度降低其保護率迅速下降；在對病毒的抑制作用試驗中發(fā)現(xiàn)這3種水提液細胞保護率都能達到100%，甚至以上。田朝暉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿水提液在不同濃度(1、2、4、6 μg/mL)作用下，青蒿水提液抑制 PRRSV所導(dǎo)致的細胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好，同時還能有效降低 PRRS病毒復(fù)制與抑制病毒導(dǎo)致細胞變性效果。趙鳳柱等[8]報道，黃芩具有體外抗PRRSV的作用。徐端紅等[9]制備莪術(shù)油觀察在體外細胞上對PRRSV的作用效果發(fā)現(xiàn)，自最大安全濃度作倍比稀釋后，莪術(shù)油注射液對PRRSV具有一定的抑制、殺滅和阻斷作用，其中對PRRSV的殺滅作用較為突出。

1.2 單味中藥水提液聯(lián)合作用體外抗PRRSV作用 王學(xué)斌等[1]研究發(fā)現(xiàn)，板藍根水提液和黃芪水提液混合后對PRRSV的體外抑制作用顯著增強，混合水提液對PRRSV的最小直接殺滅濃度降為0.097 mg/mL，最小阻斷濃度降為0.049 mg/mL，且對PRRSV致CPE抑制作用明顯優(yōu)于單味水提液。表明板藍根、黃芪兩種水提液體外聯(lián)合使用對PRRSV具有較強的協(xié)同抑制作用，且能明顯降低聯(lián)合使用時各自對PRRSV的有效濃度。梅春升[10]研究證實，黃芪、黃芩和板藍根與重組PoIFN-γ聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同抑制PRRSV作用，當0.030 mg/mL的黃芪、0.033 mg/mL的黃芩、0.173 mg/mL的板藍根分別與25.84 IU/mL、27.7 IU/mL、28.22 IU/mL的重組poIFN-γ聯(lián)合應(yīng)用時，即可達到50%的病毒抑制率。聯(lián)合用藥降低了單味藥物的用量，也提高了藥物的抗病毒療效。

由此得出，許多單味中藥水提液在安全濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出體外抗PRRSV的作用，并在一定濃度范圍內(nèi)呈一定的量效關(guān)系，其中以板藍根水提液體外抗PRRSV作用較為突出，且多種中藥水提液之間、中藥水提液與γ干擾素之間聯(lián)合應(yīng)用體外抗PRRSV具有較強的協(xié)同作用，且能降低單味藥物的用量，提高藥物的抗PRRSV效果。

2 中藥單體體外抗PRRSV作用

2.1 金銀花單體 王學(xué)兵等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在安全濃度范圍內(nèi)，金銀花有效成分綠原酸對PRRSV具有顯著的體外抑制和阻斷作用，其對PRRSV的最小阻斷濃度為0.097 7 μg/mL，最小抑制濃度為0.391 μg/mL，且阻斷作用優(yōu)于抑制作用，可知綠原酸在病毒生長早期起到明顯預(yù)防病毒感染的作用。Cheng等[12]發(fā)現(xiàn)，綠原酸和黃芩素對PRRSV達到50%有效率的濃度分別為270.8 μg/mL±14.6 μg/mL和28.21 μg/mL±26.0 μg/mL，選擇指數(shù)分別大于5.54和35.5，能抑制PRRSV的復(fù)制或直接殺滅PRRSV，在最大無毒濃度時對PRRSV的抑制率分別達到90.8%和61.1%，而對病毒的吸附?jīng)]有作用。陳鋒等[13]、劉利青等[14]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花和金銀花枝葉提取物均具有良好的體外抗PRRSV活性，金銀花提取物大孔樹脂60%乙醇水洗脫部位在6.25 μg/mL～1.0 mg/mL對PRRSV具有良好的體外抑制作用；金銀花枝葉提取物60%乙醇水洗脫部位對PRRSV感染細胞的最小保護濃度為6.25 μg/mL，60%乙醇水洗脫部位使PRRSV病毒滴度從105.8TCID50降低至100.3TCID50左右；同時發(fā)現(xiàn)綠原酸和蘆丁的標準品對PRRSV的增殖和ORF1 mRNA的表達均沒有抑制作用。因此表明金銀花60%乙醇水洗脫部位的抗PRRSV的活性應(yīng)該是其他的未知物質(zhì)或者是多種化學(xué)成分共同發(fā)揮作用。綠原酸在最大安全濃度為500 μg/mL下可使Marc-145細胞免受PRRSV的侵染，同時明顯降低凋亡細胞的數(shù)量[15]。綠原酸在最大安全濃度為250 μg/mL下能夠有效增強3D4/2細胞的吞噬能力，増強TNF-α和IL-6的分泌同時抑制IL-10的分泌，抑制由PRRSV引起的3D4/2細胞凋亡[16]。

2.2 黃芪單體 胡梅等[2]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在0.010 mg/mL～0.073 mg/mL對PRRSV具有顯著的阻斷和抑制作用。張紅英[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對PRRSV感染具有顯著的阻斷作用(0.391 mg/mL～0.049 mg/mL)，在較高濃度(0.196 mg/mL～0.391 mg/mL)時具有顯著的直接殺滅作用(P<0.05)。王愛萍等[18]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖分別在0.078 mg/mL～1.25 mg/mL和0.156 mg/mL～1.25 mg/mL時體外對PRRSV具有明顯的阻斷和抑制作用，在1.25 mg/mL時體外對PRRSV具有一定的殺滅作用。劉櫻等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在濃度為0.32 mg/mL時對PRRSV直接殺滅作用保護率為20%左右，黃芪多糖濃度為0.01 mg/mL時對細胞的保護率為24.30%。黃芪多糖在不同濃度(1、2、4、6 μg/mL)作用下抑制 PRRSV所導(dǎo)致的細胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好[7]。

2.3 板藍根單體 張紅英[17]研究發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖對PRRSV感染具有顯著的阻斷作用(0.024 mg/mL～0.196 mg/mL)和直接殺滅作用(0.048 mg/mL～0.196 mg/mL)(P<0.05)。王學(xué)兵等[19]研究發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖體外對PRRSV具有較好的阻斷和抑制作用，其最小阻斷濃度為2.094 μg/mL，最小抑制濃度為8.375 μg/mL。Wei等[20]發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖對PRRSV感染Mrc-145細胞的抑制作用呈劑量依賴性(10 mg/mL～80 μg/mL)，其中80 μg/mL板藍根多糖處理后對PRRSV增殖抑制率將近99%；當40 μg/mL板藍根多糖添加到PRRSV感染Mrc-145細胞前(6 h和3 h)、感染后(3 h和6 h)或與PRRSV同時添加發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖與PRRSV同時添加時能顯著降低PRRSV滴度(P<0.05)，感染前添加效果也優(yōu)于感染后添加，但是效果均不顯著(P>0.05)；當板藍根多糖與PRRSV直接作用后發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖能直接殺滅PRRSV，呈劑量依賴性，并在20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL時達到顯著水平(P<0.05)；Mrc-145細胞感染PRRSV 1 h后添加板藍根多糖處理4 h，24 h后檢測發(fā)現(xiàn)病毒mRNA和蛋白質(zhì)含量均呈劑量依賴性降低，其中80 μg/mL板藍根多糖處理后病毒mRNA和蛋白質(zhì)分別降低了57.6%和89%。劉櫻等[6]研究發(fā)現(xiàn)，板藍根多糖對PRRSV的阻斷作用最強，在濃度為0.031 mg/mL時，對細胞保護率能達到48.03%；在濃度為0.01 mg/mL時，對細胞的保護率為24.57%。板藍根多糖在不同濃度(1、2、4、6 μg/mL)作用下抑制 PRRSV所導(dǎo)致的細胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好，同時還具有一定的減少病毒造成細胞病變的作用[7]。

2.4 其他中藥單體 張鳳英等[21]報道，黃芩莖葉提取物干擾PRRSV在Marc-145細胞中增殖。張道廣等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩多糖顯示細胞水平抑制PRRSV增殖作用。張紅英[27]研究發(fā)現(xiàn)，山藥多糖在高濃度區(qū)(0.098 mg/mL～0.196 mg/mL)可以有效阻斷PRRSV對細胞的感染作用。蒲秀英等[23]在貫葉連翹中提取的金絲桃素體外抗H-PRRSV活性的研究中發(fā)現(xiàn)，在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(H-PRRSV)感染的同時加入金絲桃素，其細胞存活率和對H-PRRSV的抑制率略有升高，與H-PRRSV對照組和拉米夫定對照組相比均有顯著性差異；在H-PRRSV感染前和感染后加入金絲桃素，其細胞存活率和對PRRSV的抑制率明顯升高，且隨藥物濃度的增加而上升。吳瑗等[24]發(fā)現(xiàn)，蘆薈多糖在0.049mg/mL～0.391 mg/mL和0.196mg/mL～0.391 mg/mL對PRRSV有顯著的阻斷和直接殺滅作用(P<0.05)。Liu等[25]體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖分別在0.488 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.977 μg/mL對PRRSV有顯著的抑制作用(P<0.05)，在0.488 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.488 μg/mL對PRRSV有顯著的阻斷作用(P<0.05)，在0.977 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.488 μg/mL對PRRSV有顯著的直接殺滅作用(P<0.05)，且硫酸化牛膝多糖的體外抗PRRSV活性均優(yōu)于牛膝多糖，說明牛膝多糖經(jīng)過硫酸化能提高其抗PRRSV活性。Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，粗莖鱗毛蕨(又稱綿馬鱗毛蕨)提取物黃綿馬酸AB能通過抑制PRRSV對Mrc-145細胞的吸附、PRRSV的核酸注入、PRRSV核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯、PRRSV釋放及誘導(dǎo)抗病毒細胞因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的表達等多途徑抑制PRRSV增殖。賀晶晶等[27]研究表明，花椒、沉香、衛(wèi)矛和青黛4種中藥的提取物在一定濃度范圍內(nèi)對PRRSV致Marc-145細胞CPE有明顯抑制作用，其中衛(wèi)矛提取物抑制作用最明顯，這4種提取物分別在291.2 μg/mL～582.4 μg/mL、89.8 μg/mL～179.7 μg/mL、320.3 μg/mL～640.6 μg/mL和3 381.3 μg/mL顯著抑制PRRSVORF7基因表達(P<0.05)。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，乙?；鶋A和蒼術(shù)素醇對PRRSV有顯著的抑制作用，其IC50分別為7.9 μmol/L和39.4 μmol/L，并呈劑量依賴性明顯減弱ORF7基因的表達。陳志勝等[29]體外試驗發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯在0.04 mg/mL～0.16 mg/mL能100%抑制PRRSV增殖，在0.02 mg/mL～0.16 mg/mL能100%直接殺滅PRRSV；蘆根多糖在0.575 mg/mL時能100%保護細胞，阻斷PRRSV吸附，在0.144 mg/mL～0.575 mg/mL能顯著抑制PRRSV的增殖，在0.072 mg/mL～0.575 mg/mL能100%直接殺滅PRRSV；夏枯草多糖在0.070 mg/mL～1.125 mg/mL能100%阻斷PRRSV對細胞的吸附，而抑制和直接殺滅作用較弱。劉櫻等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素在濃度為0.32 mg/mL時對PRRSV直接殺滅作用保護率都是20%左右；在對病毒的抑制作用試驗中，青蒿素濃度為0.01 mg/mL時對細胞的保護率為26.20%。張玲等[30]以山豆根多糖作用于PRRSV體外感染8 h的RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL～400 μg/mL山豆根多糖能極顯著升高PRRSV感染RAW264.7細胞存活率，有效降低PRRSV感染RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平，從而有效干預(yù)PRRSV感染免疫細胞的炎性反應(yīng)。表告依春在濃度為500 μg/mL時可使Marc-145細胞免受PRRSV的侵染，同時明顯降低凋亡細胞的數(shù)量，而淫羊霍苷在濃度為31.25 μg/mL時不能完全防止PRRSV侵染Marc-145細胞，但可以減少受病毒侵染的細胞數(shù)目，并起到一定抑制細胞調(diào)亡的作用[15]。連翹酯苷A和表告依春分別在濃度為125 μg/mL、1 000 μg/mL下均能夠有效增強3D4/2細胞的吞噬能力，増強TNF-α和IL-6的分泌，同時抑制IL-10的分泌，抑制由PRRSV引起的3D4/2細胞調(diào)亡[16]。吳倩倩[31]研究發(fā)現(xiàn)，在感染后48 h，原花青素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在5 μg/mL～40 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地顯著抑制PRRSV的增殖，在感染后6～48 h內(nèi)的不同時間點，40 μg/mL的原花青素和EGCG均能有效抑制PRRSV的NSP9 mRNA和N蛋白的合成；原花青素和EGCG在5～40 μg/mL濃度范圍對PRRSV的吸附、內(nèi)化和釋放的過程有明顯的抑制效果，且呈劑量依賴性；而40 μg/mL的原花青素和EGCG對PRRSV的合成和組裝階段有顯著的抑制作用；將藥物與PRRSV直接作用發(fā)現(xiàn)，5～40 μg/mL的原花青素和EGCG均能使PRRSV感染Marc-145細胞的能力呈劑量依賴性下降。

由此得出，許多中藥單體在安全濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出多途徑體外抗PRRSV或PRRSV PX株作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性增強，中藥單體經(jīng)工藝修飾可提高其體外抗PRRSV效果。

3 復(fù)方中藥水提液體外抗PRRSV作用

同樣，有研究表明，復(fù)方中藥對PRRSV有良好的體外抑制作用。沈國權(quán)等[32]采用細胞培養(yǎng)的方法測定了自擬藥方抗病毒合劑(虎杖、女貞子、杠板歸等10味中藥組成)抵抗PRRSV感染細胞的作用。在46.88 μg/mL～6 000 μg/mL范圍內(nèi)對PRRSV的阻斷作用顯著，以93.75 μg/mL的作用最佳；在375 μg/mL～6 000 μg/mL范圍內(nèi)對抑制作用顯著，以3 000 μg/mL的作用最佳；在46.88 μg/mL-6 000 μg/mL范圍內(nèi)對PRRSV的直接殺滅作用效果顯著，以6 000 μg/mL最佳，表明抗病毒合劑具有較強的體外抗PRRSV作用，并呈一定的量效關(guān)系。顧文松等[33]將虎杖、女貞子、杠板歸等中藥提取物添加到細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)Marc-145細胞發(fā)現(xiàn)，在19.53 μg/mL～2 500 μg/mL范圍內(nèi)對PRRSV的阻斷作用顯著，其中39.06 μg/mL作用效果最好；在156.25 μg/mL～2 500 μg/mL范圍內(nèi)對PRRSV的抑制作用顯著，以1 250 μg/mL效果最佳；在19.53 μg/mL～2 500 μg/mL范圍內(nèi)對PRRSV的直接殺滅作用效果顯著，以2 500 μg/mL效果最好，表明中藥提取物對細胞抵抗PRRSV感染有較強的作用，并呈一定的量效關(guān)系。吳金梅等[34]用柴胡解毒注射液體外培養(yǎng)Marc-145細胞發(fā)現(xiàn)，自最大安全濃度作倍比稀釋后，柴胡解毒注射液對PRRSV均具有一定的抑制、殺滅和阻斷作用，其中在55 μg/mL～7 000 μg/mL和220 μg/mL～7 000 μg/mL分別對PRRSV抑制和殺滅作用較為顯著。李雪等[35]將圓藍瘟毒康注射液和玉屏風(fēng)散提取液體外培養(yǎng)Marc-145細胞后發(fā)現(xiàn)，兩種中藥復(fù)方對PRRSV感染均有顯著的抗吸附作用，能夠抑制病毒感染。趙翠莉[36]研究發(fā)現(xiàn)，2.0 mg/mL的千世楊(黃芪、黃連、黃芩、茶多酚、姬松茸多糖等20余種中藥組合而成)提取物與PRRSV等量混合，37 ℃作用1 h可以將病毒殺滅，即2.0 mg/mL的千世楊提取物有較好的體外抗PRRSV作用。

由此得出，復(fù)方中藥水提液在安全濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出體外抗PRRSV的作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性增強，復(fù)方中藥水提液對PRRSV的阻斷作用較抑制和殺滅作用強，阻斷濃度范圍更廣。

4 總結(jié)

綜上所述，無論是單味中藥水提液、中藥單體，還是復(fù)方中藥水提液在安全濃度范圍內(nèi)均能表現(xiàn)出良好的體外抗PRRSV或PRRSV PX作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性增強，不同中藥種類、同一中藥不同成分等均有不同的體外抗PRRSV作用，不同中藥聯(lián)合使用、同一中藥經(jīng)工藝修飾均能增強體外抗PRRSV作用。目前有關(guān)中藥體外抗PRRSV的研究還有待加強，特別是中藥體外抗PRRSV的作用機制，研究出更好的體外抗PRRSV中藥，為更早投入臨床應(yīng)用提供依據(jù)。